peqgold Mycobacteria DNA Kit

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1 Arbeitsanleitung Instruction Manual peqgold Mycobacteria DNA Kit (Safety-Line) V0815

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3 INHALT EINLEITUNG 1 FUNKTIONSPRINZIP 1 KIT BESTANDTEILE 2 LAGERUNG 2 BINDEKAPAZITÄT 2 WICHTIGE HINWEISE 3 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE 4 PEQGOLD MYCOBACTERIA DNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 6 A. Isolation von mykobakterieller DNA aus Sputum Proben 6 B. Isolation von mykobakterieller DNA aus Sputum Proben größeren Volumens (bis zu 5 ml) 8 C. Isolation von mykobakterieller DNA aus bronchoalveolärer Lavage (Luftröhrenspülung) 10 D. Isolation von mykobakterieller DNA aus Gewebebiopsien ( z.b. Lymphknoten) 12 AUFKONZENTRIERUNG DER DNA 14 QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA 14 BESTELLINFORMATIONEN 15 TROUBLESHOOTING TIPS 16 CONTENT INTRODUCTION 18 THEORY 18 KIT COMPONENTS 19 STORAGE AND STABILITY 19 BINDING CAPACITY 19 BEFORE STARTING 20 DANGEROUS COMPONENTS 21 PEQGOLD MYCOBACTERIA DNA ISOLATION PROTOCOL 23 A. Isolation of mycobacterial DNA from Sputum samples (200 µl) 23 B. Isolation of mycobacterial DNA from larger volume of sputum samples (up to 5 ml) 25 C. Isolation of mycobacterial DNA from bronchoalveolar lavage sample 27 D. Isolation of mycobacterial DNA from tissue biopsies (e.g. lymph nodes) 29 CONCENTRATING THE DNA 31 QUANTITATION AND STORAGE OF DNA 31 ORDERING INFORMATION 32 TROUBLESHOOTING TIPS 33 APPENDIX 36

4 EINLEITUNG Der peqgold Mycobacteria DNA Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um gezielt hochwertige mykobakterielle DNA aus Sputum, bronchoalveolären Lavagen oder Gewebeproben (z. B. Lymphknoten usw.) zu isolieren. In weniger als 2 Stunden gestattet er die Bearbeitung einzelner oder zahlreicher Proben, wobei jeweils bis zu 30 µg DNA isoliert werden können. Arbeitsaufwendige Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, wie Phenol oder Chloroform, müssen ebenso wenig durchgeführt werden, wie Fällungen mit Isopropanol oder Ethanol oder zeitaufwendige CsCl-Dichtegradientenzentrifugationen. Enzyminhibitoren und sonstige Kontaminationen werden vollständig entfernt. Mykobakterien-DNA, die mit dem peqgold Mycobacteria DNA Kit isoliert wurde, kann für alle Arten von Folgeexperimenten, wie PCR, RFLP-Analysen oder Southern Blotting weiterverwendet werden. FUNKTIONSPRINZIP Der peqgold Mycobacteria DNA Kit kombiniert die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell entwickeltes und optimiertes Puffersystem erlaubt die Reinigung von bis zu 30 µg DNA mit Moleküllängen bis 60 kbp. Das Extraktionsverfahren beinhaltet hierbei die Vorbehandlung der Probe mit N-Acetyl- Cystein und den nachfolgenden Verdau mit Lysozym und Proteinase K. Das Lysat wird auf eine PerfectBind DNA Column geladen, in der die DNA-Moleküle an die darin enthaltene Silikamembran binden. Zellulärer Debris, Salze und andere Kontaminationen können durch zwei kurze Waschschritte mit speziellen Puffern schnell und effizient entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige DNA wird abschließend in Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser eluiert. peqgold Bacterial DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 1

5 KIT BESTANDTEILE peqgold Mycobacteria DNA Kits 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen Bestellnummer Bestandteile PerfectBind Columns ml Collection Tubes NAC Buffer 1.5 ml 15 ml 60 ml DNA Lysis Buffer TB 1.5 ml 20 ml 60 ml DNA Binding Buffer TB 2 x 1.5 ml 25 ml 100 ml DNA Wash Buffer TB I 2 x 1.5 ml 30 ml 125 ml (Konz.) (konz.) DNA Wash Buffer TB II 1.5 ml 15 ml 48 ml (Konz.) (konz.) Elution Buffer 1 ml 5 ml 20 ml Lysozym 5 mg 50 mg 200 mg Proteinase K 3 mg 30 mg 120 mg 10 mm TE Buffer 2 ml 20 ml 80 ml Arbeitsanleitung LAGERUNG Bitte lagern Sie ungelöste Proteinase K und Lysozym kühl und trocken bei 4 C oder 20 C. Gelöste Proteinase K sowie Lysozym sollte aliquotiert und bei 20 C gelagert werden. Die Aufbewahrung der übrigen Kitkomponenten sollte bei Raumtemperatur (20 bis 25 C) erfolgen, so bleiben sie für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oder Lagerung im DNA Binding Buffer TB bilden, können durch Erwärmen auf 37 C wieder gelöst werden. BINDEKAPAZITÄT Die Bindekapazität der PerfectBind DNA Column beträgt rund 30 µg DNA. Es sollten nicht mehr als die angegebenen Mengen an Ausgangsmaterial eingesetzt werden. peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 2

6 WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit.! DNA Binding Buffer TB enthält ein chaotropes Salz. Bei seiner Verwendung sollten deshalb Handschuhe und eine Schutzbrille getragen werden.! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im DNA Binding Buffer TB zur Bildung von Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendung des Puffers durch Erwärmen auf 37 C rückgängig gemacht werden.! DNA Wash Buffer TB II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: Kit ml DNA Wash Buffer TB II mit 3.5 ml EtOH ( %). Kit ml DNA Wash Buffer TB II mit 35 ml EtOH ( %). Kit ml DNA Wash Buffer TB II mit 112 ml EtOH ( %).! Proteinase K wird als Pulver geliefert und muss vor ihrer ersten Verwendung durch Vortexen in TE Buffer gelöst werden: Kit Kit Kit mg Proteinase K in 150 µl TE Buffer lösen. 30 mg Proteinase K in 1.5 ml TE Buffer lösen. 120 mg Proteinase K in 6 ml TE Buffer lösen. Gelöste Proteinase K sollte aliquotiert bei 20 C gelagert und bei Bedarf frisch aufgetaut werden.! Lysozym Stammlösung (10 mg/ml) mit TE-Buffer ansetzen. Kit Kit Kit mg Lysozym in 500 µl TE Buffer lösen. 50 mg Lysozym in 5 ml TE Buffer lösen. 200 mg Lysozym in 20 ml TE Buffer lösen. Gelöstes Lysozym sollte aliquotiert bei 20 C gelagert und bei Bedarf frisch aufgetaut werden.! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei C ausgeführt werden. peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 3

