Untersuchungen zur Wirkung des Ginkgo biloba-extraktts EGb 761 auf die Proteinaggregation in der Huntington-Krankheit

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1 Untersuchungen zur Wirkung des Ginkgo biloba-extraktts EGb 761 auf die Proteinaggregation in der Huntington-Krankheit Dissertation zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Mainz, 2014 von Marcel-Michael Stark geb. am in Saarbrücken

2 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Ginkgo biloba Ginkgo als Heilpflanze Ginkgo biloba-extrakte Zusammensetzung der Ginkgo biloba-extrakte Terpenlaktone Flavonoide und Flavonglykoside Weitere Inhaltsstoffe der Ginkgo biloba-extrakte Pharmakologische Wirkungen der Ginkgo biloba-extrakte Medizinische Verwendung der Ginkgo biloba-extrakte Proteindegradationsmechanismen Allgemeine Proteindegradation Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) Ubiqutin Der 26S-Proteasomkomplex Der 19S-Komplex Der 20S-Komplex Proteindegradation durch das UPS Erkennungsmotive proteasomaler Substratproteine Autophagie Degradationsprozess durch Makroautophagie Die neurodegenerative Huntington-Krankheit Gemeinsamkeiten zwischen neurodegenerativen Erkrankungen Die Huntington-Krankheit (Chorea Huntington) Das huntingtin-gen und Huntigtin-Protein Zelluläre Dysfunktionen in der HD Degradation von Huntingtin-Proteinen Bildung von Huntingtin-Proteinoligomeren und Proteinaggregation Therapieansätze in der HD Ziel der Arbeit 38 4

3 2 Material und Methode Materialien Zell- und Tiermodelle Geräte Verwendete Chemikalien Materialien, Lösungen und Puffer Lösungen und Puffer der Proteinbiochemie Lösungen und Puffer der Molekularbiologie Lösungen und Puffer der Zellkultur Lösungen und Puffer der Nematodenzucht Verwendete Antikörper Methoden Zellkulturmethoden Kultivierung klonaler Zelllinien (HEK293, d2gfp-hek) Kultivierung von humanen Fibroblasten (EMR-90) Bestimmung der Lebenzellzahl Bestimmung von Populationsverdopplungen (PD) Kryokonservierung von Zellen Transiente Transfektionen Proteinbiochemie Herstellung von Proteinpräparaten Quantifizierung des Proteingehaltes Immunoblotting Gelelektrophorese Proteintransfer (Western-Blotting) Immundetektion der Proteine Filterretardierungs-Test (Filter Retardation Assay) Mikroskopische Analyse der Zelllinien Sulforhodamin B-Test (SRB-Test; SRB-Assay) Messung der d2gfp-degradation (d2gfp-degradationstest) Messungen der enzymatischen Proteasom-Aktivität (SUC-AMC-Test) Molekularbiologische Methoden Enzyme und Kits für molekularbiologische Arbeiten Herstellung der verwendeten Plasmide DNA-Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 56 5

4 Auftrennung von Nukleinsäuren mittels Agarosegel-Elektrophorese Aufreinigung spezifischer PCR-Produkte Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA Restriktion des Zielvektors pegfp-nl Rekombination mittels In-Fusion Reaktion Klonierung der hergestellten Vektoren (htt_qx) Transformation kompetenter Bakterien Aufreinigung der klonierten Plasmide Quantitative-Real-Time-Reverse-Transkriptions-PCR (qrt-pcr) Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen Reverse Transkription (RT-PCR) der isolierten Gesamt-RNA Quantitative-Real-Time-PCR (qpcr) der cdna-proben Caenorhabditis elegans (C. elegans)-methoden Die verwendeten transgenen C. elegans-stämme Kultivierung von C. elegans Herstellung von NGM-Platten mit bakteriellen Kulturen Synchronisierung von C. elegans Mikroskopische Analyse von C. elegans Mikroskopische Analyse von C. elegans Untersuchungen zur Beweglichkeit von C. elegans Proteinpräparation und Immunoblotting von C. elegans Ergebnisse Untersuchungen zur Wirkung von EGb 761 auf die Proteasom-Aktivität Charakterisierung der Proteasom-Aktivität anhand der Hydrolyse von SUC-AMC Modulation der Proteasom-Aktivität durch EGb Modulation des proteasomalen Proteinabbaus durch EGb Erweiterte Analyse der EGb 761-Wirkung auf den proteasomalen Proteinabbau EGb 761 erhöht die Transkription proteasomaler Gene Zusammenfassung der EGb 761-Wirkung auf die Proteasom-Aktivität Untersuchung der Wirkung von EGb 761 auf die Proteasom-Aktivität in zellulären Modellen der HD EGb 761 erhöht die enzymatischen Proteasom-Aktivität in zellulären Modellen der HD Modulation der Proteindegradation durch EGb 761 in zellulären Modellen der HD EGb 761 erhöht die Transkription proteasomaler Gene in zellulären Modellen der HD Zusammenfassung der EGb 761-Wirkung auf die Proteasom-Aktivität in HD-Modellen

