Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft

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1 Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft Quantitative Bestimmung transgener Bestandteile in Pflanzen, Saatgut und Futtermitteln Dr. S. Domey März 2008 Thüringer Ministerium für Landwirtschaft, Naturschutz und Umwelt

2 Quantitative Bestimmung transgener Bestandteile in Pflanzen, Saatgut und Futter ter- mitteln Dr. Sabine Domey und Dr. Werner Reichardt Einleitung Anfang Juli dieses Jahres plädierte das Europäische Parlament im Einklang mit den Vorgaben der EU-Agrarminister dafür, eine Kennzeichnungspflicht für Lebens- und Futtermittel einzuführen, die mehr als 0,9 % gentechnisch veränderte Organismen (GVO) enthalten, aus GVO bestehen oder Bestandteile besitzen, die gentechnisch hergestellt wurden. Das gilt auch für zufällig mit gentechnisch verändertem Material verunreinigte Lebens- und Futtermittel (MASCHKOWSKI, 2003). Im Vorfeld solcher Regelungen sollten innerhalb dieses Projektes methodische Voraussetzungen zur Quantifizierung von GVO in Pflanzenmaterial bzw. Saatgut geschaffen werden. Ziel war es deshalb, durch den Vergleich verschiedener kommerzieller Kits eine geeignete Methode zur Extraktion hochreiner DNA zu etablieren, verschiedene Kits zur quantitativen Bestimmung von GVO-Mais und -Soja auf ihre Eignung zu prüfen und eigene Primer-Sonden-Systeme für den Nachweis von GVO-Raps, für den noch kein Testbesteck auf dem Markt erhältlich ist, zu entwickeln und zu testen. Theoretische Grundlagen GVO-Linien bei Mais, Soja und Raps Derzeit gibt es weltweit 20 Linien von gentechnisch verändertem Mais, 14 Linien GVO- Raps und fünf Linien GVO-Soja. Bei den gentechnischen Veränderungen handelt es sich bei Mais vorrangig um gentechnisch erzeugte Herbizid- und/oder Insektenresistenz, bei Soja und Raps vorrangig um induzierte Herbizidresistenz bzw. eine gentechnisch veränderte Fettsäurezusammensetzung. Für die Resistenz gegenüber dem Herbizid Glufosinat, unter dem Handelsnamen Basta und Liberty Link bekannt, wurde in Mais, Raps und Soja das PAT-Gen aus Streptomyces viridochromogenes bzw. das bar-gen (Bialophos 1 - Resistenz-Gen) aus Streptomyces hygrocopicus eingebaut, die beide für eine Phosphinothricin-Acetyl-Transferase (PAT) codieren. Dieses Enzym acetyliert Phosphinothricin ((D2-Homo-alanin-4-(methyl)-phosphinsäure), den Wirkstoff des Glufosinats. Acetyliertes Glufosinat kann den Rezeptor der Glutaminsynthetase nicht mehr besetzen und wirkt daher nicht mehr herbizid. (Es erfolgt keine kompetitive Hemmung der Glutaminsynthetase mehr, und damit kommt es nicht mehr zur Anhäufung von Ammonium in den Zellen und folglich nicht mehr zum Zelltod [REICHARDT, 2000 unveröffentlicht]). In einigen Linien von GVO-Raps sowie in einer Linie von GVO-Soja wurde eine Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat mit dem Handelsnamen Roundup Ready TM RR transferiert. Der Wirkstoff des Glyphosats ist das Isopropylammoniumsalz von N-(Phosphonomethyl)-glycin. Glyphosat hemmt das Enzym 5-Enol-Pyruvyl-Shikimi-3-Phosphat-Synthase (EPSPS), das für die Synthese spezieller aromatischer Aminosäuren zuständig ist. RR- 1 Bialophos: Tripeptid, aus Bodenbakterien Streptomyces spp. isoliert, zur Synthese von Phosphinothricin herangezogen Untersuchungsbericht