7 GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE peqgold Mycobacteria DNA Kit Bestandteile PerfectBind Columns 2.0 ml Collection Tubes NAC Buffer Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze DANGER sodium hydroxide 2-2.5%, CAS: H314, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 DNA Lysis Buffer TB DNA Binding Buffer TB --- (not necessary) sodium dodecyl sulphate 1-2.5%, CAS: DANGER propan-2-ol %, polyethylene glycol octylphenol ether 25-50%, CAS: , (not necessary) H225, H318, H336, P101, P102, P103, P210, P261, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 DNA Wash Buffer TB I (Konz.) (konz.) DNA Wash Buffer TB II (Konz.) (konz.) Elution Buffer Lysozym Proteinase K DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P (not necessary) Lysozyme (Powder), CAS_ DANGER Proteinase, Tritirachium album serine %, CAS: (not necessary) H319, H335, H315, H334, P280, P285, P305+P351+P338, P309+P mm TE Buffer peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 4

8 H- und P-Sätze Erläuterungen H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H315 H318 H225 H319 H334 H335 H336 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P261 P280 P285 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P309+P311 P405 P501 Verursacht Hautreizungen. Verursacht schwere Augenschäden. Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar. Verursacht schwere Augenreizung. Kann bei Einatmen Allergie, asthmaartige Symptome oder Atembeschwerden verursachen. Kann die Atemwege reizen. Kann Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen. Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen. Explosionsgeschützte elektrische Geräte/Lüftungsanlagen/ Beleuchtungsanlagen/... verwenden. Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Einatmen von Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol vermeiden. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. Bei unzureichender Lüftung Atemschutz tragen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen/duschen. BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Bei Exposition oder Unwohlsein: Giftinformationszentrum, Arzt oder anrufen. Unter Verschluss aufbewahren. Inhalt/Behälter zuführen. peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 5

9 PEQGOLD MYCOBACTERIA DNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE A. Isolation von mykobakterieller DNA aus Sputum Proben Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! Schüttelwasserbad oder Thermomixer vorgewärmt auf 37 C; auf 50 C und auf 95 C! 100 % Ethanol! Steriles, deionisiertes Wasser (optional)! Sterile DNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen! Elution Buffer bei 50 C vorwärmen 1. Isolierung der Bakterien Vorsicht im Umgang mit Mykobakterien; Infektionsgefahr! 200 µl Sputum in ein 1.5 ml Reaktiongefäß pipettieren und 200 µl NAC Puffer hinzufügen. Kurz vortexen und Ansatz unter kontinuierlichem Schütteln bei RT für 20 min inkubieren. Wenn kein Thermomixer verfügbar ist, den Ansatz während der Inkubationszeit 3 4 x kurz vortexen. Ansatz bei 8000 x g * (~ rpm) für 15 min zentrifugieren. Überstand sorgfältig, aber vollständig abnehmen. Pellet nicht verwerfen! 2. Zellwandverdau und Lyse Bakterielles Pellet in 200 µl TE Puffer resupendieren. 15 µl Lysozym hinzupipettieren und für 5 s vortexen. Ansatz bei 37 C für 30 min unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren. Anmerkung: Dauer der Lyse kann verlängert werden. Nach Zugabe von 200 µl DNA Lysis Buffer TB den Ansatz für 20 min bei 95 C inkubieren und danach für 2 min auf Eis stellen. Zugabe von 25 µl Proteinase K und Inkubation bei 50 C für 30 min unter kontinuierlichem Schütteln. 3. Laden und Binden 400 µl DNA Binding Buffer TB zugeben und durch Vortexen oder Pipettieren sorgfältig mischen. Eine PerfectBind DNA Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und 600 µl auf die PerfectBind DNA Column laden. Den Deckel schließen und für 2 Minuten bei x g* peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 6

10 zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Vorgang eventuell wiederholen, bis das gesamte Lysat auf die PerfectBind DNA Column geladen ist. Collection Tube verwerfen. Anmerkung: Falls das Lysat nicht komplett durch den Filter zentrifugiert wurde, bei höherer Drehzahl oder längerer Zeitdauer erneut zentrifugieren. 4. Waschen I PerfectBind DNA Column in ein frisches 2.0 ml Collection Tube stecken und 500 µl DNA Wash Buffer TB I auf die PerfectBind DNA Column pipettieren. PerfectBind DNA Column im Tube für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 5. Waschen II Mit 650 µl komplettiertem DNA Wash Buffer TB II (siehe S.3) wie unter Punkt 4 waschen. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 6. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in ein neues 2.0 ml Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 7. Elution PerfectBind DNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit 50 µl vorgewärmten (auf 50 C) Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Im Anschluss für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Nochmalige Elution mit 50 µl empfohlen! Bei jeder Elution mit µl Elution Buffer werden bis zu 70 % der gebundenen DNA eluiert. Zwei Elutionsrunden ermöglichen deshalb eine Wiederfindungsrate von rund 90 %. Dabei ist allerdings zu beachten, dass mehrere Elutionsrunden zwar den absoluten Ertrag erhöhen, dafür jedoch die Konzentration erniedrigen. Puffervolumina unter 50 µl führen zu erheblich geringeren Erträgen. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 7

