Zeitaufgelöste EPR-Untersuchungen zur Struktur und Dynamik von Radikalpaar-Intermediaten in photosynthetischen Reaktionszentren und Modellsystemen

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1 Zeitaufgelöste EPR-Untersuchungen zur Struktur und Dynamik von Radikalpaar-Intermediaten in photosynthetischen Reaktionszentren und Modellsystemen Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Ulrich Heinen aus Jever Freiburg i. Br. 2003

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3 Dekan: Leiter der Arbeit: Referent: Korreferent: Vorsitzender des Promotionsprüfungsausschusses: Prof. Dr. Kurt Bucher Prof. Dr. Gerd Kothe Prof. Dr. Gerd Kothe Prof. Dr. Peter Gräber Prof. Dr. Georg E. Schulz Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: Teile dieser Dissertation wurden veröffentlicht: 1. T. Berthold, M. Bechtold, U. Heinen, G. Link, O. Poluektov, L. Utschig, J. Tang, M.C. Thurnauer, G. Kothe: Magnetic-Field-Induced Orientation of Photosynthetic Reaction Centers As Revealed by Time-Resolved W-Band EPR of Spin-Correlated Radical Pairs, Journal of Physical Chemistry B, 1999, 103, U. Heinen, T. Berthold, G. Kothe, E. Stavitski, T. Galili, H. Levanon, G. Wiederrecht, M.R. Wasielewski: High Time Resolution Q-Band EPR Study of Sequential Electron Transfer in a Triad Oriented in a Liquid Crystal, Journal of Physical Chemistry A, 2002, 106, U. Heinen, O. Poluektov, E. Stavitski, T. Berthold, E. Ohmes, S.L. Schlesselman, J.R. Golecki, G.J. Moro, H. Levanon, M.C. Thurnauer, G. Kothe: Magnetic Field Induced Orientation of Photosynthetic Reaction Centers As Revealed by Time-Resolved D-Band EPR of Spin-Correlated Radical Pairs. II. Field Dependence of the Alignment, Journal of Physical Chemistry B, eingereicht 4. U. Heinen, J. R. Golecki, O. Poluektov, T. Berthold, S.L. Schlesselman, D. Frezzato, E. Ohmes, G.J. Moro, M.C. Thurnauer, G. Kothe: Magnetic Field Induced Orientation of Photosynthetic Reaction Centers As Revealed by Time-Resolved W-Band EPR of Spin-Correlated Radical Pairs. III. Development of a Molecular Model, Applied Magnetic Resonance, zur Veröffentlichung angenommen 5. G. Link, U. Heinen, T. Berthold, E. Ohmes, J.-U. Weidner. G. Kothe: High Time Resolution Multifrequency EPR of Radical Pair Intermediates in Photosynthetic Reaction Centers: Structure Determination on a Nanosecond Time Scale, Zeitschrift für Physikalische Chemie, 2004, 218, 1-21

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5 Für Dorothea

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7 Zeitaufgelöste EPR-Untersuchungen zur Struktur und Dynamik von Radikalpaar-Intermediaten in photosynthetischen Reaktionszentren und Modellsystemen Ulrich Heinen Die vorliegende Arbeit berichtet über zeitaufgelöste EPR-Untersuchungen an den Radikalpaar-Intermediaten der Photosynthese. Untersucht werden das sekundäre Radikalpaar P Q A im photosynthetischen Reaktionszentrum des Purpurbakteriums Rhodobacter sphaeroides R-26, das sekundäre Radikalpaar P A 1 im Photosystem I des Cyanobakteriums Synechococcus lividus, sowie die sequentiellen Radikalpaare des photosynthetischen Modellsystems ZCPINI. Schwerpunkt der Untersuchungen zum sekundären Radikalpaar P Q A des photosynthetischen Reaktionszentrums in Rb. sphaeroides sind Q-Band-EPR-Experimente (34 GHz) mit hoher Zeitauflösung. Bei diesen Experimenten werden nach einem Laserimpuls schnelle Oszillationen der EPR-Signale beobachtet. Aus der ausgeprägten Abhängigkeit dieser Quantenschwebungen von der experimentellen Magnetfeldstärke wird in einer Computeranalyse die relative räumliche Anordnung der Radikale P und Q A bestimmt. Die Analyse des zweidimensionalen EPR-Experiments liefert eine neue Geometrie für den ladungsgetrennten Zustand des Reaktionszentrums. Dieser Befund wird im Zusammenhang mit dem sequentiellen Elektronentransfer im photosynthetischen Reaktionszentrum diskutiert. W-Band-EPR-Spektren (95 GHz) des sekundären Radikalpaars P A 1 in ganzen Zellen des Cyanobakteriums S. lividus weisen auf eine partielle Orientierung der Reaktionszentren im EPR-Magnetfeld hin. In der vorliegenden Arbeit wird dieser Effekt auf die diamagnetische Anisotropie der Membranproteine in der Thylakoidmembran zurückgeführt. Aufgrund der Anordnung der Thylakoide in der Zelle wird eine Orientierung der stäbchenförmigen Zellen senkrecht zur Feldrichtung des EPR-Spektrometers vorhergesagt. Eine quantitative Analyse des Orientierungseffekts bietet die Grundlage für ein vollständiges dreidimensionales Strukturmodell des sekundären Radikalpaars P A 1 innerhalb des Photosystems I. Zeitaufgelöste Q-Band-EPR-Untersuchungen am photosynthetischen Modellsystem ZCPINI in flüssigkristalliner Matrix zeigen innerhalb eines Zeitintervalls von 150 ns nach einem Laserblitz die EPR-Spektren von drei unterschiedlichen Radikalpaaren. Die Analyse des zeitabhängigen EPR-Signals auf der Basis eines kinetischen Modells liefert den direkten Nachweis für sequentiellen Elektronentransfer im Triplettkanal. Bei Raumtemperatur erfolgt dieser Prozeß mit einer Zeitkonstante von 50 ± 1 ns.

