1a. Mikrobiologische Vielfalt im Pansen eines Wiederkäuers

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1 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page 1 1a. Mikrobiologische Vielfalt im Pansen eines Wiederkäuers VerfasserInnen: Betreuer: Birgit Klesser, diddlschaf@yahoo.com Priska Lochmatter, priska.lochmatter@gmx.net Daniel Edelaar, daniel_edelaar@hotmail.com Kurt Hanselmann, hanselma@botinst.unizh.ch Inhalt: 1 Einleitung 1 2 Vorgehen 1 3 Ergebnisse Mikroskopische Untersuchungen Redoxbeobachtungen 4 4 Diskussion 4 5 Anhang 5 Einleitung In diesem Experiment geht es darum, die Vielfalt der anaeroben Mikroorganismen im Pansen einer Kuh zu erkennen und diese unter dem Phasenkontrastmikroskop anzuschauen. Weiter zeigt dieser Versuch, wie man selber herausfindet, was die Mikroorganismen im Pansen leisten und Versuche in die Tat umsetzt, die die mikrobiellen Stoffwechselaktivitäten unter anoxischen Bedingungen im Wiederkäuer zeigen. Vorgehen Um Pansensaft zu gewinnen war der Weg zum Tierspital unumgänglich. Dort befindet sich nämlich eine Kuh, welche eigens dafür auf der dorsalen Flanke fistuliert wurde (Abb. 1). Somit ist es möglich, der Kuh jederzeit Flüssigkeit aus dem Vormagen zu entnehmen. Mit einem Schlauch wurde mittels Vakuum 250ml Pansensaft abgesogen und in eine sterile Flasche abgefüllt. Da die Mikroorganismen keinen Sauerstoff zum Leben brauchen, wurde die Flasche fast vollständig gefüllt, um eine Luftblase möglischst zu vermeiden. Auf dem Rückweg wurde die Flasche unter den Arm geklemmt, um so die Temperatur des Pansens möglichst aufrecht zu erhalten. Im Labor wurde der Pansensaft mikroskopiert und mit Farbindikatoren wurden Redoxreaktionen beobachtet. Abb. 1: Fistulierte Kuh

2 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page 2 Abb. 2: Position des Pansens (grün) und der Milz (braun) in der Kuh. B ild 115 aus der Serie. von Pat McCarthy, Department of Veterinary Anatomy, University College Dublin Abb. 3: Teile des Verdauungssystems eines Wiederkäuers. bivores/rumen_anat.html (Colorado State University) Abb. 4: Schichtung der Nahrungsteile im Pansen eines Wiederkäuers. bivores/rumination.html (Colorado State University)

3 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page 3 Ergebnisse 1.1 Mikroskopische Untersuchungen Durch das Mikroskop erkennt man im Pansensaft bei geringer Vergrösserung zahlreiche vakuolisierte Protozoen, meist Ciliaten und einige Flagellaten, welche sich durch Strudeln Nahrungspartikel und Bakterien als Nahrung zuführen (Abb. 5 und 6). Bersonders interessant ist der Reichtum an verschiedenen Prokaryotenformen. (Abb. 7) Abb. 5: Isotricha prostoma, 400x. Die Cilien sind um den ganzen Organismus sichtbar. Ebenso sind Makro- und Mikronucleus zu erkennen. Das Vesticulum befindet sich unten links. Abb. 6: Entodinium caudatum caudatum (Organismus rechts) 400x. Abb. 7: Lactobacillus sp., Bakterium, das Laktose und Hexosen via die Glykolyse zu Pyruvat fermentiert, dieses als Elektronenakzeptor verwendet und daraus Laktat macht. Aus: von Neal R. Chamberlain, Kirksville College of Osteopathic Medicine, Department of Microbiology/Immunology, Kirksville, MO 63501