11 B. Isolation von mykobakterieller DNA aus Sputum Proben größeren Volumens (bis zu 5 ml) Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! Schüttelwasserbad oder Thermomixer vorgewärmt auf 37 C; auf 50 C; 68 C und auf 95 C! 100 % Ethanol! Steriles, deionisiertes Wasser (optional)! Sterile DNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen! Zusätzlicher NAC-Puffer muss bestellt werden! Elution Buffer bei 50 C vorwärmen 1. Isolierung der Bakterien Vorsicht im Umgang mit Mykobakterien; Infektionsgefahr! Bis zu 5 ml Sputum in ein 15 ml Reaktiongefäß pipettieren und bei 68 C für 30 min inaktivieren. Gleiches Volumen NAC Puffer hinzufügen, kurz vortexen und bei RT für 20 min inkubieren. Danach bei x g * (~ rpm) für 15 min zentrifugieren. Überstand sorgfältig, aber vollständig abnehmen. Pellet nicht verwerfen! 2. Zellwandverdau und Lyse Bakterielles Pellet in 200 µl TE Puffer resupendieren. 15 µl Lysozym hinzupipettieren und für 5 s vortexen. Ansatz bei 37 C für 30 min unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren. Wenn kein Thermomixer verfügbar ist, den Ansatz während der Inkubationszeit 3 4 x kurz vortexen. Anmerkung: Dauer der Lyse kann erweitert werden Nach Zugabe von 200 µl DNA Lysis Puffer TB den Ansatz für 20 min bei 95 C inkubieren und danach für 2 min auf Eis stellen. Zugabe von 25 µl Proteinase K und Inkubation bei 50 C für 30 min unter kontinuierlichem Schütteln. 3. Laden und Binden 400 µl DNA Binding Buffer TB zugeben und durch Vortexen oder Pipettieren sorgfältig mischen. Eine PerfectBind DNA Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und 600 µl auf die PerfectBind DNA Column laden. Den Deckel schließen und für 2 Minuten bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Vorgang eventuell wiederholen, bis das gesamte Lysat auf die PerfectBind DNA Column geladen ist. Collection Tube verwerfen. peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 8

12 Anmerkung: Falls das Lysat nicht komplett durch den Filter zentrifugiert wurde, bei höherer Drehzahl oder längerer Zeitdauer erneut zentrifugieren. 4. Waschen I PerfectBind DNA Column in ein frisches 2.0 ml Collection Tube stecken und 500 µl DNA Wash Buffer TB auf die PerfectBind DNA Column pipettieren. PerfectBind DNA Column im Tube für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 5. Waschen II Mit 650 µl komplettiertem DNA Wash Buffer TB II (siehe S.3) wie unter Punkt 4 waschen. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 6. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in ein neues 2.0 ml Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 7. Elution PerfectBind DNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit 50 µl vorgewärmten (auf 50 C) Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Im Anschluss für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Nochmalige Elution mit 50 µl empfohlen! Bei jeder Elution mit µl Elution Buffer werden bis zu 70 % der gebundenen DNA eluiert. Zwei Elutionsrunden ermöglichen deshalb eine Wiederfindungsrate von rund 90 %. Dabei ist allerdings zu beachten, dass mehrere Elutionsrunden zwar den absoluten Ertrag erhöhen, dafür jedoch die Konzentration erniedrigen. Puffervolumina unter 50 µl führen zu erheblich geringeren Erträgen. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 9

13 C. Isolation von mykobakterieller DNA aus bronchoalveolärer Lavage (Luftröhrenspülung) Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! Schüttelwasserbad oder Thermomixer vorgewärmt auf 37 C; auf 50 C und auf 95 C! 100 % Ethanol! Steriles, deionisiertes Wasser (optional)! Sterile DNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen! Elution Buffer bei 50 C vorwärmen 1. Isolation der Bakterien Vorsicht im Umgang mit Mykobakterien; Infektionsgefahr! Bis zu 1 ml bronchoalveolärer Lavage in ein 1.5 ml Reaktiongefäß pipettieren und bei 8000 x g * (~ rpm) für 15 min zentrifugieren. Überstand sorgfältig, aber vollständig abnehmen. Pellet nicht verwerfen! 2. Zellwandverdau und Lyse Bakterielles Pellet in 200 µl TE Puffer resupendieren. 15 µl Lysozym hinzupipettieren und für 5 s vortexen. Ansatz bei 37 C für 30 min unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren. Wenn kein Thermomixer verfügbar ist, den Ansatz während der Inkubationszeit 3 4 x kurz vortexen. Anmerkung: Dauer der Lyse kann verlängert werden. Nach Lyse mit Lysozym Zugabe von 200 µl DNA Lysis Puffer TB den Ansatz für 20 min bei 95 C inkubieren und danach für 2 min auf Eis stellen. Zugabe von 25 µl Proteinase K und Inkubation bei 50 C für 30 min unter kontinuierlichem Schütteln. 3. Laden und Binden 400 µl DNA Binding Buffer TB zugeben und durch Vortexen oder Pipettieren sorgfältig mischen. Eine PerfectBind DNA Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und 600 µl des Ansatzes auf die PerfectBind DNA Column laden. Den Deckel schließen und für 2 Minuten bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Vorgang eventuell wiederholen, bis das gesamte Lysat auf die PerfectBind DNA Column geladen ist. Collection Tube verwerfen. Anmerkung: Falls das Lysat nicht komplett durch den Filter zentrifugiert wurde, bei höherer Drehzahl oder längerer Zeitdauer erneut zentrifugieren. peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 10

14 4. Waschen I PerfectBind DNA Column in ein frisches 2.0 ml Collection Tube stecken und 500 µl DNA Wash Buffer TB I auf die PerfectBind DNA Column pipettieren. PerfectBind DNA Column im Tube für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 5. Waschen II Mit 650 µl komplettiertem DNA Wash Buffer TB II (siehe S.3) wie unter Punkt 4 waschen. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 6. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in ein neues 2.0 ml Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 7. Elution PerfectBind DNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit 50 µl vorgewärmten (auf 50 C) Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Im Anschluss für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Nochmalige Elution mit 50 µl empfohlen! Bei jeder Elution mit µl Elution Buffer werden bis zu 70 % der gebundenen DNA eluiert. Zwei Elutionsrunden ermöglichen deshalb eine Wiederfindungsrate von rund 90 %. Dabei ist allerdings zu beachten, dass mehrere Elutionsrunden zwar den absoluten Ertrag erhöhen, dafür jedoch die Konzentration erniedrigen. Puffervolumina unter 50 µl führen zu erheblich geringeren Erträgen. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 11

