Eine Anreicherungstechnologie und ihre klinische Anwendung in der Pathogendiagnostik

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1 Eine Anreicherungstechnologie und ihre klinische Anwendung in der Pathogendiagnostik Sepsis und Sepsisdiagnostik Technologien und Produkte LOOXSTER Kerntechnologie VYOO molekulare Pathogendiagnostik Ergebnisse Multicenterstudie

2 Quelle: Deutsche Sepsishilfe e.v.

3 Sepsis als weltweite diagnostische Herausforderung Sepsis ist die Reaktion auf die Aktion pathogener Keime und ihrer Produkte, die aus einem Infektionsherd in den Blutstrom eindringen * Die inflammatorische Antwort ist dramatisch, schädigt den eigenen Körper und kann zu Organversagen führen Todesfälle/ Jahr USA** Behandlung auf der Intensivstation Sofortige Antibiotikabehandlung Erregerdiagnostik und Fokussuche *H. P. Schuster, U. Müller-Werdan: Definition und Diagnose von Sepsis und Multiorganversagen, 2005 **www.sepsis.com

4 Killer Sepsis I: Prävalenz Global: ~1,500,000 / Jahr Rangel-Frausto et al. JAMA 1995 Linde-Zwirble et al. Crit Care Med 1999 USA: ~750,000 / Jahr Martin GS et al. N Engl J Med 2003;348: Angus DC et al. Crit Care Med 2001; 29: Deutschland: ~125, ,000 / Jahr Rychlik R et al. Gesundh Ökon Qual Manag 2000; 5:67-72

5 Killer Sepsis II: Mortalität schnelle Diagnostik adäquate Therapie reduzierte Sterblichkeit Relloetal.: AmJRespirCritCareMed1997;156: Alvarez-Lerma: IntensiveCareMed1996;22: Ibrahimetal.: Chest2000;118: Lunaetal.: Chest1997;111: Garnacho-Monteroetal.: CritCareMed2003;31: Vallésetal.: Chest2003;123: adequatetherapy inadequatetherapy MortalityRate[%]

6 Sepsis als akutes und wachsendes Problem Frühe Diagnose Septic clock -Effekt Antibiotic Stewardship Frühe adäquate Therapie rettet Leben Resistenzproblematik Gesundheitssystem Lebensqualität Spätfolgen

7 Sepsis - Diagnose Mindestens 2 klinische Parameter erfüllt: Leukozytose (60-80%) / Leukopenie (10%) Fieber (60-80%), Schüttelfrost Veränderungen von Atmung, Kreislauf und Blutgerinnung Biomarker PCT, CRP erhöht Identifizierung der Infektionsquelle der Erreger (Blutkultur als Goldstandard)

8 Molekulare Diagnostik mit Vorteilen gegenüber klassischer Blutkultur Dauer der empirischen Therapie Blutkultur 40ml Gram Typ Resistenz Tag 1 Tag 2 Tag 3 PCR 5ml Gram, Spezies, Resistenz PCR aus pos. BK Blutkultur-Limitationen: nur Nachweis lebensfähiger Pathogene Detektionsraten von10-15% lange Dauer bis Endergebnis anspruchsvolle Probenlogistik PCR Limitationen: höherer Laboraufwand inhibitorische Effekte durch viel Hintergrund-DNA begrenztes Erregerspektrum

9 Analyseprozess für DNA-basierte Diagnostik Probenvorbereitung Zell-Lyse Nukleinsäureextraktion Anreicherung Amplifikation klassische oder realtime-pcr Detektion Schmelzkurve Mikroarray Sequenzierung

10 Enabling- Technologie LOOXSTER : Mikrobielle DNA Anreicherung aus DNA Gemischen Essentiell in schwierigen diagnostischen Fragestellungen mit geringer Erregerlast (z.b. Sepsis): 1 Pathogen-Genom per 1,000,000,000 WBC needle in a haystack" LOOXSTER nutzt die Eigenschaft eines rekombinanten humanen Proteins, nichtmethylierte CpG-Motive in Bakterien- und Pilz -DNA bevorzugt zu binden Entfernt >95% der Hintergrund-DNA Spezifische Nachweise können so mit verbesserter Sensitivität geführt werden

11 Interaktion im Detail CFP1 CXXC Domäne und GCGG Doppelstrang-DNA (5 -GCCAGCGGTGGC-3 ) ChaoXu,Chuanbing Bian,RobertLam,Aiping Dong&Jinrong Min Thestructuralbasisforselectivebindingofnon-methylatedCpGislandsbytheCFP1CXXCdomain Nat.Commun.2011;2:227

12 LOOXSTER - DNA interaction is modulated by the GC-content GC-content dependence of LOOXSTER-DNA interaction GC-content [%] S.pneumoniae P.mirabilis S.aureus A.baumannii C.perfringens E.coli S.maltophilia N.meningitidis P.aeruginosa P.aeroginosa Conductivity at elution peak maximum [ms/cm]

13 LOOXSTER Anreicherung von bakterieller und fungaler DNA Festphase (metal-chelating) Linker (metal-binding) DNA-Bindung Ligand Ni 2+ His(6x)tag CXXC Optionen: Sepharose für FPLC Applikationen paramagnetische Partikel

14 LOOXSTER Prinzip Blutprobe mit Pathogenen 50µg total DNA 1µg angereicherte DNA Einsatz großer Probenmengen möglich erlaubt Applikationen am Sensitivitätslimit 200 ng, 0,4% der Probe für die Analytik qpcr 200 ng, 20% der Probe für die Analytik qpcr with improved sensitivity

