Programm. Interdisziplinäre Diagnostik in der Hämatologie Einführung. Fallbeispiele

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1 Interdisziplinäre Diagnostik in der Hämatologie Dr. med. Urs Lüthi Dr. med. phil. nat Paula Fernandez Dr. rer. Nat. Sharareh Moshir Margrit Bader Ambassadoren Weiterbildug labmed Sektion Nordwestschweiz , Basel Programm Einführung Allgemeine Morphologie Histopathologie Immunphänotypisierung Medizinische Genetik Fallbeispiele 1

2 Zusammenfassung Diagnostische Kriterien basieren auf: Klinik Morphologie Patho-Histologie Immunphänotyp UND Genetik zur Klassifikation in klinisch bedeutsame Krankheiten Gründe für Klassifikation Classification is a language of medicine: Erkrankungen brauchen eine Namen, bevor sie diagnostiziert, behandelt und erforscht werden können. Eine einheitlicher Gebrauch von Definition und Terminologie ist essentiell für die Klinik und Forschung. 2

3 WHO Klassifikation 2008 Myeloischer Neoplasien Myeloproliferative Neoplasien (MPN) Myeloische and lymphatische Neoplasien, mit Eosinophilie assoziiert und mit Aberrationen von PDGFRA, PDGFRB, or FGFR1 Myelodysplastische/myeloproliferative Neoplasien (MDS/MPN) Myelodysplastische Syndrome (MDS) Akute myeloische Leukämien und verwandte Vorläuferneoplasien Akute Leukämien of ambiguous lineage - nicht eindeutig einer Zellinie zu ordbar Morphologie Einführung in die Morphologie Lehre von Struktur und Formen mikroskopische Beschreibung/Beurteilung und Einteilung von Zellen 3

4 Normale Blutzellen Neutrophile Granulozyten 40-80% Eosinophile Granulozyten 0-5% Basophile Granulozyten 0-2% Monozyten 2-10% Lymphozyten 20-40% Plasmazellen 0-1% Lymphomzellen vergleichen/beschreiben Normaler Lymphozyt CLL Mantelzell-Lymphom Viliöse Lymphozyten Follikuläres Lymphom LGL-Leukämie 4

5 Blickdiagnose Haarzelle /Zytochemie Haarzelle Tartrat resistente Saure Phosphatase Blasten Normaler Lymphozyt Lymphatischer Blast Lymphatischer Blast Myeloische Blasten 5

6 Akute myeloische Leukämien FAB M 1 FAB M 2 FAB M 3 FAB M 3 variant FAB M 4 Eos FAB M 5a FAB M 5b Erythroleukämie FAB M 6 Morphologie Stärken und Schwächen schnell, billig, Blickdiagnosen möglich wegweisend für weiterführende Diagnostik braucht viel Erfahrung 6

7 Stärken der Histopathologie Topographie der Hämopoiese Beurteilung der Zellularität Punctio sicca Beurteilung der Fibrose 7

8 Stärken der Histopathologie Fokale Prozesse (Metastasen, Lymphome, Mastozytose, Granulome) Spezifische Infiltrationsmuster bei Lymphomen Zusatzuntersuchungen (Immunhistochemie, FISH, PCR) Knochenstruktur, Blutgefässe 8

9 9

10 Oestrogenrezeptoren Was ist Flowzytometrie? Flow ~ in fluss Cyto ~ Zellen Metry ~ Messen -> Messen der Eigenschaften einer Zelle, die in Fluss ist Was ist FACS? F steht für A C S Fluoreszenz aktivierte Zell Sortierung 10

11 Prinzip der multiparameter Analyse Gleichzeitige Messung verschiedener Charakteristiken einer EINZELNEN Zelle, die eine Lichtquelle passiert Physische Eigenschaften (SSC/FSC) durch Messung der Licht-Streuung -> Grösse (FSC) -> Zellkomplexität (SSC) Bindung von spez. Antikörpern, die Fluoreszenz- markiert sind Datenrepräsentation Zellkomplexität Granularität Eosinophile Granulozyten Monozyten Lymphocyten Rote Vorstufen Zellgrösse 11