3 toleranter Raps und Soja enthalten u. a. ein Gen aus Agrobacterium sp. Stamm CP4, das für eine Glyphosat-tolerante EPSPS codiert (REICHARDT, 2000 unveröffentlicht). Einige, u. a. drei von vier in Europa für Versuchszwecke zugelassene GVO-Maislinien enthalten ein Gen aus Bacillus thuringiensis (Bt) für Insektenresistenz gegen den Maiszünsler. Dazu gehören die GVO-Maislinien Bt176, Bt11 und MON810. Während Bt176 zusätzlich das bar-gen für Herbizidresistenz und Bt11 zusätzlich das PAT-Gen besitzt, steht MON810 allein für Insektenresistenz. Die vierte in der EU für Versuchszwecke zugelassene Linie, T25-Mais, ist infolge des transferierten PAT-Gens ausschließlich herbizidresistent. Alle diese vier GVO-Maislinien sowie RR-Soja enthalten einen 35S-Promotor 2 aus dem Blumenkohlmosaikvirus, der dem entsprechenden Resistenz-Gen vorgeschaltet ist. Es können demzufolge sowohl Nachweissysteme, die nur die Anwesenheit des 35S- Promotors detektieren, als auch Nachweismethoden, die die spezifische gentechnische Veränderung erfassen, eingesetzt werden. Nach dem 35S-Screening können 16 von den bisher 20 bekannten transgenen Maislinien ermittelt werden. Zwei der vier verbleibenden transgenen Maislinien sind in einem zusätzlichen Screening auf die Anwesenheit des NOS-Terminators 3 erkennbar (LAG, 2001). Bei GVO-Rapslinien, die ebenfalls den 35S- Promotor enthalten, ist kein 35S-Screening möglich, da Raps infolge der Verwandtschaft als Kreuzblütler naturgebunden mit dem Blumenkohlmosaikvirus befallen sein kann und damit zwangsläufig zu falsch-positiven Resultaten führen würde. Hier ist ausschließlich nach den spezifischen Genkonstrukten zu fahnden. Real-Time Quantitative PCR Die modernste Methode der Quantifizierung von Nukleinsäuren ist die Real-Time (Echtzeit) Quantitative PCR 4, d. h. im Gegensatz zur qualitativen PCR, wo lediglich Informationen über den Endzustand der PCR, also über das gebildete Amplifikat 5 erhältlich sind, werden bei der Real-Time PCR alle Daten während des gesamten Prozesses (über alle Zyklen) dokumentiert. Für die Bestimmung nutzt man die Kinetik der PCR-Reaktion, die während der frühen Zyklen der PCR eine exponentielle Vermehrung der DNA-Fragmente beinhaltet. Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen der Anfangskonzentration des Targets 6 und der Menge des Amplifikats zu frühen Zyklen (Abb. 1 und 2), der sich mathematisch wie folgt darstellt: Y = K * (1 + E) n bzw. log Y = n + log(1 + E) + log K Y: Menge an Amplifikat K: Anfangskonzentration des Targets E: Effizienz der Reaktion n: Anzahl Reaktionszyklen 2 35S-Promotor: DNA-Sequenz, welche die Startstelle der Transkription eines Gens darstellt 3 Terminator: Sequenzabschnitt auf der DNA, der das Ende eines Gens des Transkriptionsvorganges anzeigt 4 PCR: Polymerasekettenreaktion, Prozess zur Vervielfältigung der transgenen Veränderung 5 Amplifikat: syn. für Amplikon: DNA-Abschnitt, der in einer PCR vervielfältigt wurde 6 Target: einzelsträngige Ziel-DNA, die als Matrize dient Schriftenreihe der TLL 144

4 Anders als bei der qualitativen PCR macht man sich bei der Real-Time QPCR außer der Hybridisierungsleistung zusätzlich die Exonucleaseaktivität der AmpliTaqGold TM Polymerase zu nutze (vgl. Pkt. TaqMan -PCR). TaqMan -PCR Bei der TaqMan -PCR wird neben den üblichen PCR-Primern 7 eine spezifische Oligonukleotid Sonde, die an die Zielsequenz bindet, zugesetzt. Diese Sonde ist mit einem fluoreszierenden Reporterfarbstoff am 5`-Ende und einem fluoreszierenden Quencherfarbstoff am 3`-Ende markiert. Das Licht (Laser) regt den Reporterfarbstoff zur Fluoreszenzstrahlung an. Bei räumlicher Nähe zwischen Reporter und Quencher wird die