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9 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Grundlagen zur Photosynthese Die natürliche Photosynthese Einleitung Allgemeine Prinzipien Dunkelreaktionen Lichtreaktionen Bakterielle Photosynthese Photosynthetische Bakterien Typen von Reaktionszentren Das Purpurbakterium Rhodobacter sphaeroides Pflanzliche Photosynthese Cyanobakterien und Chloroplasten Thylakoidsystem Elektronentransportkette Elektronenspinresonanz Einleitung Der Elektronenspin Wechselwirkungen in der EPR-Spektroskopie Das lichtinduzierte Radikalpaar Spinpolarisation Kohärente Spindynamik Detektion der Quantenschwebungen Strukturabhängigkeit der Quantenschwebungen EPR-Detektion i

10 3.5.1 Transiente Nutationen Simulation von EPR-Experimenten Koordinatentransformation Pulvermittelung Qualität der Simulation Experimentelle Methoden EPR-Experimente Q-Band-/X-Band-Spektrometer X-Band-/W-Band-Spektrometer Magnetfeldkalibrierung Datenbearbeitung Aufbereitung der Meßdatensätze Untersuchungen zum photosynthetischen Reaktionszentrum aus Rhodobacter sphaeroides Einleitung Experimente Probenpräparation Optische Anregung Transiente Q-Band-EPR-Spektroskopie Transiente X-Band-EPR-Spektroskopie W-Band-EPR-Spektrum Geometrieanalyse Vorgehensweise Simulationsparameter Strukturanalyse anhand der Q-Band-Experimente Ergebnis Systematische Fehler Orientierung des g-tensors von P Vergleich mit der Kristallstruktur Position von Q A Orientierung von Q A Interpretation und Diskussion Mechanistische Interpretation Hyperfeinwechselwirkungen ii

11 5.7 Zusammenfassung und Schlußbemerkungen Magnetoorientierung von photosynthetischen Organismen Einleitung Ursachen der magnetischen Ausrichtung Theoretische Grundlagen Simulation von EPR-Experimenten an orientierten Proben Orientierungsverteilungsfunktion Ordnungsparameter Rotation der Probe Auswirkungen im EPR-Spektrum Experimente und Analyse EPR-Spektroskopie Bestimmung der Lage des Suszeptibilitätstensors Analyse der Sättigungskurve Diskussion Größe der orientierbaren Systeme Modellevaluation und Zusammenfassung Das photosynthetische Modellsystem ZCPINI Modellsysteme in der Photosyntheseforschung Strukturen Der Einfluß der Umgebung Das Modellsystem ZCPINI / E Experimentelle Ergebnisse Spektrale Befunde Interpretation Kinetische Analyse Kinetische Gleichungen Das zeitabhängige EPR-Signal Ergebnisse Quantenschwebungen Zusammenfassung und Ausblick 128 iii

12 A Koordinatensysteme 131 A.1 Schreibweisen und Bezeichnungen A.2 Konvention der Koordinatentransformation A.2.1 Umrechnung von Tensoren und Vektoren A.2.2 Festlegung der Transformationsmatrizen A.2.3 Beschreibung von Radikalpaargeometrien A.3 Wechsel des Koordinatensystems A.4 Mehrdeutigkeiten B Fehleranalyse 137 B.1 Winkelfehler bei der Koordinatentransformation B.1.1 Mathematische Grundlagen B.1.2 Praktische Durchführung B.2 Zuverlässigkeit der Akzeptorposition B.3 Qualität der Parameteroptimierung C Magnetische Suszeptibilität 143 C.1 Volumensuszeptibilität orientierter Proben iv

13 Kapitel 1 Einleitung In der heutigen Zeit, in der die Begrenztheit der fossilen Rohstoffvorräte der Erde deutlich wird, während die Kernenergie bei einer Mehrheit der Bevölkerung auf Ablehnung stößt, erfreuen sich die erneuerbaren Energiequellen einer gesteigerten öffentlichen Aufmerksamkeit, die sich auch in der Energiepolitik auszudrücken beginnt. Dabei haben in erster Linie die beiden traditionellen Formen erneuerbarer Energie, also Wind- und Wasserkraft, eine spürbare Steigerung ihres Marktanteils verzeichnet [1]. Wie auch bei den fossilen Brennstoffen entstammt die Energie dieser Träger letztendlich der Sonnenstrahlung auf der Erde. Es ist daher nicht verwunderlich, daß auch die direkte Umwandlung der Sonnenstrahlung in Nutzenergie zu den Schlüsseltechnologien gezählt wird. An erster Stelle in der Aufmerksamkeit steht dabei die Photovoltaik, bei der üblicherweise in Solarzellen auf Siliciumbasis direkt elektrischer Strom gewonnen wird. Einem wirtschaftlichen Einsatz dieser Technik auf breiter Basis außerhalb von Nischen- und Einzellösungen stehen jedoch gegenwärtig etliche Probleme wie hohe Fertigungskosten, begrenzte Haltbarkeit und vor allem geringe Effizienz entgegen. Zudem ist die Gewinnung von elektrischem Strom keine Universallösung für den Ersatz fossiler Energieträger, insbesondere im Hinblick auf den Individualverkehr oder auf die Gewinnung von industriellen Rohstoffen. Hier erscheint die unmittelbare Gewinnung chemischer Energieträger, wie sie in der Natur durch die Photosynthese realisiert ist, als attraktivere und wirtschaftlichere Alternative. Für künftige technische Entwicklungen sowohl in der Photovoltaik als auch in einer technischen Photosynthese hat die natürliche Photosynthese Vorbildcharakter, 1