15 D. Isolation von mykobakterieller DNA aus Gewebebiopsien ( z.b. Lymphknoten) Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:! Schüttelwasserbad oder Thermomixer vorgewärmt auf 50 C und auf 95 C! 100 % Ethanol! Steriles, deionisiertes Wasser (optional)! Sterile DNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen! Elution Buffer bei 50 C vorwärmen 1. Zellwandverdau und Lyse Vorsicht im Umgang mit Mykobakterien; Infektionsgefahr! 1 mg bis max. 10 mg Gewebeprobe der Biopsie in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen. 400 µl DNA Lysis Puffer TB, 25 µl Proteinase K, sowie 20 µl Lysozym zur Gewebeprobe pipettieren und kurz vortexen. Den Ansatz im Thermomixer für min bei 50 C inkubieren. Wenn kein Thermomixer verfügbar ist, den Ansatz während der Inkubationszeit 4 6 x kurz vortexen. Anmerkung: Die Dauer der Lyse kann bei Bedarf verlängert werden. Reaktionsgefäß für weitere 30 min bei 95 C unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren. 2. Laden und Binden 400 µl DNA Binding Buffer TB zugeben und durch Vortexen oder Pipettieren sorgfältig mischen. Eine PerfectBind DNA Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und 600 µl des Ansatzes auf die PerfectBind DNA Column laden. Den Deckel schließen und für 2 Minuten bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen und Vorgang eventuell wiederholen, bis das gesamte Lysat auf die PerfectBind DNA Column geladen ist. Collection Tube verwerfen. Anmerkung: Falls das Lysat nicht komplett durch den Filter zentrifugiert wurde, bei höherer Drehzahl oder längerer Zeitdauer erneut zentrifugieren. peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 12

16 3. Waschen I PerfectBind DNA Column in ein frisches 2.0 ml Collection Tube stecken und 500 µl DNA Wash Buffer TB I auf die PerfectBind DNA Column pipettieren. PerfectBind DNA Column im Tube für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 4. Waschen II Mit 650 µl komplettiertem DNA Wash Buffer TB II (siehe S.3) wie unter Punkt 4 waschen. Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen. 5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind DNA Column in ein neues 2.0 ml Collection Tube stecken und durch zweiminütiges Zentrifugieren bei x g* vollständig trocknen. 6. Elution PerfectBind DNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die DNA mit 50 µl vorgewärmten (auf 50 C) Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Im Anschluss für 1 Minute bei x g* zentrifugieren. Nochmalige Elution mit 50 µl empfohlen! Bei jeder Elution mit µl Elution Buffer werden bis zu 70 % der gebundenen DNA eluiert. Zwei Elutionsrunden ermöglichen deshalb eine Wiederfindungsrate von rund 90 %. Dabei ist allerdings zu beachten, dass mehrere Elutionsrunden zwar den absoluten Ertrag erhöhen, dafür jedoch die Konzentration erniedrigen. Puffervolumina unter 50 µl führen zu erheblich geringeren Erträgen. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. * Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 13

17 AUFKONZENTRIERUNG DER DNA Genomische DNA, die mit dem peqgold Mycobacteria DNA Kit aufgereinigt wurde, kann bei Bedarf noch weiter konzentriert werden. Hierzu NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0.1 M und danach 2 Volumen absolutes Ethanol zugeben. Ansatz durch Vortexen sorgfältig mischen und für rund 10 Minuten bei 20 C inkubieren. Danach für 15 Minuten bei x g* zentrifugieren und Überstand verwerfen. 700 µl 80 % Ethanol zugeben und für 2 Minuten bei x g* zentrifugieren. Überstand verwerfen, Pellet für 2 Minuten lufttrocknen und DNA in 20 µl sterilem, deionisierten Wasser oder 10 mm Tris-HCl, ph 9.0 lösen. QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA Um die Konzentration und Reinheit einer DNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. Eine A 260-Einheit entspricht dabei 50 µg DNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: DNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 50 x Verdünnungsfaktor Das A 260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqgold Mycobacteria DNA Kit erzielbare Verhältnis von 1.7 bis 1.9 entspricht deshalb genomischer DNA mit einer Reinheit von 85 % bis 95 %. Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen DNA auch durch Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit bekannten DNA-Proben bestimmt werden. Genomische DNA, die mit dem peqgold Mycobacteria DNA Kit aufgereinigt wurde, kann in Elution Buffer, 10 mm Tris-HCl (ph 9.0) oder sterilem, deionisierten Wasser für mehrere Jahre bei 20 C aufbewahrt werden. Dabei ist zu beachten, dass häufiges Auftauen und Einfrieren zum Scheren der DNA und damit zu einer sukzessiven Reduktion der Molekülgrößen führt. peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 14

18 BESTELLINFORMATIONEN Für die DNA-Isolierung aus Mycobakterien: peqgold Mycobacteria DNA Kit Reinigungen Reinigungen Reinigungen peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 15

19 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Ursache Abhilfe PerfectBind DNA Column verstopft Keine DNA im Eluat Schlechtes A 260/280- Verhältnis Unvollständiger Zellwandverdau Unvollständige Lyse Probenvolumen zu groß Unvollständige Spheroblastenbildung Schlechte Lyse durch unzureichendes Mischen mit DNA Binding Buffer TB DNA Wash Buffer TB II nicht mit absolutem Ethanol verdünnt Säulenmaterial im Eluat Schlechte Lyse durch unzureichendes Mischen mit DNA Binding Buffer TB Unvollständige Lyse oder Proteindegradation durch zu kurze Inkubation Mehr Lysozym zugeben oder Inkubation um 15 Minuten verlängern. Korrektes Volumen DNA Binding Buffer TB zugeben und für 30 Minuten bei 70 C inkubieren. Nur empfohlene Mengen an Ausgangsmaterial verwenden. Bei größerem Volumen mehrere PerfectBind DNA Columns und entsprechende Puffervolumina einsetzen. Mehr Lysozym zugeben oder Inkubation um 15 Minuten verlängern. Nach Zugabe von DNA Binding Buffer TB sorgfältiger mischen. DNA Wash Buffer TB II-Konzentrat mit 2.3 Volumen Ethanol verdünnen. Während der Elution nicht länger und nicht höher zentrifugieren als angegeben. Säulenmaterial interferiert nicht mit Enzymreaktionen und kann durch Pelletieren entfernt werden. Nach Zugabe von DNA Binding Buffer TB sorgfältiger mischen. Inkubationszeit in DNA Lysis Buffer TB mit Proteinase K verlängern, bis keine Zellklumpen mehr zu erkennen sind. peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 16