emittierte Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs durch den Quencher reduziert (gequencht). Bindet die Sonde (Hybridisierung) während der PCR an die Zielsequenz, hebt die Ampli- TaqGold TM Polymerase die hybridisierte Sonde zu einer y-förmigen Struktur an, und die Exonucleaseaktivität führt zu Hydrolyse der Sonde. Dadurch erfolgt eine räumliche Trennung zwischen Quencher und Reporterfarbstoff (Abb. 3). Die Intensität des Reporterfarbstoffs steigt an. Außerdem endet die Synthese des Gegenstrangs. In jedem PCR- Zyklus werden neue Reportermoleküle freigesetzt, die Fluoreszenzemission steigt zunächst proportional zur Anzahl der PCR-Amplifikate an. Aus dem Anstieg der Reporterfluoreszenz während der PCR-Zyklen kann die Quantität des PCR-Amplifikats zur Ausgangs-DNA-Menge berechnet werden (vgl. Pkt. Real-Time QPCR.; REICHARDT, 1999). Da eine Hydrolyse der TaqMan TM -Sonde durch die 5`-3`-Exonucleaseaktivität der Ampli- TaqGold TM Polymerase nur dann erfolgen kann, wenn es zu einer sequenzspezifischen Hybridisierung zwischen Sonde und Template 8 kommt, wird das Fluoreszenzsignal nur erzeugt, falls eine Amplifikation der Zielsequenz stattfindet. Das heißt, dass andererseits keine unspezifischen Nebenprodukte detektiert werden (SCHILD, 1997). Abbildung 1 und 2: Prinzip und Grundbegriffe der Real-Time PCR (QIAGEN, 2001) CT: Threshold cycle = Schwellenwert-Zyklus, Zyklenzahl bei der das Fluoreszenzsignal erstmals den Schwellenwert erreicht (Threshold - Trennlinie zur Unterscheidung zwischen signifikanter Zunahme der Fluoreszenz und der Hintergrund-Fluoreszenz) 7 Primer: Starter, einzelsträngiges Oligonukleotid (DNA-Fragment), das zu einer einzelsträngigen Nukleinsäure komplementäre Sequenzen aufweist und mit diesen zu einem Doppelstrang hybridisiert 8 Tmplate: einzelsträngige Ziel-DNA, die als Matrize dient Untersuchungsbericht

5 Abbildung 3: Prinzip der TaqMan Chemie (Applied Biosystems, 2002) Absolute Quantifizierung Bei der absoluten Quantifizierung wird dem gemessenen Signal eine bestimmte Startkopienzahl oder Konzentration zugeordnet. Dabei besitzt der Standard die gleiche Sequenz wie die zu quantifizierende Zielsequenz (gleiche Basenfolge, dieselben Primer, gleiche Amplifikatlänge). Die Berechnung des entsprechenden GVO-Anteils erfolgt anhand einer Standardkurve. Relative Quantifizierung Bei der relativen Quantifizierung wird die transgene Zielsequenz relativ in Expression zu einem Referenz-Gen, meist Housekeeping-Gen 9 bestimmt. Dabei werden sowohl für das Transgen als für das Referenz-Gen zwei getrennte Standardkurven angelegt. Der relative GVO-Anteil errechnet sich aus dem Verhältnis der Kopienzahlen zwischen Transgen und Referenz-Gen. 9 Housekeeping-Gen: Gen, das universell in der entsprechenden Pflanzenart vorkommt Schriftenreihe der TLL 146

6 Material und Methoden Die Eignungsprüfung der DNA-Extraktionskits erfolgte mit Blatt- und Samenproben von transgenem Raps unter Nutzung von zehn verschiedenen Kits (REICHARDT, 2002). Die Konzentration und Reinheit der DNA wurde spektrophotometrisch untersucht. Für die Quantifizierungsversuche sind alle vier verfügbaren GMO-Quantification 7700 Detection Systems der Firma GeneScan sowie die zwei 35S-Promotor-Nachweissysteme von Applied Biosystems für Mais und Soja herangezogen worden. Die Untersuchung von Bt176-, MON810- und T25-Mais erfolgte jeweils dreimal, die verschiedenen 35S- Systeme für Mais und Soja wurden jeweils nur einmal geprüft. Die Durchführung und Auswertung der