12 Datenrepräsentation Granularität Zellgrösse CD45 Expressionsstärke Jeder Punkt ist eine Zelle Was ist mit CD in CD45 gemeint? CD (cluster of differentiation) Nomenklatur 1982 eingeführt, um monoklonale Antikörper in Gruppen zusammenzufassen, die die gleiche Struktur auf Zellen erkennen Es handelt sich um Proteine der Zelloberfläche Diese monoklonale Antikörper werden zum Gebrauch in der FACS-Analyse fluoreszenz-markiert 12

13 Expression von CD Markern unterscheidet Zelltypen sowie Reifungsstadien (Beispiel Granulopoiese) Expression von CD Markern unterscheidet Zelltypen sowie Reifungsstadien (Beispiel Granulopoiese) 13

14 Knochenmark: Ein typisches Bsp von normal Granularität Vorläuferzellen Erythroide normal Eosinophile Neutrophile Monozyten Lymphozyten CD45 Expressionsstärke Knochenmark: normal und abnorm normal Eosinophile Vorläuferzellen Erythroide Neutrophile Monozyten Lymphozyten MDS CD45 AML 14

15 Immunphänotypische Analyse von Populationen Granulozyten: CD13 CD11b 4 Reifungsstadien Expression von CD Markern unterscheidet Zelltypen sowie Reifungsstadien 15

16 Die Ausreifung der Granulocyten das CD11b/CD13/CD16 Muster Mustererkennung (Pattern recognition) CD13 Patient? CD11b 16

17 Immunphänotypische Analyse: Die Strategie Identifizierung Quantifizierung Charakterisierung Jeder Population der Probe Immunphänotypische Charakterisierung neoplastischer Zellen Zuordnung zu einer Zell-Linie Bestimmung des Reifegrades Aberranter Immunphänotyp - erhöhte/erniedrigte Antigen Expression - asynchrone Expression - aberrante Expression eines Antigens Stärken des Immunphänotypisierung Schnell (2-3h) Spezifisch und sensitiv (abhängig von # analysierten Parameter und Zellen (10-5 )) Breite Anwendungsmöglichkeit (Blut, Punktate, Aspirate, Biopsien) Diagnose / Klassifikation (Prognose) / Minimale Restinfiltration (MRD) Bei zellarmen Materialien (zb Liquor) können alle in der Probe vorkommenden Zellen untersucht werden 17

18 Schwächen Ungenügend standardisiert (Probenverarbeitung / Instrumenten Einstellung / Panels / Datenanalyse und Interpretation / Befund) Dateninterpretation stark abhängig von Kenntnis des normalen (Ausreifung der verschiedenen Zell-Linien, Aktivierungsstadium der Zellen, abnorme (neoplastische) Immunphänotype Gewisse Zellen (Erythrocyten, Eosinophile, Megakaryocyten, Hodgkin-Zellen) können nicht untersucht werden -> Limitation bei diesen Erkrankungen (Myeloproliferative Syndrome; M. Hodgkin)) Diagnostische Kriterien basieren auf: Klinik Morphologie Patho-Histologie Immunphänotyp Genetik Zytogenetik Molekulargenetik 18

19 Zytogenetik Ein Teilgebiet der Genetik, das sich mit den Chromosomen als Ganzes beschäftigt. Metaphase Die lichtmikroskopisch erkennbare Form des Erbmaterials in der Phase der Zellteilung. 19

20 Mitose Wie sind die Chromosomen aufgebaut? Desoxyribonukleinsäure (DNA) 20

21 Chromosomenaufarbeitung Kultivierung der Zellen (24-72h) Stoppen der Mitose Zusatz von Colcemid (Spindelgift) arretiert Chromosomen in der Metaphase Hypotone Behandlung mit KCL Zusatz von Fixativ (Methanol-Essigsäure-Lösung) Heparin Auftropfen, Trypsin-Giemsa Bänderungn Analyse Idiogramm Karyogramm 21

22 p Zentromer q Chromosom 1 Chromosom 21 Chromosomenveränderungen - Strukturelle - Numerische 22