14 da sie in idealer Anpassung an die Strahlungsbedingungen auf der Erdoberfläche eine höchstmögliche Effizienz erzielt. Ein detailliertes Studium der Teilprozesse der natürlichen Photosynthese, insbesondere der dabei auftretenden elektrischen Ladungstrennung kann daher die wesentlichen Anhaltspunkte für die Entwicklung künftiger Technologien zur unmittelbaren und effizienten Nutzung der in der Sonnenstrahlung enthaltenen Energie liefern. Darüber hinaus ist das Studium der Photosyntheseprozesse auch von allgemeinem wissenschaftlichen Interesse, da sich viele Grundprinzipien aus Physik, Chemie und Biologie an den photosynthetischen Systemen exemplarisch studieren lassen. Beispielsweise beruht die hohe Effizienz der photosynthetischen Systeme auf der Kopplung vieler einzelner Reaktionsschritte mit optimierten kinetischen und thermodynamischen Parametern, viele Kontroll- und Regelmechanismen gewährleisten die Abstimmung der pflanzlichen Photosyntheseleistung auf das veränderliche Angebot an Sonnenstrahlung einerseits und den Energie- und Rohstoffbedarf des Organismus andererseits. Die Aufdeckung der molekularen Abläufe dieser aufeinanderfolgenden und ineinandergreifenden Teilprozesse erfordert ein hohes Maß an interdisziplinärer Forschung, zu der jede Fachrichtung ihre eigenen Methoden und Sichtweisen beiträgt. Die Physikalische Chemie hat sich von jeher besonders für die Primärschritte der Photosynthese interessiert. Dabei steht die Absorption eines Lichtquants am Anfang einer Folge unidirektionaler Reaktionsschritte, die die Anregungsenergie zum Aufbau eines stabilen chemischen Potentials nutzen. Alle dabei benötigten Moleküle sind in speziellen Enzymen den photosynthetischen Reaktionszentren in optimierter Weise räumlich fixiert. Es sind vor allem drei experimentelle Methoden, die an der Aufklärung der Primärschritte der Photosynthese beteiligt sind. Während die Röntgenstrukturanalyse an Einkristallen Klarheit über den grundlegenden Aufbau der photosynthetischen Reaktionszentren geliefert hat, verdanken wir wesentliche Kenntnisse über den zeitlichen Ablauf der Primärreaktionen der optischen Spektroskopie. Neben diesen beiden Methoden hat die Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR bzw. EPR für Elektronen-Paramagnetische Resonanz) kontinuierlich entscheidende Detailinformationen sowohl struktureller als auch dynamischer Art beigetragen. So wurde bereits 1971 auf der Basis eines EPR-Experiments ein Chlorophylldimer als Ausgangspunkt der photosynthetischen Ladungstrennung postuliert [2], was 1984 durch die erste Kristallstruktur des Reaktionszentrums aus dem Purpurbakterium Rhodopseudomonas viridis voll bestätigt wurde [3]. 2

15 Die Möglichkeit, aus einem EPR-Experiment strukturelle Aussagen abzuleiten, fußt auf der erheblichen Anisotropie der meisten magnetischen Wechselwirkungen. Neben der Zahl der auftretenden Wechselwirkungen, ihrer absoluten Größe und dem Ausmaß der Anisotropie sind es auch ihre relativen räumlichen Orientierungen, die die beobachtbaren Resonanzphänomene bestimmen. Fortschritte in der Meßtechnik erlauben es inzwischen, EPR-Signale auch zeitabhängig mit einer Zeitauflösung im Nanosekundenbereich zu detektieren. Dies hat einerseits die Adaption vieler Impulstechniken aus der Kernresonanz ermöglicht. Andererseits stößt die EPR damit in den Zeitbereich von chemischen Reaktionen und molekularen Bewegungen vor, die teilweise in Echtzeit verfolgt werden können. Es ist aber auch die Dynamik der Elektronenund Kernspins selber, die sich im Zeitverhalten der EPR-Signale manifestiert. Hochfrequente Quantenschwebungen, eine indirekte Folge der schnellen photosynthetischen Ladungstrennung, haben sich in den letzten Jahren als empfindliche Sonde zur verbesserten Strukturbestimmung herausgestellt [4 10]. Die vorliegende Arbeit faßt Berichte über Untersuchungen an drei unterschiedlichen Photosynthesesystemen zusammen, die mit Hilfe neuer Methoden der zeitaufgelösten Elektronenspinresonanz durchgeführt wurden. Dabei bildet das 5. Kapitel mit Untersuchungen zum sekundären Radikalpaar in Präparationen des photosynthetischen Reaktionszentrums aus dem Purpurbakterium Rhodobacter sphaeroides einen Schwerpunkt. Es schließt sich inhaltlich an eine dieser Arbeit vorangegangene Diplomarbeit an. Im Zentrum steht dabei die Frage, ob sich die räumliche Orientierung des primären Elektronendonators und des sekundären Akzeptors im Verlauf der Elektronenübertragungen gegenüber der Kristallstruktur verändert. Am Schluß des Kapitels steht ein aus einem zeitaufgelösten EPR-Experiment abgeleiteter Strukturvorschlag für das lichtinduzierte Radikalpaar P +, dessen Bedeutung für den Ablauf 865 Q A der Primärreaktionen Ausgangspunkt weiterer Untersuchungen sein kann. Kapitel 6 berichtet über Hochfeld-EPR-Untersuchungen an ganzen Zellen der Blaualge Synechococcus lividus. Durch das Feld des EPR-Magneten werden diese Zellen partiell orientiert. Das Kapitel 6 bietet eine qualitative und quantitative Analyse dieses Effekts, der wiederum auch zur Strukturbestimmung ausgenutzt werden kann. Kapitel 7 schließlich legt eine kinetische Untersuchung zu einem photosynthetischen Modellsystem vor. Bei diesem Modellsystem konnte in flüssigkristalliner Umgebung ein Elektronentransferschritt unmittelbar im EPR-Experiment verfolgt und kinetisch charakterisiert werden. 3

16 Bei der praktischen Durchführung der hier zusammengefaßten Arbeiten ergaben sich wiederholt grundlegende methodische Probleme einerseits bezüglich einer einheitlichen formellen Beschreibung von Radikalpaarstrukturen, andererseits im Hinblick auf die Charakterisierung der Genauigkeit der Strukturanalysen. Dies hat seinen Niederschlag in den Ausführungen am Ende des 3. Kapitels und in den Anhängen A und B gefunden, die die gewählte Vorgehensweise in einiger Ausführlichkeit darlegen. 4