quantitativen PCR entsprach den Protokollvorschriften der Anbieter. Es handelte sich hierbei um eine relative Quantifizierung, indem der Anteil des Transgens in Relation zu einem Housekeeping-Gen ermittelt wurde. Zur Testung dienten die von der Firma FLUKA gehandelten Bt176-, Bt11- und MON810- Mais- sowie die RR-Soja- Standards mit 0,1, 0,5, 1, 2 und 5 %. Auf Grundlage der Kenntnis der Sequenz des synthetischen PAT-Gens bei Raps (GS 40/90) konstruierte die Primer-Express -Software von Applied Biosystems verschiedene Primer-Sondensysteme, von denen vier auf ihre Eignung anhand selbst hergestellter Standards (aus GS 40/90) getestet wurden. Weitere quantitative Nachweise zum 35S/pat-Genkonstrukt verliefen im Rahmen eines LAG 10 -Ringvorversuches entsprechend der SOP sowie nach der Schweizer Methode von NICHOLAS und BRODMANN (2001). Ergebnisse und Diskussion In Auswertung der methodischen Untersuchungen zur Gewinnung ausreichender Mengen reiner DNA aus Blatt- und Samenproben von Raps erwiesen sich von insgesamt zehn getesteten Extraktionsbestecks die Plant-Kits der Firma QIAGEN, Macherey/Nagel sowie PEQLab als geeignet (REICHARDT, 2002). Deshalb wurde für alle nachstehend angestellten Experimente im Rahmen der Quantifizierung von GVO in Saatgut zunächst der Plant Mini-Kit der Firma QIAGEN eingesetzt, für spätere Untersuchungen der noch höhere Einsatzmengen gestattende und bessere DNA-Ausbeuten liefernde NucleoSpin Plant Mini-Kit von Macherey/Nagel. Im Folgenden (Tab. 1 und 2) sind die wichtigsten Ergebnisse der relativen Quantifizierung von GVO-Saatgut aus den Real-Time-Experimenten mit dem ABI Prism 7700 Sequenzdetektor zusammengefasst. Der Nachweis der GVO-Anteile in Mais bzw. Soja gibt Auskunft über die Nachweisqualität der kommerziell erhältlichen Kits der Firma GeneScan und Applied Biosystems. Die ausführlichen Daten finden sich im Zwischenbericht (REICHARDT, 2002). 10 LAG: Länderausschuss Gentechnik, Unterausschuss Methodenentwicklung Untersuchungsbericht

7 Tabelle 1: Nachweis verschiedener GVO-Anteile in Mais- und Soja-Standards von FLUKA mit den GMO- Ident-Kits der Firma GeneScan (DNA Quantification System 7700, Kopienzahlmethode) Bt176- Mais Bt176- Mais* MON810- Mais MON810- Mais MON810- Mais RR-Soja * + Sollwert % GVO 35S- Promotor Mais GVO-Anteil in % ,028 0 n. b. 0 * 0 0,1 0 0,16 0,16 0,25 0,16 0,12 * 0,08 0,41 0,5 0,73 1,06 1,60 1,59 0,82 0,96 * 0,75 1 0,28 0,88 2,18 2,26 1,79 2,98 * 1,27 1,65 ** 2 0,88 1,14 5,04 1,09 n. b. 4,39 * 2,48 2,98 ** 5 2,22 4,87 4,70 10,36 n. b. 13,57 * 5, ,57 49,03 n. b. ++ n. b. n. b *** Bt176-Standards FLUKA, *** Bt11-Standards FLUKA, *** T25, nicht im Zwischenbericht 2002 enthalten, ++ n. b. = nicht bestimmt n. b. Tabelle 2: Nachweis verschiedener GVO-Anteile in Mais und Soja mit dem TaqMan GMO Detection and Quantification Kit von Applied Biosystems (Nachweis des 35S-Promotors, CT-Methode) Sollwert (% GVO) 35S-Promotor Mais 35S-Promotor Soja GVO-Anteil in % 0 0,29 a 0,02 e 1 1,33 b n. b. 2 2,27 b n. b ,22 c n. b ,45 d n. b. ~ 4 n. b. 11,37 f ~ 0,3 n. b. 0,43 g ~ 3 n. b. 3,14 h a Th14-54 (konv. Mais), b Bt11-Standard FLUKA, c T25 zu 50 % verdünnt mit Th14-54, d Bt176, e R2S2-N - Sojaprobe aus Ringversuch, f GTS-Eichhof., g R2S1-N - Sojaprobe aus Ringversuch, h R2S3-N- Sojaprobe aus Ringversuch Aus Tabelle 1 und 2 geht hervor, dass die beiden 35S-Kits der Firma Applied Biosystems unter Verwendung der FLUKA-Mais- bzw. Soja-Standards durch Anwendung der CT- Methode eine bessere Übereinstimmung