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1 Zur analytischen und medizinischen Bewertung der nicht- invasiven multiparametrischen Bestimmung der Leberfibrose und fibrogenese am Beispiel von Fibrotest und Actitest Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Zahnmedizin genehmigte Dissertation vorgelegt von Nina Beer aus Moers Berichter: Herr Privatdozent Dr.med. Olav A. Gressner Herr Universitätsprofessor Dr.med. Nikolaus Gaßler Tag der mündlichen Prüfung: 21. Oktober 2009 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

2 A Inhaltsverzeichnis I A Inhaltsverzeichnis B Abkürzungen 1 Einleitung Ätiologie und Pathogenese der Leberfibrose Epidemiologie und Therapieoptionen der Leberfibrose Diagnostik der Leberfibrose Invasive Verfahren Nicht- invasive Verfahren Fibrotest/ Actitest der Firma Biopredictive Testdurchführung Internetauftritt von Fibro-/ Actitest Fibrotest Form Fibrotest Actitest Technische Empfehlungen für Fibrotest- und Actitestanwendung Präanalytische Vorrausetzungen Untersuchungsmaterial Interferenzen Analytische Vorraussetzungen Vorsichtsmaßnahmen für den Gebrauch von Fibrotest Analytische Variabilität Externe Qualitätskontrollen 18 2 Fragestellung 20 3 Material und Methoden Theoretisch mögliche qualitätsgesicherte (Ringversuche) Analytkonzentrationen Berechnung der Fibrose- Scores auf der Grundlage externer Ringversuchsergebnisse der DGKL und INSTAND Kombinationsmöglichkeiten 27

3 A Inhaltsverzeichnis II 3.2 Mehrfachanalyse aliquotierter Seren von Patienten mit histologisch manifestierter Leberfibrose in ausgewählten medizinischen Laboratorien (interner Ringversuch) Beteiligte Laboratorien Analytik der beteiligten Laboratorien Kenngrößen und deren Analyseverfahren Haptoglobin Bilirubin Alanin- Aminotransferase (ALT) Gamma- Glutamyltransferase (GGT) Apolipoprotein A α2- Makroglobulin Durchführung der internen Ringversuche 39 4 Ergebnisse Ergebnisse der Berechnung von Außmaß (Fibrotest) und Aktivität (Actitest) der Leberfibrose auf der Basis subextremer Konstellationen von akzeptierten Ergebnissen bei (externen) Ringversuchen Ergebnisse der Mehrfachanalyse der aliquotierten Seren sowie deren Berechnung durch Fibrotest und Actitest (interner Ringversuch) 45 5 Diskussion Pathogenese der Fibrose Konventionelle Leberfibrosediagnostik durch invasive Methoden Die ideale klinisch- chemische Diagnostik Klinisch- chemische Diagnostik am Beispiel von Fibrotest und Actitest 52 6 Zusammenfassung 56 7 Literatur 59

4 A Inhaltsverzeichnis III 8 Anhang Danksagung Erklärung zur Datenaufbewahrung tabellarischer Lebenslauf 66

5 B Abkürzungen IV B Abkürzungsverzeichnis AC- Labor Aachen ALD- chronisch alkoholtoxische Lebererkrankung (Alcoholic Liver Disease) ALT- Alanin- Aminotransferase AST- Aspartat- Aminotransferase BMP-7- Bone Morphogenetic Protein 7 BN- Labor Bonn CT- Computertomographie CTGF- Connective Tissue Growth Factor D- Labor Düsseldorf DGKL- Deutsche Vereinigte Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.v. DPD- Dichlorphenyldiazoniumtetrafluoborat EBV- Epstein- Barr- Virusinfektion ECM- Extrazelluläre Matrix G-CSF- Granulocyte Colony- Stimulating Factor GGT- Gamma- Glutamyltransferase HAV- Hepatitis A Virus HBV- Hepatitis B Virus HCV- Hepatitis C Virus HDL- High Density Lipoprotein IFCC- International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine ING- Labor Ingelheim INR- International Normalized Ratio INSTAND- Institut für Standardisierung und Dokumentation im medizinischen Laboratorium e.v. K- Labor Köln Median- Medianwert MG- Labor Mönchengladbach MRT- Magnetresonanztomographie NAFLD- nicht- alkoholische Fettleberkrankheit (Non-Alcoholic Fatty Liver Disease)