17 Kapitel 2 Grundlagen zur Photosynthese 2.1 Die natürliche Photosynthese Einleitung Die Photosynthese entwickelte sich in Urorganismen vor mehr als 3.5 Milliarden Jahren, als es im Zuge der zunehmenden Ausbreitung des Lebens zu einer ersten Knappheit an primären nichtbiogenen organischen Nährstoffen kam. Durch die Nutzung des Sonnenlichts erschlossen sich die ersten photosynthetischen Organismen das ubiquitär vorhandene, aber nur unter hohem Energieeinsatz fixierbare CO 2 als Kohlenstoffquelle. Diese Organismen waren wie auch heute noch viele der einfachen photosynthetischen Bakterien auf starke Reduktionsmittel wie H 2 S angewiesen. Als eigentlicher Durchburch zur Nahrungsautarkie ist erst die Fähigkeit zur Wasserspaltung zu betrachten, die die ersten Organismen, Vorläufer der heutigen Cyanobakterien, vor 3.5 Milliarden Jahren erworben haben, wie sich an Sedimenten gut datieren läßt. Der bei der oxygenen Photosynthese freigesetzte Sauerstoff bewirkte den Übergang von einer reduzierenden zu einer oxidierenden Atmosphäre, in der einerseits die nichtbiogene Nachbildung von organischen Nährstoffen praktisch unterdrückt ist, während andererseits die Ausbildung einer Ozonschicht in der Stratosphäre durch die Ausfilterung harter UV-Strahlung aus dem Sonnenlicht die Inbesitznahme des Festlandes als Lebensraum ermöglichte. Heute bildet die Sonnenenergie über die Photosynthese die Grundlage praktisch allen irdischen Lebens; die Photosynthese erschließt zudem das Reservoir an anorga- 5

18 nischem Kohlenstoff (Kohlendioxid bzw. Karbonat) als Nährstoffquelle und erzeugt den Sauerstoff für den respirativen Stoffwechsel der höheren Organismen Allgemeine Prinzipien Die Grundgleichung der Photosynthese wurde erstmals vollständig im Jahre 1842 von Robert Mayer im Rahmen seiner Arbeiten zum ersten Hauptsatz der Thermodynamik formuliert und lautet 6 CO H 2 O hν C 6 H 12 O O 2, G 0 = 2868 kj/mol. (2.1) Sie gilt in dieser Form allerdings nur für die pflanzliche Photosynthese, die zur photolytischen Spaltung von Wasser befähigt ist. Allgemeiner formuliert man daher die Photosynthesereaktion als endotherme Photoredoxreaktion H 2 D + A hν D + H 2 A. (2.2) Allerdings ist der tatsächliche Ablauf wesentlich komplexer, als es Gleichung (2.2) suggeriert. Die Teilschritte sind durch eine Vielzahl unterschiedlicher Enzyme katalysiert, die in der lebenden Zelle räumlich getrennt sind und in der Reaktionssequenz durch stabile Intermediate gekoppelt sind. Eine grobe Einteilung kann vorgenommen werden in die Abschnitte der Reaktionssequenz, die nach der Photonenabsorption in mehreren Schritten solch ein stabiles Intermediat produzieren (Lichtreaktionen), und solche, die ohne weitere Lichteinwirkung diese Intermediate weiter umsetzen (Dunkelreaktionen) [11] Dunkelreaktionen Die Dunkelreaktionen sollen im Rahmen dieser Einführung nur kurz gestreift werden, da sie für die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen ohne Belang sind. Der wohl wichtigste Teil der Dunkelreaktionen ist die CO 2 -Fixierung im Calvin- Zyklus. Die eigentliche CO 2 -Bindung erfolgt durch das Enzym Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase (Rubisco), das das häufigste Enzym der globalen Biomasse ist. Bei der Fixierung eines Moleküles CO 2 werden drei Moleküle ATP als Energielieferant 6

19 und zwei Moleküle NADPH als Reduktionsäquivalent verbraucht. Der hohe Energiebedarf der CO 2 -Fixierung erklärt ihre biochemische Kopplung an die Energiegewinnung aus der Photosynthese. Das Primärprodukt des Calvin-Zyklus, die C 3 -Verbindung D-Glycerinaldehyd-3- Phosphat (GAP) ist das Ausgangsprodukt der Kohlehydratsynthese Lichtreaktionen Im Rahmen der Physikalischen Chemie sind die Lichtreaktionen von besonderem Interesse, die die Energie des einfallenden Lichtes unmittelbar in chemische Energie umsetzen. Schon lange ist bekannt, daß die primäre Lichtabsorption hauptsächlich durch den Blattfarbstoff Chlorophyll bewerkstelligt wird. Das Chlorophyll ist in den photosynthetisch aktiven Organismen in speziellen Proteinkomplexen, den photosynthetischen Reaktionszentren, als funktionstragender Kofaktor gebunden. Die photosynthetischen Reaktionszentren wiederum, allesamt Membranproteine, sind je nach Organismus in eigenen Zellkompartimenten oder in gesonderten Bereichen der Zellmembran fixiert, in der Nähe der übrigen an den Primärschritten der Photosynthese beteiligten Proteine. Lichtabsorption. Zu den Primärschritten der Photosynthese, die in den Reaktionszentren ablaufen, gehören im wesentlichen Elektronentransferreaktionen, die von einem photophysikalisch angeregten Chlorophyll ihren Ausgang nehmen. In aller Regel wird jedoch dieses Chlorophyll nicht unmittelbar durch das einfallende Licht angeregt, sondern übernimmt die Anregungsenergie über einen Förster-Energie-Transfermechanismus von Hilfschlorophyllen (Antennenchlorophylle), die in großer Zahl entweder im Reaktionszentrum eingebettet sind (Pflanzliches Photosystem I) oder in speziellen Proteinen, den Lichtsammelkomplexen (engl. Light Harvesting Complexes, LHCs) untergebracht sind. Das zentrale Chlorophyll des Reaktionszentrums, von dem die Elektronentransferreaktionen ausgehen, ist in allen bekannten Reaktionszentren als Dimer (engl. Special Pair) ausgebildet. Dabei trägt die elektronische Kopplung der delokalisierten Elektronensysteme zur Verringerung der Anregungsenergie relativ zu den Antennenchlorophyllen bei, so daß das zentrale Chlorophyll als Energiesenke der elektronischen Anregungsenergie wirkt. 7