der ermittelten Werte mit den Sollwerten garantieren als die Kits von GeneScan, deren Berechnung auf kiteigenen Standards basiert. Die besten Ergebnisse wurden für RR-Soja erzielt. Eine Ursache für dieses Verhalten kann in der unterschiedlichen Extrahierbarkeit der DNA begründet sein, Soja erbringt deutlich höhere DNA-Ausbeuten als Mais. Bt176-Mais ließ sich besonders schlecht extrahieren. Ein weiterer Grund besteht in der Instabilität der DNA in den Maisstandards, weshalb FLUKA diese Produkte vorübergehend vom Markt genommen hatte und sie nach Veränderung des Herstellungsverfahrens, das eine höhere DNA-Stabilität gewährleistet, neuerdings wieder anbietet. Die Testung kommerziell verfügbarer Kits zur Quantifizierung von Mais wurde mit dem DNA Quantification System 7700 von der Firma GeneScan für T25-Mais abgerundet. Tabelle 3 beinhaltet die Ergebnisse der letzten von drei unternommenen Untersuchungen. Schriftenreihe der TLL 148

8 Tabelle 3: Nachweis verschiedener GVO-Anteile in T25-Mais (FLUKA-Standards) mit dem GMO- Ident-Kit der Firma GeneScan (DNA Quantification System 7700, Kopienzahlmethode) Variante GVO-Anteil (%) Standardabweichung CRM 1 % 1,4 0,47 N-Mais 0 % 0 - T25 0,1 % * 0,13 0,11 T25 0,5 % * 0,5 0,1 T25 1 % * 0,9 0,2 T25 2 % * 1,8 0,29 T25 5 % * 5,6 0,37 T % * 118,9 2,55 * kein FLUKA-Standard; E Standardreihe Transgen = 98,0 %; E Standardreihe Referenzgen = 96,8 %; CRM externe Positivkontrolle Für T25-Mais konnte eine sehr gute Übereinstimmung mit den GVO-Sollwerten gefunden werden. Die Effizienzen der PCR für Transgen und Referenz-Gen, die sich aus der Steigung der entsprechenden Standardkurve berechnen, lagen übereinstimmend bei 97 bis 98 % und zeigten an, dass nahezu bei jedem Zyklus der PCR eine Verdopplung des jeweiligen Amplikons stattgefunden hatte. Die Ursache für das vergleichsweise gute Ergebnis könnte darin liegen, dass hier wegen des Fehlens entsprechender T25-FLUKA- Standards mit eigenen Standards, die aus T25- und konventionellem Maismehl frisch vor Beginn des Versuches hergestellt worden sind, gearbeitet wurde. Da kommerziell bisher keine Nachweissysteme zur Quantifizierung von GVO-Raps zur Verfügung stehen, sind basierend auf der bekannten Sequenz des synthetischen PAT- Gens drei Primersysteme und vier Sonden für den TaqMan -Nachweis von Primer- Express (Software) der Firma Applied Biosystems vorgeschlagen worden. Da zum Zeitpunkt dieser Untersuchungen lediglich Kenntnis über die Sequenz des synthetischen PAT-Gens vorlag, nicht aber über die Sequenz des Referenz-Gens (pep/phosphoenolyruvat-carboxylase-gen), konnte jeweils nur ein System für die absolute Quantifizierung des Transgens konstruiert werden. Die charakteristischen Sequenzen und Eigenschaften für Primer und fluorogene Sonden sind im Zwischenbericht (REICHARDT, 2002) dokumentiert. Die Prüfung der vier Systeme erwies sich leider als erfolglos. Während die Sonde QCAN7-FAM offensichtlich überhaupt nicht am DNA-Strang binden konnte, reagierten die anderen drei Primer-Sondensysteme völlig unspezifisch und sind für den geforderten Nachweis des PAT-Konstruktes nicht geeignet. Die CT-Werte unterschieden sich in allen Proben, einschließlich der Template-DNA-freien Kontrollen, nicht wesentlich voneinander. Vermutlich hatten sich hier Primer-Sondendimere gebildet, die durch die Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase geschnitten wurden und so letztendlich in einer Detektion resultierten. Wahrscheinlicher ist allerdings eine fehlerhafte