6 B Abkürzungen V OE- Labor Bad Oeynhausen PDGF- Platelet Derived Growth Factor RES- Retikuloendotheliales System RMW- Referenzmethodenwert TGF- Transforming Growth Factor WHO- IFCC SP1-01- World Health Organization and International Reference Material

7 1 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Ätiologie und Pathogenese der Leberfibrose Die Leberfibrose ist eine Erkrankung, die durch die bindegewebige Umwandlung der Leber charakterisiert ist. Die Leber verliert ihre typische Architektur und damit auch die Funktion zum Stoffaustausch. Ätiologisch sind für die Entstehung einer Leberfibrose chronische Schädigungen verantwortlich, die viralen (chronische Hepatitiden), toxischen (chronische alkoholtoxische Hepatitis), autoimmunen, parasitären und metabolischen (Morbus Wilson) Ursprungs sein können (1). Die häufigsten Ursachen sind heutzutage die Virushepatitiden Typ C (und B) und der Alkoholabusus. Bei dieser Erkrankung entsteht ein Ungleichgewicht zwischen Fibrogenese und Fibroslyse. Exzessiv wird extrazelluläre Matrix produziert, die zu Störungen der Integrität der Hepatozyten und somit zu metabolischen Funktionsstörungen führen. Einerseits verursacht die massive Überproduktion von Bindegwebe eine Diffusionsbarriere und andererseits führt es zu Lumenreduzierungen mit hämodynamischen Konsequenzen. Histologisch dominiert septenbildendes Bindegewebe, besonders prädispositioniert ist der subendotheliale Disse- Raum. Zytokin- vermittelte Interaktionen der Leberzellen (z. B. Parenchymzellen) mit entzündlich infiltrierenden Zellen (z. B. Granulozyten) führen zur Mediatorenfreisetzung. Die Mediatoren, wie TGF-β, PDGF u. v. a., aktivieren im geschädigten Organ hepatische Sternzellen. Diese transdifferenzieren in der chronisch geschädigten Leber zu Myofibroblasten, welche die Fähigkeit besitzen übermäßig extrazelluläre Matrix (Bindegewebe) und auch Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren zu synthetisieren. Die extrazelluläre Matrix besteht aus Proteinen (Kollagen), strukturellen Glykoproteinen, Proteoglykanen und Glykosaminoglykanen (Hyaluron) und nimmt um das 6 bis 10fache zu (2).

8 1 Einleitung 2 Das Endstadium der Leberfibrose ist die Leberzirrhose, die im Gegensatz zur Fibrose durch einen kompletten Umbau charaktarisiert ist. Insbesondere sind bei der Zirrhose Pseudolobuli, Hepatozytendestruktionen und konsekutive Parenchymregenerationen zu finden. Als Folge der Leberzirrhose können Komplikationen wie Leberinsuffizienz, das hepatozelluläres Karzinom und die portale Hypertension auftreten (dekompensierte Zirrhose). 1.2 Epidemiologie und Therapieoptionen der Leberfibrose Die Inzidenz an Neuerkrankungen der Leberfibrose in den Industrieländern beträgt 250 pro Einwohner pro Jahr. Das Verhältnis von Männern zu Frauen ist 2:1 (3). Zurzeit ist die einzige kurative Behandlung der fortgeschrittenen (dekompensierten) Leberzirrhose die Lebertransplantation. Konservative Vorgehensweisen sind lediglich symptomatisch ausgerichtet. Daher hat die Leberfibrosediagnostik auch eine zentrale Bedeutung für die Beurteilung der Progredienz der Erkrankung. Therapien können somit frühzeitig und schnell fibrosestadien- orientiert begonnen werden. 1.3 Diagnostik der Leberfibrose Die Diagnose und Verlaufskontrolle von chronischen Lebererkrankungen basiert auf drei Säulen: 1. klinische Symptomatik 2. histologische Beurteilung des bioptisch gewonnenen Lebergewebes 3. labormedizinische Parameterkonstellation Die zur Verfügung stehenden labordiagnostischen Möglichkeiten werden im Einzelnen in den folgenden Abschnitten aufgeführt, ohne genauer auf die klinische Symptomatik einzugehen.