23 Strukturelle Chromosomenveränderungen Translokation Inversion Deletion Duplikation Numerische Chromosomenveränderungen Trisomie 21 23

24 Molekulare Zytogenetik Fluoreszenz In Situ Hybridisierung FISH 24

25 Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Interphase-FISH Deletion 22q11.2 Metaphase-FISH Deletion 22q11.2 Metaphase-FISH Locus spezifische Sonden Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Chromosom 4 Chromosom 6 Chromosom 12 25

26 Multicolor FISH (m-fish) 46,XY Komplex aberranter Karyotyp Molekulargenetische Analysen 26

27 Molekulargenetische Analysen PCR ( Polymerase Chain Reaction, PCR) basierte Analysen Real-time-quantitative PCR Fragmentlängenanalyse Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) DNA-Sequenzierung die Bestimmung der Nukleotiden-Abfolge in DNA Molekül Array-Analyse EDTA Warum Zytogenetik? -> AML Prognosegruppen Günstiger Karyotyp (unabhängig von weiteren zytogenetischen Veränderungen) t(15;17)(q22;q12) t(8;21)(q22;q22) inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) Intermediärer Karyotyp Alle Karyotypen, welche weder eine günstige noch eine ungünstige prognostische Bedeutung haben Ungünstiger Karyotyp Anomalien des Chromosoms 3q inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26) Anomalien der Chromosomen 5 oder 5q Anomalien der Chromosomen 7 oder 7q t(6;11)(q27;q23) t(10;11)(p11~13;q23) t(11q23) (ausgeschlossen: t(9;11)(p21~22;q23) und t(11;19)(q23;p13)) t(9;22)(q34;q11) -17/Anomalien des kurzen Armes von Chromosom 17 (17p) Komplexe Veränderungen ( 4 klonale Anomalien) 27

28 Molekulare Mutationen bei AML Mutation Häufigste Subtypen Häufigkeit Prognose NPM1 Nucleophosmin Normaler Karyotyp (55%) 30% günstig (wenn keine FLT3 Mutation) FLT3-LM FMS-Like Tyrosinkinase Normaler Karyotyp (40%) 20-25% ungünstig MLL-PTD Normaler Karyotyp (11%) Trisomie 11 (20-50%) 6,5% ungünstig CEBPA Normaler Karyotyp (7%) 4% günstig KITD816 t(8;21) (12%) 1,5% ungünstig KITexon8 inv(16) (10%) <1% ungünstig NRAS inv(16) (45%) inv(3)/t(3;3) (40%) 10% neutral KRAS inv(16); t(8;21) (5-20%) (bei Kindern) <1% prognost. Bedeutung unklar RUNX1 (AML1) AML FAB M0 (22%) Trisomie 21 (30%) 15% ungünstig IDH1/2 Normaler Karyotyp (30%) 15-20% ungünstig Zytogenetik Vorteile: Nachteile: Zusammenfassung - Whole genome approach (Erfassung von komplexen Karyotypen, Subklone, neu auftretende Anomalien in Verlaufskontrollen) - begrenzte Auflösung - Analyse ist auf Metaphasen beschränkt - relativ viel Untersuchungsmaterial erforderlich Molekulare Zytogenetik (FISH) Vorteile: - auf Interphasekerne möglich, keine Kultivierung erforderlich - geringere Materialmenge Nachteile: - Limitierung der Aussage auf die eingesetzte Sonde - Veränderungen im Verlauf werden nicht erfasst Molekulargenetik Vorteile: - keine Kultivierung erforderlich - geringere Materialmenge, Analyse auf der Ebene einzelner Basen möglich - sehr sensitiv 28

29 Es gibt keinen Gold Standard womit alle Erkrankungen der WHO Klassifikation definiert sind Morphologie ist immer wichtig und steht zu Beginn Immunphänotyp und Genetik sind ein wichtiger Teil der Definition hämatologischer Tumoren Einige Erkrankungen haben einen charakteristischen Immunphänotyp Für einige lymphatische und viele myeloische Neoplasien ist eine spezifische genetische Aberration das definierende Kriterium Andere genetische Aberrationen dienen als prognostische Faktoren 29

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