20 TROUBLESHOOTING TIPS (Fortsetzung) Problem Ursache Abhilfe Niedriger DNA-Ertrag Schlechte Elution Elution wiederholen oder Volumen des Elution Buffer erhöhen. PerfectBind DNA Column nach dem Auftragen des Elution Buffers zunächst für 5 Minuten bei 70 C inkubieren oder auf 70 C vorgewärmten Elution Buffer verwenden. Probleme bei Folgeanwendungen DNA vor der Elution von der PerfectBind DNA Column gewaschen PerfectBind DNA Column verstopft Salzübertragung Ethanolübertragung Das DNA Wash Buffer TB II-Konzentrat muss vor seiner Verwendung mit 2.3 Volumen absolutem Ethanol verdünnt werden. Siehe oben. DNA Wash Buffer TB II muss Raumtemperatur haben. Nach dem zweiten Waschen muss die PerfectBind DNA Column durch Zentrifugieren für 2 Minuten bei x g* getrocknet werden. peqgold Mycobacteria DNA Kit Art.-Nr PEQLAB_v0815_D 17

21 INTRODUCTION The peqgold Mycobacteria DNA Kit allows rapid and reliable isolation of high-quality mycobacterial DNA from sputum, bronchoalveolar lavage or tissue samples (e.g. lymph nodes). One or several samples can be processed in less than 2 hours. The system combines the reversible nucleic acid binding properties of PerfectBind matrix with the speed and versatility of PerfectBind DNA Column technology to yield approximately up to 30 µg of DNA. There is no need for phenol/chloroform extractions. Time-consuming steps such as CsCl gradient ultracentrifugation or precipitation with isopropanol or ethanol are eliminated. Purified DNA is suitable for PCR, restriction digestion, and hybridization techniques. There are no organic extractions, thus reducing plastic waste and hands-on time to allow multiple samples to be processed in parallel. Mycobacterial DNA purified using the peqgold Mycobacteria DNA Mini Kit is ready for applications such as PCR, Southern blotting or RFLP analysis. THEORY The peqgold Mycobacteria DNA Kit uses the reversible nucleic acid binding properties of the PerfectBind matrix, combined with the speed of mini-column spin technology. A specifically formulated buffer system allows up to 30 µg of genomic DNA with fragment lengths up to 60 kbp to bind to the matrix. The extraction method includes a pretreatment of the sample with N-acetylcystein. The bacterial cell wall is then removed by Lysozyme treatment followed by Proteinase K digestion. Subsequent lysis and binding conditions are adjusted and the sample applied to a PerfectBind DNA Column. Two rapid wash steps remove trace salt and protein contaminants and finally DNA is eluted in water or Elution Buffer. Purified DNA can be directly used in downstream applications without the need for further purification. peqgold Mycobacteria DNA Kit Or.-No PEQLAB_v0815_E 18

22 KIT COMPONENTS peqgold Mycobacteria DNA Kits 5 Purifications 50 Purifications 200 Purifications Product Number Components PerfectBind DNA Column ml Collection Tubes NAC Buffer 1.5 ml 15 ml 60 ml DNA Lysis Buffer TB 1.5 ml 20 ml 60 ml DNA Binding Buffer TB 2 x 1.5 ml 25 ml 100 ml DNA Wash Buffer TB I 2 x 1.5 ml 30 ml 125 ml DNA Wash Buffer TB II (conc.) 1.5 ml 15 ml 48 ml Elution Buffer 1 ml 5 ml 20 ml 10 mm TE Puffer 2 ml 20 ml 80 ml Lysozyme 5 mg 50 mg 200 mg Proteinase K 3 mg 30 mg 120 mg Instruction Manual STORAGE AND STABILITY Please store undissolved Proteinase K and Lysozyme cool and dry at 4 C or 20 C. Dissolved Proteinase K and Lysozyme has to be stored in aliquots at 20 C. All other kit components should be stored at room temperature (22 to 25 C) and will then remain stable for at least 12 months after the date of purchase. During shipment crystals may form in the DNA Binding Buffer. Warm up to 37 C to dissolve. BINDING CAPACITY The binding capacity of a PerfectBind DNA Column is 30 µg DNA. Do not use more cell material than indicated. peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 19

23 BEFORE STARTING Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components and have the necessary materials ready before starting.! DNA Binding Buffer TB contains a chaotropic salt. Use gloves and protective eyeware when handling this solution.! Under cool ambient conditions, crystals may form in the DNA Binding Buffer TB. This is normal and the bottle should be warmed to 37 C to dissolve the salt before use.! DNA Wash Buffer TB II is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as follows: Kit Kit Kit Add 3.5 ml EtOH ( %) to 1.5 ml DNA Wash Buffer TB II. Add 35 ml EtOH ( %) to 15 ml DNA Wash Buffer TB II. Add 112 ml EtOH ( %) to 48 ml DNA Wash Buffer TB II. Store diluted DNA Wash Buffer TB II at room temperature.! Prepare Proteinase K stock solution as following: Kit Kit Kit Dissolve 3 mg Proteinase K in 150 µl TE Buffer. Dissolve 30 mg Proteinase K in 1.5 ml TE Buffer. Dissolve 120 mg Proteinase K in 6 ml TE Buffer. Dissolved Proteinase K has to be stored in aliquots at 20 C and be freshly thawed before use.! Prepare Lysozyme stock solution (10 mg/ml) as following: Kit Kit Kit Dissolve 5 mg Lysozyme in 500 µl TE Buffer. Dissolve 50 mg Lysozyme in 5 ml TE Buffer. Dissolve 200 mg Lysozyme in 20 ml TE Buffer. Dissolved Lysozyme has to be stored in aliquots at 20 C and be freshly thawed before use.! All steps must be carried out at room temperature (22 25 C). peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 20