Informationsübermittlung über die Sequenz des synthetischen Pat-Gens, die keinen spezifischen Nachweis erlaubt. Eine gute Alternative für die absolute Quantifizierung des 35S/pat-Gens bildet die Methode von NICHOLAS und BRODMANN (2001) aus der Schweiz. Der Nachweis der Funktionalität dieses Systems erfolgte in Analogie zur Methodenvorschrift stellvertretend für alle 35S/pat-transformierten Pflanzenlinien zunächst mit T25-Mais. Abbildung 4 gibt Auskunft über die Regressionsgerade unter Einbeziehung verschiedener T25-Standards, Untersuchungsbericht

9 die aus DNA-Extrakten von T25-Mais und konventionellem Mais selbst hergestellt wurden. Die PCR verlief hocheffizient (E = 0,998)! Abbildung 4: Standardkurve für die absolute Quantifizierung von 35S/pat transformierten Pflanzenlinien am Beispiel von T25-Mais (Methode nach NICHOLAS u. BRODMANN, 2001) E = 0,998 (E = 10 1/Steigung 1) Eine weitere Möglichkeit zum erfolgreichen quantitativen Nachweis des CaMV 35S/pat- Genkonstruktes mittels TaqMan PCR bietet die Methode von HESS und NÄUMANN (2002, Entwurf, unveröffentlicht). Diese Methode wurde im Rahmen eines Ringvorversuches des Unterausschusses Methodenentwicklung des LAG von 13 Labors getestet. Die detaillierten Werte des TLL-Labors (Nr. 6) sind in Tabelle 4 dargestellt. Abbildung 5 veranschaulicht die Ergebnisse aller Labors. Tabelle 4: Absolute Quantifizierung von CaMV 35S/pat transformiertem Raps mittels TaqMan PCR nach der Methode von HESS und NÄUMANN (2002) Probe Sollwert ermittelter Anteil MW Standardabweichung GVO % GVO (%) GVO (%) Standard Standard Standard 3 0, Standard 4 0, P1 P1 P1 2 2,1 1,9 2,2 2,07 0,15 P2 P2 P2 P3 P3 P3 1 0,5 0,97 0,69 1,2 0,5 0,45 0,34 0,95 0,26 0,43 0,08 Schriftenreihe der TLL 150

10 CaMV 35S/PAT Quantifizierung 3,5 3 Gehalt (%) 2,5 2 1,5 1 Reihe1 Reihe2 2% Reihe3 0, Labor-Nr. Abbildung 5: Vergleichende Betrachtung der Ergebnisse von 13 Labors zum quantitativen Nachweis des CaMV 35S/pat-Genkonstruktes in Raps mittels TaqMan PCR (HESS und NÄUMANN, 2002, unveröffentlicht) Im vergangenen Jahr veröffentlichten ZEITLER (2002) und Mitarbeiter eine Methode zur relativen Quantifizierung von transgenem Raps, die sowohl den Nachweis des Pat-Gens für Bastaresistenz als auch des EPSPS-Gens für Roundup-Ready-Resistenz ermöglicht. Als Referenzsystem für die Quantifizierung der gesamten genomischen DNA dient das pep-gen, das das Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxylase codiert. Schlussfolgerungen Da die Prüfung der DNA-Extraktionskits die besten Werte in Bezug auf DNA-Ausbeute und DNA-Reinheit für den Plant Mini-Kit der Firma QIAGEN und den NucleoSpinPlant Mini-Kit von MACHEREY/NAGEL lieferte, sind diese Kits für alle Folgeuntersuchungen herangezogen worden. Für künftige Untersuchungen sollte der diesbezüglich am besten geeignete NucleoSpinPlant Mini-Kit favorisiert werden. Die Testung verschiedener Kits bzw. Methoden zur Quantifizierung von GVO-Soja, - Mais und Raps erlaubt den Schluss, dass alle geprüften Kits der Firma GeneScan und Applied Biosystems gute Resultate liefern und für anstehende Quantifizierungsaufträge genutzt werden können. Die für den quantitativen Nachweis des PAT-Konstrukts in GVO-Raps selbst konstruierten vier Primer-Sondensysteme erwiesen sich als unbrauchbar. Anstelle dessen eignet sich nachweislich aber die von HESS und NÄUMANN (2002) beschriebene Methode. Das macht zusätzliche Versuche einer Eigenentwicklung überflüssig, zudem von NI- CHOLAS und BRODMANN (2001) ein weiteres Verfahren zur absoluten Quantifizierung des PAT-Gens in Pflanzenlinien vorliegt, dass zunächst anhand der Testung mit T25- Mais positive Resultate lieferte. Offen blieb hierbei der spezielle Nachweis für GVO-Raps, der im Nachhinein erbracht werden sollte. In diesem Zusammenhang ist eine Prüfung Untersuchungsbericht