20 Elektronentransfer. Das angeregte Chlorophylldimer bildet den primären Donator für die folgenden Elektronentransferschritte und liegt daher bis zu seiner Rereduktion als Radikalkation vor. Der Dimercharakter des Radikalkations ist dabei bei den verschiedenen Reaktionszentren unterschiedlich stark ausgeprägt; während die Reaktionszentren der Purpurbakterien bei Raumtemperatur eine Spindichteverteilung von 2:1 innerhalb des Special pair aufweisen [12, 13], scheint beim Pflanzlichen Photosystem I eher ein funktionales Monomer vorzuliegen [14, 15]. Über mehrere Zwischenschritte wird eine weitere räumliche Trennung der Ladung bewerkstelligt, so daß man die photosynthetischen Reaktionszentren auch als Solarbatterien charakterisieren könnte. Der Aufbau einer elektrischen Spannung impliziert das Risiko der Ladungsrekombination, die einem vollständigen Verlust der Anregungsenergie gleichkommt. Eine hohe Quantenausbeute, wie sie in den natürlichen photosynthetischen Reaktionszentren realisiert ist, erfordert daher möglichst irreversible Elektronentransferschritte, entsprechend einer hohen Entropieproduktion. Ein großer Teil der ursprünglichen Anregungsenergie wird daher bereits in den Primärschritten als Wärme dissipiert, was den absoluten Wirkungsgrad der Photosynthese verringert. Man kann hierin eine evolutionäre Anpassung an die Strahlungssituation auf der Erde sehen, wo die atmosphärischen Strahlungsfenster im sichtbaren Bereich zwar hochenergetische Strahlung passieren lassen, die absolute Strahlungsintensität bedingt durch Streueffekte (Wolken) und Konkurrenzsituationen (Blätterdach im Wald) jedoch gering ausfällt. In diesem Sinne ist auch das ausgedehnte System von Antennenchlorophyllen zu verstehen, das eine wesentliche Erhöhung des effektiven Einfangsquerschnitts für Photonen bewirkt. Die Normalpotentiale innerhalb der Elektronentransferkette scheinen sehr genau auf eine hohe Quantenausbeute hin zugeschnitten zu sein [16]. Der weitere Verlauf der Lichtreaktionen mit der Synthese von ATP und NADPH unterscheidet sich bei der anoxygenen Photosynthese (Purpur-, Schwefelbakterien) und der oxygenen Photosynthese (Cyanobakterien und grünen Pflanzen). Diese Folgereaktionen werden daher in getrennen Abschnitten (2.2.3 und 2.3.3) vorgestellt. 8

21 2.2 Bakterielle Photosynthese Photosynthetische Bakterien Die photosynthetischen Bakterien lassen sich in verschiedene Familien einteilen, in denen zwei unterschiedliche Typen von Reaktionszentren auftreten. Ein phylogenetischer Stammbaum der verschiedenen photosynthetischen Bakterien ist in Abbildung 2.1 dargestellt. Ein Reaktionszentrum vom Typ I findet sich bei den grünen Schwefelbakterien und den Heliobakterien. Reaktionszentren vom Typ II finden sich beispielsweise bei den Purpurbakterien. Gemeinsam ist diesen Bakterien, daß sie nicht zur Wasserspaltung befähigt und damit auf stärkere Reduktionsmittel wie H 2 S angewiesen sind. Ihre Photosyntheseprozesse setzen daher auch keinen Sauerstoff frei, und viele der genannten Bakterien können nur unter strikt anaeroben Bedingungen gedeihen. Seit der Entstehung der oxygenen Photosynthese und der massiven Freisetzung von Sauerstoff in die Atmosphäre vor ungefähr 3.5 Milliarden Jahren ist der Lebensraum dieser Organismen auf wenige ökologische Nischen beschränkt. Andere Vertreter der Gruppe haben in Anpassung an die oxidierende Atmosphäre zusätzlich zur Photosynthese auch die Fähigkeit zur respiratorischen Energiegewinnung erworben. Bakterien Eukaryoten Oxygene Photosynthese Cyanobakterien PS II PS I Endosymbiose Eukaryotische Algen, grüne Pflanzen Anoxygene Photosynthese Purpurbakterien Heliobakterien grüne fädige Bakterien grüne Schwefelbakterien Archaea Typ II RZ Typ I RZ Abbildung 2.1: Stammbaum der verschiedenen Familien photosynthetisch aktiver Bakterien (nach einer Abbildung von Schubert et al. [17]). 9

22 Der evolutionäre Durchbruch zur Photoautotrophie gelang den Cyanobakterien (Blaualgen), die durch die Kopplung von zwei Reaktionszentren des Typs I und II die nötige Redoxkraft zur Wasseroxidation aufbauen. Von den Cyanobakterien führt ein gerader Weg zur pflanzlichen Photosynthese, da die Chloroplasten der eukaryotischen Pflanzenzellen als Nachfahren endosymbiontisch lebender Cyanobakterien angesehen werden. Die Photosynthese der Cyanobakterien wird daher im Abschnitt 2.3 mit der pflanzlichen Photosynthese vorgestellt. Die ebenfalls photosynthetisch aktiven Halobakterien benutzen einen völlig anderen, dem Sehprozess verwandten Energiegewinnungsprozeß und sollen hier nicht weiter betrachtet werden Typen von Reaktionszentren Reaktionszentren vom Typ I benutzen Chlorophylle als primäre Elektronenakzeptoren, während bei den Typ-II-Reaktionszentren Pheophytine (Mg 2+ -freie Basen der Chlorophylle) zum Einsatz kommen. Weiterhin verfügen Typ-II-Reaktionszentren über Chinone als austauschbar gebundene terminale Elektronenakzeptoren, während in Reaktionszentren vom Typ I die Chinone Elektronen über mehrere Eisen-Schwefel-Cluster weiterleiten, die dann lösliche Elektronentransportproteine wie Ferredoxin reduzieren Das Purpurbakterium Rhodobacter sphaeroides Organismus. Die in Kapitel 5 vorgestellten EPR-Untersuchungen wurden an einem photosynthetischen Reaktionszentrum des Typs II aus dem Purpurbakterium Rhodobacter sphaeroides durchgeführt. Rb. sphaeroides ist ein außerordentlich vielseitiger Organismus, der in nährstoffreichen Gewässern lebt. Neben der Photosynthese beherrscht Rb. sphaeroides auch die Energiegewinnung über aerobe und anaerobe Respiration, ist zur Fixierung von molekularem Stickstoff befähigt und besitzt eine elementare chemische Wahrnehmung seiner Umgebung. Das photosynthetische Reaktionszentrum von Rb. sphaeroides ist eines der kleinsten und einfachsten photosynthetischen Reaktionszentren überhaupt und wird daher gerne als Referenzsystem in der Photosyntheseforschung eingesetzt. 10