24 DANGEROUS COMPONENTS peqgold Mycoacteria DNA Kit Components PerfectBind Columns 2.0 ml Collection Tubes NAC Buffer Signal word / symbols Dangerous components H and P statements DANGER sodium hydroxide 2-2.5%, CAS: H314, P101, P102, P103, P260, P280, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 DNA Lysis Buffer TB DNA Binding Buffer TB --- (not necessary) sodium dodecyl sulphate 1-2.5%, CAS: DANGER propan-2-ol %, polyethylene glycol octylphenol ether 25-50%, CAS: , (not necessary) H225, H318, H336, P101, P102, P103, P210, P261, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P501 DNA Wash Buffer TB I (Konz.) (konz.) DNA Wash Buffer TB II (Konz.) (konz.) Elution Buffer Lysozym Proteinase K DANGER Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-<25%, CAS: , H225, H314, P101, P102, P103, P210, P241, P303+P361+P353, P305+P351+P338, P405, P (not necessary) Lysozyme (Powder), CAS_ DANGER Proteinase, Tritirachium album serine %, CAS: (not necessary) H319, H335, H315, H334, P280, P285, P305+P351+P338, P309+P mm TE Buffer peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 21

25 H and P statements H314 H315 H318 H225 H319 H334 H335 H336 P101 P102 P103 P210 P241 P260 P261 P280 P285 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P309+P311 P405 P501 Descriptions Causes severe skin burns and eye damage. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. Highly flammable liquid and vapour. Causes serious eye irritation. May cause allergy or asthma symptoms or breathing difficulties if inhaled. May cause respiratory irritation. May cause drowsiness or dizziness. If medical advice is needed, have product container or label at hand. Keep out of reach of children. Read label before use. Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other ignition sources. No smoking. Use explosion-proof electrical/ventilating/lighting/ / equipment. Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Avoid breathing dust/fume/gas/mist/vapours/spray. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. In case of inadequate ventilation wear respiratory protection. IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower. IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. IF exposed or concerned: Get medical advice/attention. Store locked up. Dispose of contents/container to peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 22

26 PEQGOLD MYCOBACTERIA DNA ISOLATION PROTOCOL A. Isolation of mycobacterial DNA from Sputum samples (200 µl) Materials required, but not supplied:! Shaking water bath or thermal mixer set to 37 C, 50 C, 68 C and 95 C! Absolute (96 % 100 %) ethanol! Sterile dh 2O (optional)! Nuclease-free 1.5 ml tubes! Prewarm Elution Buffer at 50 C 1. Isolation of the bacteria Take care when handling with mycobacteria; danger of infection! Transfer 200 µl of sputum sample in a 1.5 ml reaction tube and add 200 µl NAC buffer. Vortex shortly and incubate at RT for 20 min on a shaking platform (e.g. thermal mixer). If no thermal mixer is available, vortex the sample 3-4 times for 10 sec during incubation. Centrifuge at 8000 x g * (~ rpm) for 15 min. Remove the supernatant carefully but completely. Don t discard the pellet. 2. Cell wall digest and lysis Resuspend the bacterial pellet in 200 µl TE buffer. Add 15 µl Lysozyme and mix by pulsed vortexing for 5 s. Incubate the sample at 37 C for 30 min with continuous shaking. Note: Incubation time of lysis might need to be extended. After lysis with Lysozyme add 200 µl DNA Lysis Buffer TB, incubate the sample for 20 min at 95 C and cool down on ice for 2 min. Add 25 µl Proteinase K and incubate at 50 C für 30 min with continuous shaking. 3. Load and bind Add 400 µl DNA Binding Buffer TB and mix well by pipetting up and down several times. Assemble a PerfectBind DNA Column in a 2.0 ml Collection Tube. Apply 600 µl onto the column including any precipitate that may have formed to the PerfectBind DNA Column. Centrifuge at x g* for 2 min to bind DNA. If there is residual sample transfer it to the column and centrifuge again. Discard the flow-through and Collection Tube. peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 23

27 4. Wash I Place the column into a fresh 2.0 ml Collection Tube and wash by adding 500 µl of DNA Wash Buffer TB I. Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and Collection Tube. 5. Wash II Wash with 650 µl DNA Wash Buffer TB II (completed with ethanol as described on page 18). Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and keep the Collection Tube for the next step. 6. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind DNA Column containing your DNA in the 2.0 ml Collection Tube used in step 5 and centrifuge for 2 min at x g* to dry the column matrix. 7. Elution Place the column into a sterile 1.5 ml microfuge tube and add 50 µl of prewarmed (to 50 C) Elution Buffer or sterile dh 2O. Allow tubes to sit for 2 min at room temperature. To elute DNA from the column, centrifuge at x g* for 1 min. It is recommended to repeat the elution with another 50 µl Elution Buffer. With every elution with µl Elution Buffer or sterile deionized water, up to 70 % of bound DNA will be eluted. Two elution rounds allow a recovery rate of approx. 90 %. Consider that multiple elution rounds increase the DNA yield but decrease the concentration. However buffer volumes under 50 µl result in a clear reduction of the yield. For the second elution the first eluate can also be used. Thereby the total yield will be increased with a higher end concentration. But it drops behind approx. 30 % of the yield which can be achieved with a second aliquot of Elution Buffer. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 31 peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 24