9 1 Einleitung Invasive Verfahren Leberbiopsie: Die Leberbiopsie ist heute immer noch, trotz hoher analytischer Variabilitäten, als Goldstandard für die Diagnostik und Klassifizierung der Leberfibrose/ Leberzirrhose anzusehen. Gleichzeitig können die Ätiologie und histologische Malignitätszeichen (z. B. ein sich entwickelndes Leberzellkarzinom) erkannt werden. Dennoch bestehen bei dieser diagnostischen Methode eine Vielzahl von Problemen: Das Entnahmegewebe ist nicht repräsentiv für den Fibrosegrad des ganzen Organs, da nur 1/ des Organs entnommen wird. Eine Studie von Bedossa et al. zeigt, dass nur 65% mit 15mm langen und 75% mit 25mm langen Biopsieproben richtig nach dem METAVIR- Score klassifiziert worden sind (4). Die Beurteilung des Punktats ist von der Erfahrung des jeweiligen Pathologen abhängig und unterliegt einer erheblichen Variabilität mit einer 33%igen Fehlerrate (5,6). Die Leberfibrosegenese ist ein Prozess, der heterogen in der Leber verläuft. Je nach Entnahmestelle kann sich ein anderes histologisches Bild der Fibrose, bzw. des Fibrosegrades darstellen. Für den Patienten ist die Leberbiopsie ein schmerzhafter und teurer Eingriff, der schwerwiegende Komplikationen, z. B. Blutungen, mit sich bringen kann. Eine Vielzahl von Klassifikationssystemen (Metavir, Scores nach Desmet & Scheuer, Knodell u.a.) erschweren die Vergleichbarkeit zwischen den histologischen Beurteilungen verschiedener Untersucher. Die Diagnostik durch die Leberbiopsie sollte daher immer kritisch im Kontext mit der klinischen Symptomatik betrachtet werden (6).

10 1 Einleitung Nicht- invasive Verfahren Labor: Blutparameter, die im Standardlabor bestimmt werden können, die aber nur indirekt mit der Pathogenese der Leberfibrose in Zusammenhang stehen, können als Klasse II Fibrosemarker bezeichnet werden. Diese Fibrosemarker wie z.b. Bilirubin, ALT, AST, Thrombozyten, Gamma- Glutamyltransferase, Cholesterol, α2- Makoglobulin, Haptoglobin, Apolipoprotein A1 sind bei lebererkrankten Patienten verändert. Klasse I Fibrosemarker sind direkt mit der Pathogenese der Leberfibrose verknüpft, da sie Bestandteile der extrazellulären Matrix sind. Dazu zählen: Bindegewebsrelevante Enzyme, Kollagene, Hyaluronan, Mediatoren, Glykoproteine und Glykoaminoglykane (7). Ein Potential bieten als Indikatoren für die Fibrosierung und für therapeutische Ansätze besonders TGF-β, BMP-7, CTGF/CCN2, Fibrozyten, G-CSF (8). Nicht- invasive Indices: Nicht- invasive Indices basieren gegenwärtig auf Klasse II Fibrosekenngrößen. Die analysierten Parameter werden mit Hilfe von Algorithmen und Formeln in einen Score umgerechnet, wie z.b. Fibrotest, Actitest, APRI- Index, FIB-4, Forns- Index, Wai- Index u. v. a.. Derzeit sind etwa 20 multiparametrische Scores empfohlen worden (7). Mittels des errechneten Ergebnisses können der Fibrosegrad und die fibrogene Aktivität der Leber bestimmt werden. Fibrotest/ Actitest ist eine diagnostische Kenngröße für Patienten mit chronischer Hepatitis C/B, chronisch alkoholtoxischer Hepatitis (ALD) und nicht- alkoholische Fettleberkrankheit (NAFLD) (9). Der bisher nicht publizierte Algorithmus basiert auf Patientenalter, Geschlecht, Datum der Analyse und folgenden Serumparametern: Haptoglobin, Gamma- Glutamyltransferase (GGT), Apolipoprotein A1, α2- Makroglobulin, Gesamt- Bilirubin. Für die Actitestberechnung wird zusätzlich noch die Aktivitätsbestimmung der Alanin- Aminotransferase (ALT) benötigt.