4 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page Redoxbeobachtungen Das Redoxpotential wurde mit Hilfe von drei Indikatoren (Phenosafranin, Resazurin und Methylenblau) geprüft. Zu jedem Ansatz wurde die angegebene Menge des Indikators gegeben, wobei wir die Farbänderung beobachteten: Von rot nach farblos bei Phenosafranin, von violett nach rosa und farblos bei Resazurin und von blau nach farblos bei Methylenblau. Die Indikatoren wechseln ihre Farbe bei verschiedenen Redoxpotentialen: Phenosafranin von rot nach farblos in der verwendeten Konzentration bei ca. -400mV, Resazurin von rosa nach farblos bei ca. -70mV und Methylenblau von blau nach farblos bei ca. +100mV. Im Experiment entfärbt sich Methylenblau sowohl mit nativem Pansensaft als auch mit Glukose gefüttertem Pansensaft innerhalb von ca. 15 Sekunden. Die Entfärbung von Resazurin geschah innerhalb von 55 Sekunden im Glukose gefütterten Pansensaft und nach 100 Sekunden im nicht gefütterten Ansatz. Phenosafranin wurde auch nach langem Warten nur schwach entfärbt. Als Kontrolle diente einerseits Pansensaft, der auf 100 C erhitzt war und bei dem keine Farbänderung eintrat. Der Zutritt von Luftsauerstoff im kleinen Gasraum in jedem Röhrchen am Ende des Experimentes, deutete an, dass sich der Redoxindikator im obersten Millimeter innerhalb weniger Minuten in die oxidierte Form zurückverfärbte. Damit war bewiesen, dass die verwendeten Fabstoffe richtig funktionierten, und dass die Pansenmikrobiota in der Lage ist, die oxidierte Form der Farbstoffe zu reduzieren. Diskussion Der Pansen ist eine prägastrische Fermentationskammer und eines der komplexesten mikrobiellen Ökosysteme. In ihm leben Mikroorganismen, die es dem Wirt (Wiederkäuer) ermöglichen, die mit der Nahrung aufgenommenen Pflanzenpolymere zu verdauen, für die ihm die dazu notwendigen hydrolytischen Enzyme fehlen. Im Pansen koexistieren eine Vielzahl und Vielfalt von Mikroorganismen, die an die dort herrschenden anoxischen Bedingungen angepasst sind, ebenso an das Redoxpotential von bis -400 mv, an den ph = 6.5 und an eine Temperatur von 39 C. Zu den Mikroorganismen im Pansen zählen: Anaerobe Bakterien, Archäen, anaerobe Protozoen (Ciliaten) und auch anaerobe Pilze (Abb. 8). Die Prokaryoten machen den Hauptanteil an Mikroben im Pansen aus. Unter dem Mikroskop bei hoher Auflösung sind eine Vielzahl verschiedener Phänotypen erkennbar. Die Protozoen machen einen kleineren Anteil der Organismen im Pansen aus. Unter dem Mikroskop waren verschiedene Ciliaten zu erkennen, solche mit gleichmässiger Bewimperung und andere mit höherer Wimperndichte an bestimmten Stellen, vermutlich um die Nahrung einzustrudeln. Prokaryoten und Protozoen sind darauf spezialisiert, Kohlenhydratpolymere zu hydrolysieren, wobei die Protozoen jedoch zusätzlich noch Prokaryoten verdauen. Abb. 8: Pilzsporangie, befestigt an einem Faserstück. fungi1dark.htm Bei der Verdauung werden die Polymere zunächst enzymatisch in Di- und Monosaccharide zerlegt, die dann zu kurzkettigen flüchtigen Fettsäuren (Formiat, Acetat, Propionat und Butyrat) fermentiert werden. Des weiteren enstehen auch H 2, CO 2, NH 4 und CH 4.

5 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page 5 H 2 und CO 2 werden von methanogenen Bakterien in CH 4 umgewandelt, das in die Umgebung ausgestossen wird. Die bei der Fermentation gebildeten Protonen senken - bei Experimenten ausserhalb des Wiederkäuermagens - den ph. Im lebenden System, also im Wiederkäuer, werden diese Protonen durch Bikarbonat und andere Basen gepuffert. Das Experiment mit den Redoxfarbstoffen, das dank dem Redoxpotential von 300mV und tiefer möglich war, zeigt, dass im Pansen ein Austausch von Elektronen stattfindet: Die durch die Oxidation von Substraten entstehenden Elektronen lassen die reduzierten Produkte (organischen Säuren, H 2 und CH 4 ) entstehen. Anhang Bücher: BBOM: Madigan, Martinko und Parker; Brock Biology of Microorganisms; 10th. Edition Links: Images of the exterior and the interior of calf rumens (Penn. State): Rumen physiology and rumination (Colorado State): The microbe zoo (MSU): Digestive anatomy in ruminants (Colorado State) Location of the rumen and the spleen Lacotbacillus sp. under the microscope Pansen Forschungen der Universität Hohenheim Rumen Microorganisms Kursanleitung:

6 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page 6 1b. Mikrobiologische Diversität im Pansen eines Wiederkäuers VerfasserInnen: Betreuer: Katarzyna Kucharski, k.kucharski@active.ch Claudia Winteler, s @access.unizh.ch Nadine van Reeuwijk, nadinsky@gmx.ch Kurt Hanselmann, hanselma@botinst.unizh.ch Einleitung: Bei diesem Versuch soll die grosse Vielfalt der Mikroorganismen im Pansensaft einer Kuh aufgezeigt werden. Ausserdem wurden mit kurzen Teilexperimenten einige Auswirkungen der mikrobiellen Stoffwechselaktivität unter den anoxischen Bedingungen im Pansensaft eines Wiederkäuers dargestellt. Vorgehen: Der Pansensaft wurde direkt aus einer dafür fistulierten Kuh im Tierspital gewonnen. Durch eine Fistel, die einen Zugang zum Pansen gewährt, konnte man die Flüssigkeit entnehmen. Abb.1: Fistulierte Kuh mit dorsaler Öffnung zur Entnahme von Pansenflüssigkeit (aus Lehrbuch:Brock Biology of Microorganisms, 10th ed.) Abb. 2 (links): Anatomie und Position des Verdauungssystems eines Rindes (aus Lehrbuch: Physiologie der Tiere von Knut Schmidt-Nielsen)