28 B. Isolation of mycobacterial DNA from larger volume of sputum samples (up to 5 ml) Materials required, but not supplied:! Shaking water bath or thermal mixer set to 37 C, 50 C, 68 C and 95 C! Absolute (96 % 100 %) ethanol! Sterile dh 2O (optional)! Nuclease-free 1.5 ml tubes! Additional NAC buffer must be ordered separately! Prewarm Elution Buffer at 50 C 1. Isolation of the bacteria Take care when handling with mycobacteria; danger of infection! Transfer up to 5 ml of sputum sample in a 15 ml reaction tube and inactivate the sample by incubation at 68 C for 30 min. Add an equal volume of NAC buffer, vortex shortly and incubate at room temperature for 20 min on a shaking platform (e.g. water bath). If no shaker is available, vortex the sample 3-4 times for 10 sec during incubation. Centrifuge at 2500 x g * (~3.000 rpm) for 15 min. Remove the supernatant carefully but completely. Don t discard the pellet. 2. Cell wall digest and lysis Resuspend the bacterial pellet in 200 µl TE buffer. Add 15 µl Lysozyme and mix by pulsed vortexing for 5 s. Incubate the sample at 37 C for 30 min with continuous shaking. Note: Incubation time of lysis might need to be extended. After lysis with Lysozyme add 200 µl DNA Lysis Buffer TB, incubate the sample for 20 min at 95 C and cool down on ice for 2 min. Add 25 µl Proteinase K and incubate at 50 C for 30 min with continuous shaking. 3. Load and bind Add 400 µl DNA Binding Buffer TB and mix well by pipetting up and down several times. Assemble a PerfectBind DNA Column in a 2.0 ml Collection Tube. Apply 600 µl onto the column including any precipitate that may have formed to the PerfectBind DNA Column. Centrifuge at x g* for 2 min to bind DNA. If there is residual sample transfer it to the column and centrifuge again. Discard the flow-through and Collection Tube. peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 25

29 4. Wash I Place the column into a fresh 2.0 ml Collection Tube and wash by adding 500 µl of DNA Wash Buffer TB I. Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and Collection Tube. 5. Wash II Wash with 650 µl DNA Wash Buffer TB II (completed with ethanol as described on page 18). Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and keep the Collection Tube for the next step. 6. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind DNA Column containing your DNA in the 2.0 ml Collection Tube used in step 5 and centrifuge for 2 min at x g* to dry the column matrix. 7. Elution Place the column into a sterile 1.5 ml microfuge tube and add 50 µl of prewarmed (to 50 C) Elution Buffer or sterile dh 2O. Allow tubes to sit for 2 min at room temperature. To elute DNA from the column, centrifuge at x g* for 1 min. It is recommended to repeat the elution with another 50 µl Elution Buffer. With every elution with µl Elution Buffer or sterile deionized water, up to 70 % of bound DNA will be eluted. Two elution rounds allow a recovery rate of approx. 90 %. Consider that multiple elution rounds increase the DNA yield but decrease the concentration. However buffer volumes under 50 µl result in a clear reduction of the yield. For the second elution the first eluate can also be used. Thereby the total yield will be increased with a higher end concentration. But it drops behind approx. 30 % of the yield which can be achieved with a second aliquot of Elution Buffer. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 26

30 C. Isolation of mycobacterial DNA from bronchoalveolar lavage sample Materials required, but not supplied:! Shaking water bath set to 37 C, 50 C and 95 C! Absolute (96 % 100 %) ethanol! Sterile dh 2O (optional)! Nuclease-free 1.5 ml tubes! Prewarm Elution Buffer at 50 C 1. Isolation of bacteria Transfer up to 1 ml of bronchoalveolar lavage sample into a reaction tube and centrifuge the sample at x g (~ rpm) for 15 min. Remove the supernatant carefully, but completely. Don t discard the pellet. 2. Cell wall digest and lysis Resuspend the bacterial pellet in 200 µl TE buffer. Add 15 µl Lysozyme and mix by pulsed vortexing for 5 s. Incubate the sample at 37 C for 30 min with continuous shaking. Note: Incubation time of lysis might need to be extended. After lysis with Lysozyme add 200 µl DNA Lysis Buffer TB, incubate the sample at 95 C for 20 min and cool down on ice for 2 min. Add 25 µl Proteinase K and incubate at 50 C for 30 min on a shaking platform (e.g. thermal mixer). If no thermal mixer is available, vortex the sample 3-4 times for 10 sec during incubation. 3. Load and bind Add 400 µl DNA Binding Buffer TB and mix well by pipetting up and down several times. Assemble a PerfectBind DNA Column in a 2.0 ml Collection Tube. Apply 600 µl to the column including any precipitate that may have formed. Centrifuge at x g* for 2 min to bind DNA. If there is residual sample transfer it to the column and centrifuge again. Discard the flow-through and Collection Tube. 4. Wash I Place the column into a fresh 2.0 ml Collection Tube and wash by adding 500 µl of DNA Wash Buffer TB I. Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and Collection Tube. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 27

31 5. Wash II Wash with 650 µl DNA Wash Buffer TB II (completed with ethanol as described on page 18). Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and keep the Collection Tube for the next step. 6. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind DNA Column in the 2.0 ml Collection Tube and centrifuge for 2 min at x g* to dry the column matrix. 7. Elution Place the column into a sterile 1.5 ml microfuge tube and add 50 µl of prewarmed (to 50 C) Elution Buffer or sterile dh 2O. Allow tubes to sit for 2 min at room temperature. To elute DNA from the column, centrifuge at x g* for 1 min. It is recommended to repeat the elution with another 50 µl Elution Buffer. With every elution with µl Elution Buffer or sterile deionized water, up to 70 % of bound DNA will be eluted. Two elution rounds allow a recovery rate of approx. 90 %. Consider that multiple elution rounds increase the DNA yield but decrease the concentration. However buffer volumes under 50 µl result in a clear reduction of the yield. For the second elution the first eluate can also be used. Thereby the total yield will be increased with a higher end concentration. But it drops behind approx. 30 % of the yield which can be achieved with a second aliquot of Elution Buffer. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 28

32 D. Isolation of mycobacterial DNA from tissue biopsies (e.g. lymph nodes) Materials required, but not supplied:! Shaking water bath set to 37 C, 50 C and 95 C! Absolute (96 % 100 %) ethanol! Sterile dh 2O (optional)! Nuclease-free 1.5 ml tubes! Prewarm Elution Buffer at 50 C 1. Homogenization and lysis Transfer from 1 mg up to max. 10 mg of biopsy tissue into a 1.5 ml reaction tube. Add 400 µl of Lysis Solution TB, 25 µl Proteinase K and 20 µl Lysozyme. Vortex shortly. Place the tube on a shaking platform (e.g. thermal mixer) and incubate at 50 C for min. If no thermal mixer is available, vortex the sample 4-6 times for 10 sec during incubation. Note: Incubation time of lysis might need to be extended. Continue by incubating at 95 C for 30 min with continuous shaking. 2. Load and bind Add 400 µl DNA Binding Buffer TB and mix well by pipetting up and down several times. Assemble a PerfectBind DNA Column in a 2.0 ml Collection Tube. Apply 600 µl to the column including any precipitate that may have formed. Centrifuge at x g* for 2 min to bind DNA. If there is residual sample transfer it to the column and centrifuge again. Discard the flow-through and Collection Tube. 3. Wash I Place the column into a fresh 2.0 ml Collection Tube and wash by adding 500 µl of DNA Wash Buffer TB I. Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and Collection Tube. 4. Wash II Wash with 650 µl DNA Wash Buffer TB II (completed with ethanol as described on page 18). Centrifuge at x g* for 1 min. Discard flow-through and keep the Collection Tube for the next step. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 29