11 1 Einleitung 5 Die Klassifizierung erfolgt nach dem METAVIR- System. Die Spezifität für Fibrotest liegt bei 85% und die Sensitivität bei 75% (10). In der Übersichtsarbeit von Lörke et al. wurde eine Formel für die Fibrotestberechnung veröffentlicht (11). Fibrotest- Formel: F= 4,467 x log [α2- Makroglobulin (g/l)] -1,357 x log [Haptoglobin (g/l)] +1,017 x log [GGT (IU/l)] + 0,281 x [Alter (Jahre)] + 1,737 x log [Bilirubin (µmol/l) - 1,184 [Apolipoprotein A1 (g/l)] + 0,301 x Geschlecht (0 für weiblich, 1 für männlich)-5,540 Diese Formel stellte sich nach Überprüfung jedoch als fehlerhaft heraus. Der APRI- Index (WAI- Index) ist ein simpler Index, der sich aus der Ratio von AST/ Thrombozytenzahl x 100 zusammensetzt. Ein APRI < 0,50 bedeutet keine Fibrose, während der APRI- Wert > 1,50 auf eine signifikante Fibrose hinweist. 89% beträgt die Sensitivität und 75% die Spezifität für Patienten mit HCV (12). FIB-4- Index ist ein 3-Fibroselevel-Modell (Ishak 0-1,2-3,4-6) und besteht aus Alter, ALT, AST und Thrombozytenzahl. FIB-4-Index- Formel: Alter (Jahre)x AST (U/l)/ PLT (10 9/L) x ALT (U/l) ½) Bei Patienten mit HIV/HCV- Koinfektion soll der Index das Fibrosestadium bestimmen. Die Vorteile dieses Index sind die einfache Formel, die aus Parametern zusammengesetzt ist, welche in der Routine normalerweise bei lebererkrankten Patienten mitbestimmt werden. Die Werte der Indizes verlaufen von 0,2-10. Die Spezifität liegt bei 74% und die Sensitivität bei 70% (7,13,14). Forns- Index für HCV- Patienten setzt sich aus Patientenalter, Thrombozytenzahl, Gamma- Glutamyltransferase und Cholesterol zusammen.

12 1 Einleitung 6 Forns- Index- Formel: ln (platelet count) ln (GGT) ln (age) (cholesterol) Das Punktesystem verläuft von 0(= keine Fibrose) bis 10(= Zirrhose). Werte unter 4,21 bedeuten, dass keine signifikante Fibrose vorliegt und Werte über 6,9 weisen auf die Anwesenheit einer signifikanten Fibrose hin. Die Sensitivität liegt bei 94% und die Spezifität lediglich bei 51% (7,15). Bildgebende Verfahren: Sonographie, MRT, CT des Abdomens Andere Methoden: Transiente Elastographie, ein nicht- invasives Verfahren zur Diagnose einer Leberzirrhose. Die transiente Elastographie bestimmt die Lebersteifigkeit. Die Spezifität liegt bei 82% und die Sensitivität beträgt 90% (16). Nicht- invasive Verfahren müssen verlässlich, reproduzierbar, genau und einfach durchzuführen sein, um den Grad bzw. die Aktivität der Fibrose zu diagnostizieren und um den Therapieerfolg zu überwachen. Dadurch können kostspielige Diagnoseverfahren vermieden und der krankheitsspezifische Therapiebeginn beschleunigt werden. Fibrotest wird häufig in Studien als Alternative zur Leberbiopsie bei lebererkrankten Patienten erwähnt, mit einem diagnostischen Wert, der mit der Leberbiopsie vergleichbar ist (9,17) Fibrotest/ Actitest der Firma Biopredictive Die Firma Biopredictive, Paris (www. Biopredictive.com) bietet verschiedene nichtinvasive Tests zur Bestimmung des Leberfibrosegrads (Außmaß des fibrotischen Umbaus) und der nekrotisierenden- entzündlichen Aktivität in der Leber an. Bei Patienten mit chronischer HCV- Infektion soll es eine Alternative zur Leberbiopsie sein. Propagiert wird die Priorität ihrer Tests bei der Diagnose von Leberfibrose.

13 1 Einleitung 7 Fibrotest und Actitest sollten als erstes diagnostisches Ergebnis wegweisend für weitere Verfahren, z. B. die Leberbiopsie, durchgeführt werden. Die Ergebnisse von Fibrotest/ Actitest sollen in 80% der Patienten eine korrekte Klassifikation der Leberfibrose ermöglichen (18). Biopredictive wirbt mittels Informationsbroschüren mit der Anwendung von Fibrotest und Actitest bei Patienten, die schwierig zu biopsieren sind. Zu dieser Patientengruppe zählen laut Biopredictive, Kinder mit chronischer HCV Infektion, Patienten, die eine Behandlung mit erforderlicher Leberbiopsie ablehnen (und Patienten, welche vor Behandlung Genotyp 2 und 3 haben.) Diese Tests basieren auf Blutparametern, welche zu den Klasse II Fibrosemarkern zählen, die in einem patentierten nicht veröffentlichten Algorithmus verrechnet werden. Die nicht- invasiven Tests werden weltweit vertrieben und der Fibrosegrad kann via Internet (www.biopredictive.com) berechnet werden. Die Kosten pro Test (Fibro-/ Actitest) betragen Testdurchführung Der Ablauf der Testdurchführung vollzieht sich in vier Stufen für den Patienten. Stufe1: Ein Arzt verschreibt Fibro-/Actitest und dem Patienten wird venöses Blut abgenommen. Stufe 2: Die Patientenblutprobe wird in einem lokalen Laboratorium in seiner Nähe analysiert. Stufe 3: Die Analyseergebnisse werden Biopredictive übermittelt. Stufe 4: Analyseergebnisse werden sofort berechnet und der Leberfibrosegrad angezeigt.

