1.1 Einführung in die Problematik Zielsetzung 9

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1 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Einführung in die Problematik Zielsetzung 9 2. Material und Methoden 2.1 Material Chemikalien Materialien für die Säulenchromatographie Proteine, Antikörper und Testsysteme Verbrauchsmaterial Geräte Zellkulturmedien Kultivierte Zellen Versuchstiere Lösungen und Puffer häufig verwendete Puffer Puffer für die Säulenchromatographie Färbelösungen Lösungen für den CTLL-2-Proliferationstest Lösungen für den IL2-Sandwich-ELISA Puffer und Lösungen für die immunhistologischen Färbungen Methoden Zellkultur Kultivierung von Zellen Bestimmung der Zelldichte Einfrieren und Auftauen von Zellen Isolierung von Antikörpern mittels Fast Protein Liquid Chromatographie (FPLC) Konzentrierung von miniperm TM -Überständen Gelfiltrations-Säulenchromatographie Anionenaustausch-Chromatographie Bestimmung der Konzentration von gereinigten Antikörpern Konjugation von Proteinen mit Fluorochromen oder Biotin 22

2 Markierung von Antikörpern mit Fluoreszein Biotinylierung von Antikörpern Markierung von Proteinen mit Texas Red Markierung von Zellen und Liposomen mit Fluorochromen Markierung von Zellen mit CFSE Markierung von Zellen mit PKH Markierung von Liposomen mit dem lipophilen Fluorochrom CM -DiI Herstellung von Leukozytensuspensionen Isolierung von Leukozyten aus Lymphorganen Isolierung von Zellen aus subkutanen Inokula Verfahren zur Anreicherung von Leukozyten-Subpopulationen Erythrozyten-Lyse Anreicherung von mononukleären Zellen durch Zentrifugation mit Lympholyt M Anreicherung von B-Lymphozyten durch Elimination von T-Lymphozyten durch Antikörper und Komplement Anreicherung von T-Zellen durch Passage durch Nylonwoll-Säulen Depletion von B-Lymphozyten aus Zellsuspensionen durch Panning Histologische Techniken Einfrieren von Geweben zur Erstellung von Kryostatschnitten H&E-Färbung Histochemischer Nachweis von Aluminiumhydroxid im Gewebe Immunhistologische Färbemethoden Indirekte Immunfluoreszenz Nachweis biotinylierter Antikörper durch Streptavidin konjugierte alkalische Phosphatase Nachweis biotinylierter Antikörper durch die ABC -Methode Direkte Immunfluoreszenz auf Gewebeschnitten Immunfluoreszenz von Zellsuspensionen Nachweis von apoptotischen Tumorzellen durch Annexin V und Propidiumiodid Nachweis von apoptotic bodies Methoden zur Ermittlung von Zytokin-Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten Sandwich-ELISA zur Bestimmung der Konzentration von rhuil CTLL-2-Proliferationstest zur Bestimmung der Konzentration von IL-2 40

3 Cytometric Bead Array (CBA) zur Bestimmung der Konzentration von Zytokinen Durchflußzytometrie Mikrofotografie Herstellung von Depot-Zytokinen und Tumorvakzinen Herstellung von Liposomen unter Verwendung von Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) Adsorption von IL-2 an Latex-Beads Adsorption von Proteinen an Aluminiumhydroxid Herstellung von Tumorvakzine Adoptiver Transfer von Lymphozyten-Suspensionen Statistische Analyse von Überlebenskurven Ergebnisse 3.1 Untersuchung der Reaktionen des Immunsystems auf Zytokine in Depot-Form Phagozytose von Depot-Materialien Nachweis von rhuil-2 in Phagozyten der Bauchhöhle Untersuchung der Freisetzung von IL-2 aus phagozytierten Zytokin enthaltenden Depot-Materialien Nachweis von IL-2 in der Milz nach Injektion von Zytokinen in Depot-Form Histologische Untersuchung der Milz nach Injektion von IL-2 gefüllten Liposomen Untersuchung der Apoptose von bestrahlten Tumorzellen Untersuchung der immunologischen Vorgänge nach intraperitonealer Vakzinierung Untersuchung der Infiltration in die Bauchhöhle nach der Injektion von Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL-2 und B16-Zellen Untersuchung des Omentum majus nach der Injektion von Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL Untersuchung der immunologischen Vorgänge nach subkutaner Immunisierung Untersuchung der subkutanen Inokulationsstelle von Zytokin-Depot-Tumorvakzinen Untersuchung der Zusammensetzung des zellulären Infiltrats, dass durch aus dem Depot freigesetztes IL-2 induziert wird 77