7 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page 7 Kühe mit einer Fistel sind für Untersuchungen der Pansenmikrobiologie sowie der Pansennährstoffe äusserst nützlich. Aus dem Auffanggefäss wurden 250ml in eine sterile Flasche abgefüllt. Anschliessend wurde der Pansensaft in einem Labor des Tierspitals mikroskopiert. Mit bis zu 100-facher Vergrösserung konnte man die braungrüne Flüssigkeit im Phasenkontrastmikroskop untersuchen. Der Pansensaft wurde im Uni-Labor weiter bearbeitet. Die Flüssigkeit wurde bei einer konstanten Temperatur von 39 C in einem Wasserbad warmgehalten. Durch Farbindikatoren (Resazurin, Methylenblau, Phenosafranin) konnten Veränderungen im Redoxpotential und mittels Bromthymolblau auch solche des ph beobachtet werden. Ergebnisse: Protokoll der Experimente 1.) Betrachtung unter dem Mikroskop (Abbildung 3 aus Lehrbuch: Brock Biology of microorganisms (10 th ed.) Abb. 3 (links) Ein kleiner Tropfen der Pansenflüssigkeit wurde unter dem Phasen-Kontrast-Mikroskop betrachtet. Bei geringer Vergrösserung konnten vor allem Ciliaten beobachtet werden, die mit einer gewissen Geschwindigkeit in der Flüssigkeit herumschwammen und durch ihren Gullet (Vistibulum, Mund ) Bakterien und kleine Protozoen in Nahrungsvakuolen aufnahmen. Gut zu sehen waren die vielen Cilien um ihre Zellmembran herum, mit denen sie sich fortbewegten. Bei einer höheren Vergrösserung konnte man deutlich die sich mit Prokaryoten füllenden Nahrungsvakuolen sehen. Abb.4 Abb ) Untersuchung des Redoxpotentiales 9 kleine Röhrchen wurden mit je 9 ml Pansensaft gefüllt. In 6 von diesen Röhrchen wurden je 1 ml Glucoselösung ( 100 mm, verdünnt 1:10 ) gegeben und in 3 von diesen je 1 ml destilliertes Wasser. Danach wurden die 3 Röhrchen ( ohne Glucose ) und 3 Röhrchen ( mit Glucose ) in ein 39 C warmes Wasserbad und die 3 anderen Röhrchen ( mit Glucose ) in ein siedendes Wasserbad gestellt. Nach 5 Minuten Kochen

8 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page 8 wurden sie herausgenommen und gemeinsam mit den anderen Ansätzen für 5 Minuten bei 39 o C inkubiert, bevor sie mit verschiedenen Redoxindikatoren versetzt und die Reaktionszeiten (Entfärbung) gemessen wurden. In der Tabelle 1 werden die Entfärbungsreaktionen aufgezeigt. Tabelle 1: Reduktionszeit der Redoxindikatoren (Zeit für Entfärbung in Sekunden) Methylenblau ( blau ) Resazurin ( rosa ) Phenosafranin ( rot ) Saft mit 1 ml Glucose bei 39 C inkubiert Saft mit 1 ml dest Wasser bei 39 C inkubiert Saft mit 1 ml Glucose in siedendem Wasser für 5 Minuten Kein Farbverlust Kein Farbverlust Kein Farbverlust Im Pansensaft herrscht ein Redoxpotential von 350 mv bis 400 mv. Es besteht ein obligates anoxisches Milieu, in welchem Polysaccharide (Stärke, Cellulose etc.) und andere pflanzliche Polymere in verschiedene Fettsäuren abgebaut werden ( siehe Diskussion ) Die verschiedenen Indikatoren verlieren ihre Farbe bei unterschiedlichen Redoxpotentialen. Resazurin schon bei 45 mv. Daher eine rasche Reaktion, Phenosafranin erst bei 270 mv. Daher eine langsamere Reaktion mit Phenosafranin. Das Mittelpunktspotential von Methylenblau liegt zwischen +50 und +100 mv, daher die sehr rasche Reaktion. Es wurde weiter beobachtet, dass nach kurzer Zeit am oberen Rand der Pansenfüssigkeit in den Röhrchen allmählich die Indikatorfarbe zurückkehrte. Dies geschah, weil beim Öffnen der Röhrchen Sauerstoff hinein diffundierte und die obere Schicht dadurch wieder oxidiert wurde. 3.) Untersuchung der Säureproduktion Wieder wurden 3 Röhrchen mit je 9 ml Pansensaft gefüllt. In die Röhrchen 2 und 3 wurden 1 ml Glucoselösung und in Röhrchen 1 1 ml destilliertes Wasser gegeben. Röhrchen 1 und 2 wurden in 39 C warmes Wasser und Röhrchen 3 in ein Wasserbad mit siedendem Wasser gestellt. Wieder wurde 5 Minuten inkubiert. Auf 3 Keramikplättchen wurden je 100 µl Bromthymolblau ( ein ph-indikator ) gegeben und je 100 µl inkubierte Pansenflüssigkeit von jedem Röhrchen dazu gemischt. Bromthymolblau hat folgende Eigenschaften: bleibt blau bei ph 7.2, wird grün bei ph 6.6 und gelb bei ph < 6.0. Bei unserem Versuch zeigten sich folgende Ergebnisse: Die erhitzte Flüssigkeit zeigte keine Farbänderung. Sie blieb blau. Die Flüssigkeit mit Glucose versetzt zeigte eine schnelle Reaktion von blau nach grün-gelb. Die Flüssigkeit ohne Glucose zeigte eine Reaktion von blau nach grün. Was bedeutet dies nun? Bromthymolblau ändert die Farbe wenn eine ph-absenkung geschieht. Und diese ph-absenkung geschah vor allem in der Pansenflüssigkeit, die mit Glucose versetzt wurde. Die Glucose wurde also sehr rasch zu den einzelnen Fettsäuren umgewandelt und bewirkte dadurch eine ph-absenkung.