14 1 Einleitung 8 Fünf Blutparameter müssen bestimmt werden, die in Kombination mit Alter, Geschlecht und Analysedatum in einem mathematischen Algorithmus berechnet werden (18). Bei diesen Blutparametern handelt es sich um: Haptoglobin Apolipoprotein A1 α2- Makroglobulin Gesamt Bilirubin Gamma- Glutamyltransferase Alanin- Aminotransferase Alle Testergebnisse werden anhand des METAVIR- Scoresystem klassifiziert. Tabelle 1: Metavir- Scoresystem. Die Tabelle zeigt den Zusammenhang zwischen den histologischen Veränderungen der Leberfibrose und dem Staging nach Metavir. Fibrosestadium Metavir 0 Keine Fibrose 1 Portale Faservermehrung 2 3 Portale Faservermehrung mit vereinzelten Septen Zahlreiche Septen ohne Zirrhose 4 Zirrhose

15 1 Einleitung Internetauftritt von Fibro-/ Actitest Fibro- und Actitest werden zusammen angeboten, die Web- Seiten dieser Tests sind identisch, bei jeder Berechnung werden beide Testergebnisse aufgeführt Fibrotest Form Please enter the required information in the form. Demographics Sex (Required) Female Male Birthdate (Required) 2008 / ---- Analysis Sample Date (Required) / June 2 / / Alpha2 Macroglobulin (g/l) (Required) Haptoglobin (g/l) (Required) Apolipoprotein A1 (g/l) (Required) Bilirubin (micromol/l) (Required) Gamma GT (IU/l) (Required) ALT (IU/l) (Required) Other Internal Reference Thank you to preserve patient's anonymity and never enter patient's name in the internal reference field Invoicing Code Abbildung 2: Fibrotest Form (Copyright Biopredictive). Abgebildet ist die Internetseite der Fa. Biopredictive (www.biopredictive.com) für die Testberechnung von Fibrotest und Actitest. Abkürzungen: ALT: Alanin- Aminotransferase

16 1 Einleitung Fibrotest Fibrotest ist ein analytischer Test zur Diagnostik und Verlaufskontrolle von Leberfibrose, bei Patienten mit chronischer Hepatitis B und C, HIV- Koinfektion, alkoholischen Lebererkrankungen und nicht-alkoholischer Fettleber (9). Der positive Vorhersagewert liegt bei >90% für Scores zwischen 0,60 und 1 (Fibrose vorhanden), und der negative prädiktive Wert bei 100% für Scores zwischen 0 und 0,1 (keine Fibrose vorhanden) (19). Beim Fibrotest wird auf die Analyse der Alanin- Aminotransferase verzichtet. Bei der Berechnung muß aber für Alanin- Aminotransferase nach den Richtlinien für die Anwendung der Tests die Zahl 3333 eingegeben werden. Im Ergebnisprotokoll ist eine Skala enthalten, die den errechneten Score und den Fibrosegrad angibt. Tabelle 2: Fibrotestergebnisse und Fibrosestadium. Dargestellt ist der Zusammenhang zwischen den errechneten Ergebnissen von Fibrotest und dem Fibrosestadium nach METAVIR. Fibrotest 0,75-1,00 F4 0,73-0,74 F3-F4 0,59-0,72 F3 0,49-0,58 F2 0,32-0,48 F1-F2 0,28-0,31 F1 0,22-0,27 F0-F1 0,00-0,21 F0 Fibrosestadium