5 3.3 Untersuchungen zur Wirkung von EGb 761 auf polyq-proteine EGb 761 reduziert die Anzahl von polyq-proteinaggregaten EGb 761 vermindert den Gehalt von aggregierten polyq-proteinen EGb 761 reduziert den Gehalt an polyq-aggregaten ohne zytotoxische Wirkung EGb 761 vermindert die Aggregation von polyq-proteinen mit Beginn der Behandlung Zusammenfassung der EGb 761-Wirkung auf polyq-proteine und polyq-aggregate Untersuchung der EGb 761-Wirkung auf den Abbau von polyq-proteinen EGb 761 induziert den proteasomalen Abbau von kurzlebigen Proteinen, aber nicht von löslichen polyq-proteinen EGb 761 induziert den proteasomalen Abbau von fehlgefalteten polyq-proteinen EGb 761 erhöht die Effizienz der proteasomalen Degradation von fehlgefalteten polyq- Proteinen EGb 761 hat keine Wirkung auf den autophagosomalen Abbau von polyq-aggregaten Zusammenfassung der EGb 761 -Wirkung auf den Abbau von polyq-proteinen Untersuchungen zur Wirkung von EGb 761 auf polyq-proteine in primären humanen Fibroblasten EGb 761 reduziert die Anzahl von polyq-proteinaggregaten in jungen Fibroblasten EGb 761 vermindert den Gehalt von aggregierten polyq-proteinen in jungen Fibroblasten EGb 761 reduziert die Anzahl und den Gehalt von polyq-aggregaten in seneszenten Fibroblasten Zusammenfassung der EGb 761-Wirkung auf polyq-proteine in humanen Fibroblasten Untersuchungen zur Wirkung von EGb 761 auf transgene C. elegans als in vivo-model der HD EGb 761 reduziert den Gehalt an aggregierten polyq-proteinen in transgenen C. elegans EGb 761 vermindert die Aggregation von polyq-proteinen in transgenen C. elegans EGb 761 verbessert pathologisch verminderte Bewegungen von transgenen C. elegans Zusammenfassung der EGb 761-Wirkung auf in vivo-modelle der HD Diskussion Modulation der Proteasom-Aktivität durch EGb Behandlungen mit EGb 761 steigern die Proteasom-Aktivität in nativen Zellen 125 7

6 4.1.2 EGb 761 erhöht die pathologisch verminderte Proteasom-Aktivität in zellulären Modellen der HD Zusammenfassung der Wirkung von EGb 761 auf die Proteasom-Aktivität 130' 4.2 EGb 761 reduziert polyq-aggregate durch eine verbesserte Degradation Behandlungen mit EGb 761 reduzieren die Menge an polyq-proteinaggregaten EGb 761 bewirkt einen effizienteren Abbau fehlgefalteter polyq-proteine und reduziert hierdurch polyq-aggregate Zusammenfassung der Wirkung von EGb 761 auf die Aggregation von polyq-proteinenl EGb 761 reduziert polyq-aggregate in erweiterten Modellen der HD in vitro und in vivo EGb 761 vermindert den Gehalt an polyq-aggregaten in primären humanen Zellen EGb 761 reduziert polyq-aggregate und verbessert pathologische Phänotypen in transgenen C. elegans Zusammenfassung der EGb 761-Wirkung in erweiterten Modellen der HD in vitro und in vivo Relevanz der Ergebnisse und Ausblick Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Abkürzungen Vektorkarten und Sequenzen Publikationen Curriculum Vitae Eidesstattliche Erklärung Danksagung 192 Anmerkung zur statistische Auswertung 193