33 5. Dry (Important, do not skip this step!) Place the PerfectBind DNA Column in the 2.0 ml Collection Tube and centrifuge for 2 min at x g* to dry the column matrix. 6. Elution Place the column into a sterile 1.5 ml microfuge tube and add 50 µl of prewarmed (to 50 C) Elution Buffer or sterile dh 2O. Allow tubes to sit for 2 min at room temperature. To elute DNA from the column, centrifuge at x g* for 1 min. It is recommended to repeat the elution with another 50 µl Elution Buffer. With every elution with µl Elution Buffer or sterile deionized water, up to 70 % of bound DNA will be eluted. Two elution rounds allow a recovery rate of approx. 90 %. Consider that multiple elution rounds increase the DNA yield but decrease the concentration. However buffer volumes under 50 µl result in a clear reduction of the yield. For the second elution the first eluate can also be used. Thereby the total yield will be increased with a higher end concentration. But it drops behind approx. 30 % of the yield which can be achieved with a second aliquot of Elution Buffer. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 30

34 CONCENTRATING THE DNA Genomic DNA purified with the peqgold Mycobacteria DNA Kit can be further concentrated if required. Add NaCl to a final concentration of 0.1 M and 2 sample volumes of absolute ethanol. Mix thoroughly by vortexing and incubate for 10 minutes at 20 C. Centrifuge for 15 minutes at x g* and discard the supernatant. Add 700 µl of 80 % ethanol and centrifuge for 2 minutes at x g*. Discard the supernatant, air-dry the pellet for 2 minutes and dissolve the DNA in 20 µl of sterile, deionised water or 10 mm Tris-HCl, ph 9.0. QUANTITATION AND STORAGE OF DNA To determine the concentration and the purity of a DNA containing solution, the absorbance of a 10- to 50-fold diluted aliquot is measured at 260 nm and 280 nm in a spectrophotometer. One A 260 unit corresponds to 50 µg of DNA per ml. The concentration can be determined as follows: DNA concentration (µg/ml) = absorbance 260 x 50 x dilution factor The A 260/280 ratio of pure nucleic acids is 2.0. Generally genomic DNA isolated with the peqgold Mycobacteria DNA Mini Kit shows ratios between 1.7 and 1.9 corresponding to a purity of 85 % to 95 %. Alternatively the approximate yield and the quality of the received DNA can also be determined by agarose gel electrophoresis with subsequent ethidium bromide staining and comparison with well-known DNA samples. Genomic DNA isolated with peqgold Mycobacteria DNA Kits can be stored at 20 C for years if eluted in Elution buffer, 10 mm Tris-HCl, ph 9.0 or sterile, deionized water. Repeated freeze-thaw-cycles can result in shearing of the DNA and therefore successive reduction of fragment lengths can occur. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 31

35 ORDERING INFORMATION For DNA isolation from Mycobacteria peqgold Mycobacteria DNA Kit Preparations Preparations Preparations peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 32

36 TROUBLESHOOTING TIPS Problem Likely cause Suggestion Clogged column Incomplete lysis Add the correct volume of DNA Lysis Buffer TB and incubate at 70 C to obtain complete lysis. It may be necessary to extend incubation time to 30 min. Sample volume too large Incomplete removal of cell wall Low DNA yield Clogged column See above. Do not use greater than the recommended tissue amount per PerfectBind DNA Column. For larger volumes, divide sample into multiple tubes. Add more Lysozyme or extend the incubation time. It may be necessary to increase incubation by 15 min. Low A 260/A 280 ratio Poor elution Improper washing Extended centrifugation during elution step Poor cell lysis due to incomplete mixing with DNA Binding Buffer TB Matrix material in the eluate Incomplete lysis or protein degradation due to too short incubation Repeat elution or increase elution volume (see note on page 20). Incubation of column at 70 C for 5 min or usage of 70 C prewarmed dh 2O or Elution Buffer may increase yields. DNA Wash Buffer TB II Concentrate must be diluted with absolute (100 %) ethanol as specified on page 18 before use. Resin from the column may be present in eluate. Avoid centrifugation at speeds higher than specified. The material can be removed from the eluate by centrifugation - it will not interfere with PCR or restriction digests. Repeat the procedure, this time making sure to mix the sample with DNA Binding Buffer TB immediately and completely. Do not centrifuge longer or faster as described. Matrix material does not interfere with enzyme reactions and can be removed by pelleting. Extend incubation in DNA Lysis Buffer TB with Proteinase K until there are no more cell clumps. peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 33

37 TROUBLESHOOTING TIPS (Continuation) Problem Likely cause Suggestion No DNA in the eluate Incomplete generation of Add more Lysozyme or extend incubation for spheroblasts 15 min. Poor cell lysis due to incomplete mixing with DNA Binding Buffer TB See above. DNA Wash Buffer not diluted with absolute ethanol Dilute DNA Wash Buffer TB II concentrate with 2.3 volume of ethanol. Problems with downstream applications Transfer of salt DNA Wash Buffer TB II must have room temperature. Transfer of ethanol After second wash step dry the PerfectBind DNA Column by centrifuging for 2 min at x g*. * Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 36 peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 34

38 peqgold Mycobacteria DNA Kit Ord.-No.: PEQLAB_v0815_E 35

39 APPENDIX Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser. Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter. peqgold Mycobacteria DNA Kit Or.-No PEQLAB_v0815_E 36

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