23 Abbildung 2.2: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Ultradünnschnittpräparates von Rb. sphaeroides. Die tubulären Chromatophoren, deren Membranen die Reaktionszentren beherbergen, sind in der Aufnahme als kreisförmige helle Flecken zu erkennen. Die Aufnahme wurde freundlicherweise von Herrn Dr. J. Golecki (Institut für Biologie II, Universität Freiburg) zur Verfügung gestellt. Im lebenden Organismus befinden sich die Photosysteme bei den Purpurbakterien in Einstülpungen der Cytoplasmamembran, die als Chromatophoren bezeichnet werden. Sie sind bei Rb. sphaeroides tubulär ausgebildet und in Abbildung 2.2 als kreisförmige helle Flecken zu erkennen. In der Folge des photosynthetischen Elektronentransports werden Protonen aus dem Cytoplasma in das Periplasma übertragen, dem Zwischenraum zwischen der äußeren Zellmembran und der Cytoplasmamembran. Reaktionszentrum. Abbildung 2.3 zeigt die räumliche Anordnung der Kofaktoren im Reaktionszentrum von Rhodobacter sphaeroides. Die gezeigten Pigmente sind eingebettet in einen Proteinkomplex mit einem Molekulargewicht von ungefähr 101 kda, der sich aus drei Untereinheiten zusammensetzt, den membranintegralen Einheiten L (light) und M (medium) und der cytoplasmatischen H-Einheit (heavy). Auffallend ist die weitgehende C 2 -Symmetrie der molekularen Anordnung, in deren Zentrum sich ein Bacteriochlorophylldimer als primärer Donator P 865 befindet. Trotz dieser hohen Symmetrie verläuft der Elektronentransfer vollständig unidirektional über den L-Zweig. Bemerkenswerterweise liegt dies nicht an unterschiedlichen Kofaktoren in beiden Hälften, vielmehr sind Wechselwirkungen der Proteinumgebung 11

24 P 865 M B B B A L H B H A Q B Fe 2+ Q A H Abbildung 2.3: Räumliche Anordnung der Kofaktoren im photosynthetischen Reaktionszentrum aus Rb. sphaeroides. Die Einbettung des Reaktionszentrums in die Membran ist angedeutet. Erkennbar ist die nahezu symmetrische Anordnung der Kofaktoren innerhalb der beiden membranintegralen Proteineinheiten L und M. Die Abbildung beruht auf der Röntgenstruktur 1PCR [18]. mit den eingebetteten Pigmenten für die erheblichen Unterschiede in den Redoxpotentialen der beiden Zweige verantwortlich. Die genauen Ursachen und der physiologische Sinn dieser Unidirektionalität werden zur Zeit noch intensiv erforscht [19 23]. In der Nähe von P 865 befinden sich zwei weitere Bacteriochlorophylle, B A und B B, die sogenannten akzessorischen Chlorophylle. Sie spielen möglicherweise eine Rolle beim Excitonentransfer zum primären Donator. Nach neuen Befunden ist B A außerdem am sequentiellen Elektronentransfer beteiligt. In ebenfalls symmetrischer Anordnung finden sich zwei Bacteriophaeophytinmoleküle, H A und H B. Das Phaeophytin entspricht dabei gerade der freien Porphyrinbase des Bacteriochlorophylls. Die Pigmentausstattung des Reaktionszentrums wird komplettiert durch die zwei Ubichinonmoleküle Q A und Q B und ein Fe 2+ -Ion, das auf der Symmetrieachse zwischen den beiden Chinonen angeordnet ist. Bei dem ansonsten sehr ähnlich aufge- 12

25 bauten Reaktionszentrum des Purpurbakteriums Rhodopseudomonas viridis ist Q A ein Menachinon. Zusätzlich zu den in Abbildung 2.3 gezeigten Pigmenten enthält das Reaktionszentrum von Rhodobacter sphaeroides auf der M-Seite in der Nähe des primären Donators ein Carotinoid-Molekül (Sphaeroiden), das unter sättigenden Lichtbedingungen zur Löschung von Triplett-Zuständen des primären Donators dient. Es fehlt bei der in dieser Arbeit untersuchten Mutante R-26. Ladungstrennung im Reaktionszentrum. Die primäre Ladungstrennung im Reaktionszentrum nimmt ihren Anfang mit der optischen Anregung des primären Donators P 865, der in einen angeregten Singulettzustand übergeht. Aus diesem Zustand erfolgt dann die Abgabe eines Elektrons. Die Reduktion des sogenannten primären Akzeptors H A erfolgt mit einer Zeitkonstante von 3.5 ps. Nach neueren Erkenntnissen ist aber auch B A an der primären Ladungstrennung beteiligt, wobei die Lebensdauer von B A mit ungefähr 0.9 ps allerdings außerordentlich kurz ist [24]. H A gibt mit einer Zeitkonstante von 200 ps wiederum ein Elektron an Q A ab unter Bildung des sogenannten sekundären Radikalpaars P +, dessen Struktur Thema von Kapitel 5 ist. 865 Q A Q A überträgt das Elektron binnen 100 µs weiter zum tertiären Akzeptor Q B. Eine intermediäre Reduktion des Fe 2+ -Ions wird dabei nicht beobachtet. Tatsächlich läßt sich dieses Kation aus dem Reaktionszentrum entfernen oder durch andere zweiwertige Kationen ersetzen, ohne die Funktion des Reaktionszentrums zu beeinträchtigen [25]. Der terminale Akzeptor Q B fungiert als Zweielektronenakzeptor und akkumuliert die in zwei aufeinanderfolgenden Elektronentransfersequenzen übertragene Ladung. Nach Aufnahme zweier Protonen von der cytoplasmatischen Seite verläßt es als Hydrochinon das Reaktionszentrum in die Lipiddoppelschicht der Membran hinein und wird aus dem dort befindlichen Chinonpool gegen neues Chinon ausgetauscht. In einer noch nicht im Detail verstandenen Weise ist die Elektronenübertragung zwischen Q A und Q B möglicherweise mit einer Umlagerung von Q B verbunden, dessen Kopfgruppe unter 180 -Drehung zwischen zwei um 5 Å auseinanderliegenden Positionen wechseln kann [26, 27]. 13