17 1 Einleitung Actitest Mit Actitest kann nach Herstellerangaben die virale nekrotisierende- endzündliche Aktivität in der Leber bei Patienten mit chronischer Hepatitis C und B diagnostiziert werden. 6 Blutparameter werden bei der Testberechnung verwendet. Im Unterschied zu Fibrotest, hier wird zusätzlich die Aktivität der Alanin- Aminotransferase mitbestimmt. Die Zuordnung des Fibrosegrads nach Metavir zu den errechneten Ergebnissen zeigt folgende Tabelle. Tabelle 3: Actitestergebnisse und Aktivitätsgrad. Dargestellt ist der Zusammenhang zwischen den errechneten Ergebnissen von Actitest und dem Aktivitätsgrad nach Metavir. Actitest Nekroinflammatorisches Aktivitätsstadium 0,64-1,00 A3 0,61-0,63 A2-A3 0,53-0,60 A2 0,37-0,52 A1-A2 0,30-0,36 A1 0,18-0,29 A0-A1 0,00-0,17 A0

18 1 Einleitung Technische Empfehlungen für Fibrotest- und Actitestanwendung Für die Blut/- Serumanalysen empfiehlt Biopredictive gewisse technische Bedingungen zu befolgen, um die Richtigkeit und Qualität der Testergebnisse nicht zu gefährden. Diese Empfehlungen basieren auf dem Umgang mit der Blutprobe nach Entnahme, der analytischen Methode, dem Analysegerät, den Reagenzien und der Referenzmethode Präanalytische Vorrausetzungen Untersuchungsmaterial Das venöse Blut sollte in 5ml oder 7ml Röhrchen ohne Antikoagulantien gesammelt werden. Innerhalb von zwei Stunden nach der Blutentnahme muß die Blutprobe nach den Richtlinien des Röhrchenherstellers zentrifugiert werden. Sollten die Analysen nicht direkt erfolgen, kann das Serum für 72 Stunden bei +2 C bis +8 C lichtgeschützt gekühlt werden. Bei Te mperaturen von +2 C bis +8 C ist es nicht möglich die Analyse für α2- Makroglobulin, Haptoglobin und Apolipoprotein A1 später als 5 Tage Kühlung durchzuführen. Wenn das Serum von Beginn an bei -80 C tiefgefrohren wird, ist eine lä ngere Lagerung bis zur Analyse möglich. Einfrieren der Probe und wieder Auftauen kann nur einmal durchgeführt werden. Nach dem Auftauen muß das Serum nochmal für 10 Minuten zentrifugiert werden Interferenzen Interferenzen können bei lipidreichem Serum und bei Hämolyse entstehen. Hämolysierte und hyperlipämische Seren können nicht verwendet werden.

19 1 Einleitung Analytische Vorraussetzungen Die Parameteranalyse für die Fibro-/ Actitestberechnung kann in jedem Laboratorium, welches von Biopredictive anerkannt wird, durchgeführt werden. Die erforderlichen Qualitätsvoraussetzungen wurden von einem Referenzlaboratorium (Doctor Françoise Imbert- Bismut, Laboratoire de Biochimie du Groupe Hospitalier Pitié-Sapêtrière) und von einem Netzwerk aus französischen Biologen (RBML, geleitet von Dr. Philippe Halfon) definiert. Die autorisierten Laboratorien prüfen und akzeptieren die anzuwendenden Methoden, die Analysegeräte und die Reagenzienbestecke. Die Durchführung der Analytik ist für bestimmte Analysegeräte und unter den angebenden Bedingungen festgelegt. Unter Einhaltung dieser Konditionen kann die Fa. Biopredictive die Qualität von Fibrotest garantieren. Tabelle 4: Übersicht der analytischen Vorraussetzungen. Die Tabelle zeigt die Automaten, Verfahren und Reagenzien, die von der Fa. Biopredictive verifiziert sind und in dieser Untersuchung verwendet werden. Abkürzungen: CRM 470: Referenzmaterial für Serumproteine, GGT: Gamma- Glutamyltransferase, IFCC: International Federation Of Clinical Chemistry And Laboratory Medicine, NIST SRM 916a: NIST-National Institute of Standards and Technology, SRM 916a- Standard Reference Material, consists of a sample of unconjugated bilirubin that is certified as a chemical of known purity, WHO- IFCC SP1-01: World Health Organization and International Reference Material. Parameter Analyseautomat BN2 Dade- Behring Haptoglobin BN2 Dade- Behring Reagenzien Material/ Referenzmethode α2-makroglobulin Apolipoprotein A1 Modular Architect c8000 BN2 Modular Architect c8000 Roche Diagnostics Analytische Methode CRM 470 Nephelometrie g/l CRM 470 Nephelometrie g/l CRM 470 Turbidimetrie g/l Abbott CRM 470 Turbidimetrie g/l Dade- Behring Roche Diagnostics WHO-IFCC SP1-01 Nephelometrie g/l WHO-IFCC SP1-01 Turbidimetrie g/l Abbott WHO-IFCC SP1-01 Turbidimetrie g/l Einheit