15 LOOXSTER Performance in realtime-pcr 50 µg humane DNA gespiked mit 10 3 E.coli Genomkopien 200 ng einer total DNA Präparation und 200ng post- LOOXSTER -DNA als Templat für realtime PCR (maximal tolerierte DNA Menge) LOOXSTER -Vorteil: Ct= fache Sensitivitätserhöhung Verdünnungsreihe Genomkopien (E.coli) Ct = ng mit LOOXSTER 200ng ohne LOOXSTER

16 LOOXSTER : Perspektiven als Präanalyik-Modul Sepsis und Infektionskrankheiten BioPharma QC (Mycoplasma) Transfusionsmedizin Lebensmittelkontrolle Umweltanalytik Biosafety

17 VYOO - Pathogendiagnostik für Sepsis Molekulare Diagnostik für schnelle Pathogendetektion DNA-basierter Nachweis direkt aus 5ml Blut CE- IVD 34 Bakterien 7 Pilze 5 therapierelevante Resistenzen Hohe Spezifität und Sensitivität durch Mikroarray-Detektion Antibiotische Vorbehandlung ohne Einfluß Therapieoptimierung an Tag 1

18 VYOO Workflow 5ml Probenvolumen PureProve Reinheitsgrad Mechanische Lyse DNA Isolation Pathogen- DNA Anreicherung Multiplex PCR Microarray

19 Multizentrische klinische VYOO - Studie >1000 Patienten mit Sepsisverdacht in 13 Universitätskliniken Studienpartner Primäres Studienziel: Vergleich zur klinischen Diagnose Welche Information liefert VYOO? Sensitivität Spezifität Sekundäre Studienziele: Ist der DNA-Nachweis im Blut klinisch relevant? Deckte die Antibiotikatherapie die VYOO -Nachweise ab? Clinical: Prof. Gummert Mibi: Prof. Knabbe Clinical: Prof. Adamzik Mibi: Prof. Rath Clinical: Prof. Kindgen- Milles Mibi: Prof. MacKenzie Clinical: Prof. Marx Mibi: Prof. Haase Clinical: Prof. Zacharowski Mibi: Prof. Kempf Clinical: Prof. Volk Mibi: Prof. Herrmann Clinical: PD Kochanek Lead Clinical: Lead Mibi: Prof. Welte Prof. Seifert Mibi: Prof. Suerbaum Kiel Greifswald Hamburg Hannover Bad Oeynhausen Essen Düsseldorf Leipzig Köln Aachen Frankfurt Homburg Regensburg Clinical: Profs. Weiler, Bewig Mibi: Prof. Fickenscher Clinical: PD Gründling Mibi: Prof. Steinmetz Clinical: Prof. Kluge Mibi: Prof. Aepfelbacher, Dr. Meyer Clinical: Prof. Kaisers Mibi: Prof. Rodloff Clinical: Prof. Salzberger Mibi: Prof. Reischl

20 Klinische Sensitivität im Vergleich Positivitätsraten in Patienten mit Sepsisverdacht (n=766) Positivität des Tests 18% 27% Blood culture (2 parallel samples, MiQ 3a 2007) VYOO

21 Beitrag von VYOO zur Diagnose von Blutstrominfektion Wie sind die zusätzlich zur Blutkultur identifizierten Erreger therapeutisch abgedeckt? 35% Positivität: VYOO, BK oder beide No additional targets with VYOO 14% Additional targets with VYOO 21% n=766 Blood culture and VYOO negative, 65%

22 Klinische Relevanz von Erreger-DNA im Blut Ist der Beitrag von PCR-Diagnostik klinisch relevant? Therapeutische Abdeckung der zusätzlichen VYOO -Nachweise und assoziiertes Sterberisiko der Patienten 40% Day 28 mortality 30% 20% 21% 26% 29% 36% 10% 0% blood culture and VYOO negative or not relevant VYOO w/o additional relevant targets full coverage initial antiinfectives covered all of these targets initial antiinfectives didn't cover all of these targets VYOO with additional relevant targets blood culture or VYOO positive and relevant no coverage zusätzliche VYOO Targets

23 Relevanz des direkten Nachweises von Resistenzmarkern VYOO Ergebnis mit besonderer Relevanz für Risikogruppe mit Resistenznachweis: Extreme Sterblichkeit bei nicht adäquater Therapie Day 28 Mortality 57% 21% 28% VYOO negative Adäquate initiale VYOO positive with resistance targets Therapie and correct initial therapy Keine adäquate VYOO positive with resistance targets initiale and incorrect initial therapy Therapie VYOO positiv mit Resistenznachweis

24 LOOXSTER Anreicherung mikrobieller DNA ermöglicht hochsensitiven Erregernachweis bietet Potenzial für weitere Applikationen VYOO liefert frühzeitig Erregernachweise wertvolle Ergänzung zur traditionellen Blutkulturmethode frühzeitige adäquate Therapie: Leben retten Zukünftige Entwicklungsschritte: Routinefähigkeit verbessern: Automatisierung Vielen Dank für Ihr Interesse!

25 Studienspezifikation Diagnostische Phase-III-Studie einarmig Konsekutiver nichtselektierter Einschluss der Patienten vor- Ort Validierung mit routinetypischer Verteilung von Patienten Verblindetes VYOO - Ergebnis I I I Tag 0 Tag 5 Tag 28 - Einschlusskriterien - Feststellung des true disease state - overall Mortalität - Blood culture (2 Paare) - Diagnose bei ITS Entlassung - VYOO -Test - weitere Sepsisepisode - Informed Consent

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