26 Folgereaktionen. Das in die Membran abgegebene Hydrochinon diffundiert zu einem weiteren Membrankomplex, dem Cytochrom-bc 1 -Komplex, und durchläuft dort einen Zyklus, in dessen Verlauf zwei weitere Protonen aus dem Cytoplasma aufgenommen werden. Nach Reoxidation des Chinons werden insgesamt vier Protonen auf der periplasmatischen Seite der Membran wieder abgegeben, während die Elektronen auf ein lösliches Cytochrom-C im Periplasma übertragen werden. Dieses diffundiert zurück zum Reaktionszentrum und stellt dort die Elektronen zur Rereduktion des primären Donators zur Verfügung. Damit ist der elektrische Kreislauf geschlossen. In Kombination wirken das Reaktionszentrum, der Cytochrom-bc 1 -Komplex und das lösliche Cytochrom-C als lichtgetriebene Protonenpumpe, die über die Membran einen ph-gradienten erzeugt. Das resultierende chemische Potential dient einem weiteren Membrankomplex, der ATP-Synthase, als Triebkraft für die ADP-Phosphorylierung. Mit ATP steht dem Organismus dann eine universelle Energiewährung zur Verfügung. Ein kleiner Teil der Elektronen wird stetig dem zyklischen Fluß entnommen und zur Reduktion von NADP + zur NADPH genutzt, das dem Organismus als universelles Reduktionsäquivalent dient. Die fehlenden Elektronen werden aus leicht oxidierbaren organischen oder anorganischen Verbindungen ergänzt, beispielsweise Sulfiden. Der Gesamtablauf der Primärreaktionen ist in Abbildung 2.4 dargestellt. Deutlich wird da- Abbildung 2.4: Zyklischer Elektronentransport in den Lichtreaktionen im Purpurbakterium Rb. sphaeroides. Die Antennenkomplexe sind nicht dargestellt. Nach einer Abbildung von J. Deisenhofer [28]. 14

27 bei der zyklische Ladungstransfer zwischen Reaktionszentrum und dem Cytochrombc 1 -Komplex. Dies bedeutet, daß die Primärreaktionen an den in Gleichung (2.2) dargestellten Redoxprozessen nicht direkt beteiligt sind. Diese gehören zu den Dunkelreaktionen, und die Lichtreaktionen liefern lediglich die nötige Energie in Form von ATP. 2.3 Pflanzliche Photosynthese Cyanobakterien und Chloroplasten Die grünen Pflanzen wie auch eukaryotische Algen verfügen in ihren komplex aufgebauten Zellen über spezielle Kompartimente, die Chloroplasten, die die Photosynthese bewerkstelligen. Diese Zellorganellen besitzen eine eigene DNA, aus der die genetische Verwandtschaft mit den prokaryotischen Cyanobakterien hervorgeht. Im Laufe der Evolution wurden also einfachere photosynthetische Organismen im Sinne einer endosymbiontischen Beziehung in die eukaryotischen Zellen integriert. Untersuchungen zur Photosynthese der Cyanobakterien liefern daher auch Einblick in die photosynthetische Energiegewinnung der Pflanzen. Da das Kapitel 6 über Untersuchungen am Cyanobakterium Synechococcus lividus berichtet, werden die Lichtreaktionen der pflanzlichen Photosynthese hier anhand dieses Organismus vorgestellt Thylakoidsystem Bei den Cyanobakterien und den Chloroplasten der grünen Pflanzen befinden sich die Proteine der photosynthetischen Elektronentransportkette in einem eigenständigen Membransystem, den Thylakoiden. In Abbildung 2.5, die eine Zelle des Cyanobakteriums Synechococcus lividus zeigt, sind die Thylakoide, die flachen Vesikeln ähneln, als dünne Doppellinien in der Zellperipherie zu erkennen, die der Kontur der äußeren Zellwand folgen. Jede der Linien entspricht einer Lipiddoppelschicht der photosynthetischen Membran. Bei den grünen Pflanzen nutzen die Thylakoide das ganze verfügbare Volumen der Chloroplasten, sie sind zudem vielfach zu Stapeln übereinandergeschoben. 15

28 2.3.3 Elektronentransportkette Charakteristisch für die pflanzliche Photosynthese ist die Koppelung zweier Reaktionszentren, die bei verschiedenen Redoxpotentialen arbeiten. Das Pflanzliche Photosystem II (PS II), dessen Reaktionszentrum zum Typ II gehört, erreicht dabei unter Lichtanregung das zur Oxidation von Wasser nötige Redoxpotential. Die eigentliche Wasseroxidation läuft dabei nach einem noch nicht im Detail verstandenen Mechanismus an einem speziellen katalytischen Zentrum an der luminalen Peripherie des Reaktionszentrums ab, dem Wasseroxidierenden Komplex (Water Oxidizing Complex, WOC, auch Oxygen Evolving Complex, OEC), dessen Zentrum ein Verbund aus 4 Manganatomen bildet. Obwohl vom PS II bislang keine hochauflösende Röntgenstruktur existiert, wird auf der Basis der Aminosäuresequenzen und aufgrund von spektroskopischen Befunden eine hohe Ähnlichkeit des inneren Aufbaus mit den Reaktionszentren der Purpurbakterien vermutet; auch die Elektronentransferschritte entsprechen der Schilderung in Abschnitt Abbildung 2.5: Elektronenmikroskopische Schnittaufnahme des Cyanobakteriums S. lividus. Die Pfeile bezeichnen einige der Thylakoide. Die wellige Struktur der Zellwand ist ein Artefakt der Präparation. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Dr. J. Golecki, Institut für Biologie II der Universität Freiburg. 16