20 1 Einleitung 14 Fortstzung Tabelle 4 Parameter Reagenzien Material/ Referenzmethode Gamma- Glutamyltransferase (GGT) Gesamt Bilirubin ALT Analyseautomat Hitachi 917 Modular Architect c8000 Hitachi 917 Modular Architect c8000 Hitachi 917 Modular Architect c8000 Roche Diagnostics Roche Diagnostics Abbott Roche Diagnostics Roche Diagnostics Methode gemäß der Referenzmethode nach IFCC Methode gemäß der Referenzmethode nach IFCC Referenzmethode IFCC Referenz-methode von Doumas Referenz-methode von Doumas Analytische Methode Methode gemäß der Referenz-methode nach IFCC Methode gemäß der Referenz-methode nach IFCC Methode gemäß der IFCC Kalibration Cfas Roche Diazoreaktionen: Jendrassik Grof modifiziert von Wahlefeld Malloy- Evelyn Diazoreaktionen: Jendrassik Grof modifiziert von Wahlefeld Malloy- Evelyn Einheit IU/l IU/l IU/l µmol/l µmol/l Abbott NIST SRM 916a Diazoreaktionen µmol/l Roche Diagnostics Roche Diagnostics Abbott Referenz-methode IFCC mit Pyridoxalphosphat Referenz-methode IFCC mit Pyridoxalphosphat Referenz-methode IFCC mit Pyridoxalphosphat Enzymatische Methode gemäß der Referenzmethode IFCC Enzymatische Methode gemäß der Referenzmethode IFCC Enzymatische Methode gemäß der Referenzmethode IFCC. Kalibration Cfas Roche IU/l IU/l IU/l In der Tabelle 4 sind nur die Analysegeräte, Methoden, und Reagenzien aufgeführt, die im Rahmen dieser Dissertation Verwendung finden. Zusätzlich wird das Analysegerät Dimension Vista/ Siemens benutzt. Nach Rücksprache mit Biopredictive sollten in diesem Fall die technischen Bedingungen von Dade- Behring erfüllt werden. Einschränkungen für die Durchführung der Analyse mit Dimension Vista sind nicht vorhanden. Statt des Architect c8000/ Abbott wird von einem Laboratorium der Architect ci8200/ Abbott zur Analyse eingesetzt. Auch in diesem Fall sind keine Besonderheiten zu beachten. Die technischen Empfehlungen sind mit Architect c8000/ Abbott vergleichbar.

21 1 Einleitung Vorsichtsmaßnahmen für den Gebrauch von Fibrotest Der nachfolgende Absatz stützt sich auf die Herstellerangaben der Fa. Biopredicitive. Die Benutzer dieser Tests sollten sich, unter Beachtung der verschiedenen Risikofaktoren für falsch positive und falsch negative Ergebnisse, der Vorsichtsmaßnahmen für die Testinterpretation bewusst sein. Daher müssen die präanalytischen und analytischen Empfehlungen für die Analysegeräte und die verwendeten Reagenzien befolgt werden. In bestimmten Situationen ist der Test zurückzustellen, wenn folgende Einflußgrößen gegeben sind: akute Hämolyse, die Haptoglobin verringern und unkonjugiertes Bilirubin erhöhen kann. Verursacht durch Malaria oder Medikamente, die zur Hämolyse führen (Ribavirin, Azathioprine). akute Hepatitis, durch Drogen, viral (Superinfektion von HAV, HBV, EBV) oder autoimmun induziert. Massive hepatische Nekrosen führen zu einem hohen Anstieg der Transaminasen und des Gesamt- Bilirubin. akute Entzündungen, wie begleitende bakterielle oder akute virale Infektionen: bronchopulmonale Infektionen oder Harnwegsinfektionen bewirken Erhöhungen von Haptoglobin, die zu falsch negativen Ergebnisse führen. die extrahepatische Cholestase, wie Gallensteine. Die Meinung eines Hepatologen sollte für die Interpretation chronischer Stadien der Leberfibrose, bei denen die Parameter der Tests modifiziert sein können, hinzugezogen werden, wie bei: chronischer Hämolyse, besonders bei Patienten mit Herzklappenprothesen. Morbus Gilbert-Meulengracht (Gilbert`s disease), wobei Fibrotest und Actitest unter Verwendung des Mittelwertes des beobachteten Fibrotest in der ursprünglichen Studie berechnet werden sollten.