11 der inzwischen von ZEITLER et al. (2002) publizierten Methode zur relativen Quantifizierung von transgenen Verunreinigungen (Basta- und Roundup Ready-Resistenz) in Raps ratsam. Zusammenfassung Es wurden verschiedene kommerzielle Kits und Methoden zur Extraktion hoher und reiner Mengen DNA aus Pflanzenmaterial sowie zur absoluten und relativen Quantifizierung von GVO-Anteilen in Mais- und Sojamehlen/-saatgut getestet. Die besten Resultate bzgl. DNA-Ausbeute und -Reinheit lieferten der Plant Mini-Kit der Firma QIAGEN und der NucleoSpinPlant Mini-Kit der Firma Macherey/Nagel. Beide Kits sind folglich zur DNA-Extraktion eingesetzt worden. Die relative Quantifizierung von GVO-Soja- und Maisstandards von FLUKA mit den Systemen von GeneScan bzw. Applied Biosystems war aufgrund der Instabilität der DNA in den Standards unterschiedlich erfolgreich. Die beste Übereinstimmung der ermittelten Werte mit den Sollwerten konnte für RR-Soja- Standards sowie für die selbst hergestellten T25-Standards erzielt werden. Für den quantitativen Nachweis von GVO-Raps bzw. 35S/pat transformierten Pflanzenlinien wurden vier mittels Primer-Express konstruierte Primer-Sonden-Systeme sowie zwei weitere Methoden geprüft. Alle vier vorgeschlagenen Primer-Sonden-Systeme erwiesen sich als ungeeignet. Möglichkeiten für den erfolgreichen Nachweis bietet die Methode von HESS und NÄUMANN (2002, unveröffentlicht) sowie von NICHOLAS und BRODMAN (2001). Letztere wurde zunächst mit T25-Mais geprüft und sollte speziell mit Raps nachvollzogen werden. Literatur APPLIED BIOSYSTEMS (2002): Trainingskurs TaqMan PCR (Einführung), Weiterstadt, HESS, N.; NÄUMANN, G. (2002): Quantitativer Nachweis von CaMV 35S/pat transformierten Pflanzen mitttels Taqman PCR / Entwurf , UAM SOP 35S/pat-Taqm-DOC, Behörde für Umwelt und Gesundheit, Hamburg LAG (2001): Konzept für ein einheitliches Vorgehen bei der experimentellen gentechnischen Überwachung von GVO-Anteilen in konventionellem Saatgut, Vereinbarung des Unterausschusses Methodenentwicklung des LAG, Berlin, 30. März 2001 MASCHKOWSKI, G. (2003): aid PresseInfo Verbraucher und Ernährung v. 3. Juli 2003, S. 3 bis 5 NICHOLAS, G.; BRODMANN, P. (2001): Quantitativer Nachweis des 35S-PAT-Genkonstruktes mittels Real Time Detection (TaqMan Universal PCR), SOP P219, Kantonales Laboratorium Basel-Stadt QIAGEN (2001): Workshop: Nukleinsäure-Isolierung und PCR, Hilden, REICHARDT, W. (1999): Laboranalytischer Nachweis von gentechnisch veränderten landwirtschaftlichen Produktionsmitteln und Produkten, Literaturstudie, TLL Jena, 109 S. REICHARDT, W. (2000, unveröffentlicht): TLL Arbeitsvorschrift zum PCR-Nachweis von gentechnisch verändertem Raps REICHARDT, W. (2002): Quantitative Bestimmung transgener Bestandteile in Pflanzen, Saatgut und Futtermitteln. Forschungsthemen-Nr.: /2002, TLL Jena SCHILD, T. A. (1997): Einführung in die Real-Time TaqMan TM PCR-Technologie, Vers PE Applied Biosystems GmbH Weiterstadt, 118 S. ZEITLER, R.; PIETSCH, K.; WAIBLINGER, H.-U. (2002): Validation of real-time PCR methods for the quantification of transgenic contaminations in rape seed. Eur. Food Res. Technol. 214, 346 bis 351 Schriftenreihe der TLL 152