4 3.4.3 Untersuchung der Phagozytose von Tumorzellfragmenten Untersuchung der regionalen Lymphknoten nach Injektion von Tumorvakzinen, die PKH-2-markierte Tumorzellen enthalten Verteilung von Graphit-Partikeln nach subkutaner Injektion Durchflußzytometrischer und Fluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Tumorzellfragmenten in Lymphozyten des Lymphknotens Untersuchung der Antigen-Dichte im Lymphknoten von Mäusen nach Injektion von Zytokin-Depot-Tumorvakzinen Untersuchung der Lymphozyten-Populationen im Lymphknoten nach Vakzinierung mit bestrahlten B16-Zellen und IL-2-Alu Untersuchung der Lymphozyten-Populationen im Lymphknoten nach Vakzinierung mit bestrahlten RenCa-Zellen und IL-2-Alu Untersuchung der lokalen Wirkung von GM-CSF und IL-4 in Depot-Form Untersuchung der Reaktionen im Lymphknoten nach Vakzinierung mit Tumorzellen und GM-CSF in Depot-Form Vergleich der lokalen Reaktion des Immunsystems auf die Injektion von Aluminiumhydroxid-adsorbiertem GM-CSF oder 108 Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL Untersuchung der Aktivierung von Antigenpräsentierenden Zellen durch Zytokin-Depot-Tumorvakzinen Untersuchung der Expression von MHCII- und B7-2-Molekülen in vitro Untersuchung der Expression von MHCII-Molekülen in vivo Untersuchung der Induktion von sekundären Zytokinen nach Injektion von Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL Untersuchung der Effektormechanismen, die an der Abstoßung von Tumorzellen beteiligt sind Untersuchung der T-Lymphozyten-vermittelten Immunantwort Reinigung von T-Lymphozyten Adoptiver Transfer von T-Lymphozyten zur Erzeugung prophylaktischer Immunität gegen RenCa Tumore In vivo Depletion von T-Lymphozyten-Subpopulation zur Charakterisierung der Immunantwort gegen RenCa-Zellen Untersuchung der B-Lymphozyten-vermittelten Immunantwort Eliminierung von T-Lymphozyten durch monoklonale Antikörper und Komplement Adoptiver Transfer von B-Lymphozyten zur Erzeugung von prophylaktischer Immunität gegen RenCa Tumore 122

5 Adoptiver Transfer von Immunserum zur Erzeugung von prophylaktischer Immunität gegen RenCa Tumore Diskussion 4.1 Zytokine in Depot-Form als Transportmittel für Zytokine zu den Lymphorganen Untersuchungen zur Apoptose von bestrahlten Tumorzellen Untersuchungen zur intraperitonealen Vakzinierung mit Tumorzellen und Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL Untersuchung der Reaktionen des Immunsystems nach subkutaner Vakzinierung Untersuchung der Lymphknoten nach Vakzinierung mit bestrahlten Tumorzellen und Aluminiumhydroxid-adsorbiertem IL Untersuchung der Wirkung von Aluminiumhydroxid-adsorbiertem GM-CSF und IL-4 auf das Immunsystem von Mäusen Vergleich der Wirkung von GM-CSF-Alu mit IL-2-Alu auf das Immunsystem von Mäusen Untersuchung der IL-2-induzierten Synthese von Zytokinen durch inflammatorische Zellen Untersuchung der Effektormechanismen der anti-tumor-immunantwort Zusammenfassung Literaturverzeichnis 153

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