22 1 Einleitung 16 einer HIV- Therapie mit dem Einsatz von Proteaseinhibitoren. Unkonjugiertes Bilirubin oder GGT können durch Indinavir und Atazanavir erhöht sein, gleiches gilt für ALT (Ritonavir). Die Fibrotestinterpretation ist auch für Nierentransplantationspatienten validiert worden. Der diagnostische Wert von Fibrotest für Patienten mit Niereninsiffizienz und für dialysepflichtige Patienten ist zwar akzeptabel, jedoch geringer als für transplantierte Patienten. Daher müssen noch weitere Studien durchgeführt werden. Generell sollte das Testergebnis bei einzelnen Extremwerten mit Vorsicht interpretiert werden. Besonders sind folgende Fälle zu beachten: Haptoglobinkonzentrationen, die kleiner als 0,12 g/l sind. Eine Hämolyse sollte ausgeschlossen sein. Haptoglobinkonzentrationen, die größer als 3,2 g/l sind. Akute Entzündungen oder Sepsis sollten in dem Fall ausgeschlossen sein. Transaminaseaktivitäten, die höher als 622 IU/l sind, dabei sollte eine akute Hepatitis ausgeschlossen werden. Bilirubinkonzentrationen, welche höher als 30 µmol/l und GGT- Werte, die kleiner als 50 IU/l sind, bei dem das Gilbert Syndrom vermutet wird. Die Testinterpretation ist nicht für Lebertransplantationpatienten validiert. 1.7 Analytische Variabilität Diese technischen Empfehlungen über die Analysatoren, Methoden und Referenzen sind für die Übertragbarkeit der Testergebnisse von entscheidender Bedeutung. Trotz der technischen Vorgaben, sind immer noch Variabilitäten bei der Analyse der Serumparameter für Fibro-/ und Actitest vorhanden. Eine analytische Variabilität besteht bei den Fibrotest- und Actitestproteinen Apolipoprotein A1 und α2- Makroglobulin bei unterschiedlich verwendeten

23 1 Einleitung 17 analytische Techniken, welche jedoch im Routineeinsatz im Labor benutzt werden. Die Ergebnisse für α2- Makroglobulin sind signifikant höher bei der Analyse mit dem Analyseautomaten Immage als mit dem BNProspec. Der wichtigste Einzelparameter zur Vorhersage von einer signifikanten Fibrose ist α2- Makroglobulin, welcher auch großen Einfluss auf das Fibrotestergebnis haben muß (20). Auch das Analyseergebnis für Apolipoprotein A1 ist abhängig von dem verwendeten Analysegeräten. Ein Vergleich zwischen den Analyseautomaten Immage (Beckman- Coulter) und BNProspec (Dade- Behring) ergab geringere Werte für Apolipoprotein A1 bei der Analyse mit dem Immage. Dennoch sind die Auswirkungen auf das Fibro- und Actitestergebnis sehr gering. 2 von 107 Patienten zeigten eine größere Abweichung von >0,1 bei dem Fibrotest (21). Eine australische Studie von Enrico Rossi untersuchte Fibrotest mittels Vergleich zur Leberbiopsie und ermittelte einen positiven prädiktiven Wert von 66% und einen negativen prädiktiven Wert von 96%. Französische Wissenschaftler, die Fibrotest mitentwickelt haben, veröffentlichten einen negativen prädiktiven Wert von 100% und einen positiven prädiktiven Wert von 91% (22). Begründet wurden die Differenzen zwischen den Ergebnissen mit unterschiedlichen Analysebedingungen. Rossi et al. verwendeten für die automatische nephelometrische Analyse von Haptoglobin, α2- Makroglobulin und Apolipoprotein A1 Beckman Immage, anstatt des validierten Orginalanalyseautomaten Dade- Behring/ BN2 (20). Die inter- laboratorielle Variabilität zwischen 8 Laboratorien in Bezug auf Fibrotest und Actitest wurde mit Hilfe der Analyten Gamma- Glutamyltransferase (GGT) und Alanin- Aminotransferase (ALT) untersucht (23). Der Hauptfaktor für eine Variabilität dieser Analyte wurde durch die Verwendung unterschiedlicher Einheiten begründet (international units [IU] und the upper limit of normal [ULN]). Die standardisierte Analysemethode für Alanin- Aminotransferase (ALT) mit Pyridoxalphosphat und die standardisierte originale Analysemethode nach Szasz

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