9 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page 9 Warum änderte sich die Farbe auch bei der Flüssigkeit, welche nicht mit Glucose versetzt wurde? Da wir die Pansenflüssigkeit frisch aus der Kuh herausholten, war die Flüssigkeit durch die Aktivität der Bakterien schon angereichert mit Fettsäuren. Warum änderte sich die Farbe bei der erhitzten Flüssigkeit nicht? Durch das Erhitzen wurden alle Organismen abgetötet. Es bestand keine Aktivität mehr. Angezeigt wurde das ph von totem Panseninhalt. Diskussion: Wiederkäuer haben ein spezielles Organ, den Pansen, in welchem sich die Verdauung von Cellulose und anderen Pflanzenpolymeren durch die Aktivität von Mikroorganismen abspielt. Da der Wiederkäuer selbst nicht fähig ist, Cellulose und andere Kohlenhydratpolymere abzubauen, braucht er dieses mikrobielle Ökosystem mit den vielen verschiedenen Bakterien und Archäen, welche die richtigen Enzyme zur Verfügung stellen. Solche Enzyme sind: Cellulasen ( ß-1,4-Glucanasen ) zur Cellulosespaltung, Amylasen zur Spaltung von Stärke sowie Esterasen und Hydrolasen für die Zerlegung von Pectin. Neben den anaeroben Bakterien, welche im speziellen Klima des Pansen ( die hohe konstante Temperatur (39 C), der konstante ph-wert von 6.5 und die anoxischen Bedingungen ) dominieren, konnte man bei der Probe unter dem Mikroskop vor allem auch Protozoen erkennen. Diese sind nicht minder wichtig für die Aufrechterhaltung dieses Biotops, da einige einerseits auch Cellulose und Stärke hydrolysieren und Glucose vergären aber vor allem weil sie das Gleichgewicht regulieren. Sie ernähren sich von Pansenbakterien, so dass deren Population nicht plötzlich überhand nimmt ( pro ml Pansenflüssigkeit hat es Bakterien und ca Protozoen ). Die Pansenmikrobiota stellt sich aus methanogenen, acidotrophen, saccharolytischen, ureolytischen, ammoniogenen und vielen anderen Bakterien zusammen. Bei den Protozoen handelt es sich vor allem um Ciliaten und Flagellaten. Die Endprodukte, welche im Pansen bei der Fermentation gebildet werden, sind: Acetat, Propionat, Butyrat, Lactat, Formiat, CO 2, H 2 und CH 4. Die flüchtigen Fettsäuren (VFA s) passieren durch die Pansenwand in den Blutstrom und werden vom Wirtstier als Hauptenergiequelle oxidiert. Die Mengen an CO 2 (65%) und CH 4 (35%), die sich im Pansen ansammeln, werden während der Eruktation frei gesetzt (Abb.6).

10 Experiment 1 / Student reports Laboratory to Biology III Diversity of Microorganisms / Wintersemester 2002/03 / page 10 Abb. 6: Biochemische Reaktionen im Pansen. Aus Brock - Biology of Microorganisms (10 th edition, 2003)