29 17 Abbildung 2.6: Photosyntheseapparat der Cyanobakterien. Elektronentransferschritte sind durch Pfeile im Fettdruck, chemische Reaktionen und Transportprozesse durch dünne Pfeile bezeichnet. OEC: Oxygen Evolving Complex, Fd: Ferredoxin, FNR: Ferredoxin- NADP + -Reduktase. Darstellung in Anlehnung an eine Abbildung von D. Ort [29].

30 Das Pflanzliche Photosystem I (PS I) besitzt ein Reaktionszentrum des Typs I, wie es auch bei den grünen Schwefelbakterien und den Heliobakterien auftritt. Der Aufbau des ungefähr 340 kda großen Komplexes ist durch eine neue hochauflösende Kristallstruktur mittlerweile gut bekannt [30]. Neben den Pigmenten der Elektronentransferkette beherbergt es ein primäres Antennensystem mit Chlorophyll-a- sowie ca. 20 Carotinoid-Molekülen. Im PS I treten als terminale Akzeptoren drei Eisen- Schwefel-Cluster auf, die als F X, F A und F B bezeichnet werden. Abbildung 2.6 zeigt schematisch den Gesamtablauf des linearen Elektronentransports durch die beiden Reakionszentren sowie den zwischengeschalteten Cytochrom-b 6 f-komplex. Die zweimalige Lichtanregung von P 680 in PS II führt zur Abgabe von Plastohydrochinon in den Chinonpool der Membran. Die Elektronen zur Rereduktion von P 680 werden im WOC aus Wasser entnommen. Plastohydrochinon wird im Cytochrom-b 6 f-komplex wieder oxidiert, wobei die Elektronen entweder nacheinander auf den Einelektronenüberträger Cytochrom-c 6 (bzw. Plastocyanin in Chloroplasten) übertragen werden, oder optional einen Q-Zyklus durchlaufen, der wie in den Purpurbakterien zu einem zusätzlichen Protonentransport über die Membran führt. Cytochrom-c 6 diffundiert zum PS I-Komplex und reduziert dort P Am Ende des lichtgetriebenen Elektronentransports im PS I schließlich steht die Elektronenübertragung vom Eisen-Schwefel-Zentrum F B auf ein im Stroma befindliches Ferredoxin, das dann als Kofaktor der NADP + -Reduktase wirkt. Alternativ kann im zyklischen Elektronentransport ohne Beteiligung von PS II das Ferredoxin Elektronen am Cytochrom-b 6 f-komplex einspeisen. Der Verbund von Cytochrom-b 6 f-komplex und PS I agiert dann in Analogie zum zyklischen Elektronentransfer der Purpurbakterien lediglich als lichtgetriebene Protonenpumpe. Wie bei den Purpurbakterien ist das Enzym ATP-Synthase Nutznießer des Protonengradienten, der im linearen wie im zyklischen Elektronentransfer aufgebaut wird. Das stromaseitig synthetisierte ATP wie NADPH wird schließlich bei der CO 2 -Fixierung im Calvin-Zyklus wieder verbraucht. 18

31 Kapitel 3 Elektronenspinresonanz 3.1 Einleitung Der Frequenzbereich der verwendeten elektromagnetischen Strahlung ordnet die Elektronenspinresonanzspektroskopie (ESR-Spektroskopie), auch als Paramagnetische Resonanzspektroskopie (EPR-Spektroskopie) bezeichnet, der Mikrowellenspektroskopie zu. Während aber in der klassischen Mikrowellenspektroskopie elektrische Dipolübergänge zwischen molekularen Rotationsniveaus vor allem in Gasen untersucht werden, studiert die EPR-Spektroskopie magnetische Dipolübergänge zwischen Elektronenspinniveaus vor allem in kondensierten Phasen. Wie bei allen Methoden der magnetischen Resonanz sind die Energiedifferenzen in den magnetischen Freiheitsgraden bei typischen chemischen und biologischen Fragestellungen so gering, daß die Untersuchungsmethode selbst keine Veränderungen in der Struktur und Dynamik der zu spektroskopierenden Systeme induziert 1. Andererseits sind die in der magnetischen Resonanz ausgenutzten Energiedifferenzen sehr sensible Sonden für molekulare Strukturen. Während die kernmagnetische Resonanz eine analytische Standardmethode mit sehr großer Anwendungsbreite ist, eignet sich die Elektronenspinresonanz nur für Systeme mit ungepaarten Elektronen. Sie findet damit ihre Hauptanwendung im Studium von Übergangsmetallkomplexen und Reaktionsintermediaten, insbesondere auch bei biologischen Prozessen. 1 Eine in der aktuellen Diskussion um die pathologischen Wirkungen schwacher Hochfrequenzfelder interessante abweichende Hypothese findet sich in [31]. 19

32 3.2 Der Elektronenspin Elektronen besitzen neben ihrer elektrischen Ladung und ihrer Ruhemasse als weitere charakteristische Eigenschaft einen Eigendrehimpuls s, den Elektronenspin. In der Quantenmechanik korrespondiert zum Elektronenspin der Spinoperator ŝs. Da seine Komponenten in den drei Raumrichtungen nicht miteinander kommutieren, besitzt er allerdings keine Eigenfunktionen. Definiert sind aber das Betragsquadrat s 2 und eine Komponente des Spinvektors entlang einer wählbaren Raumrichtung. Letztere wird üblicherweise entlang der z-achse des Laborsystems gewählt. Das Betragsquadrat des Spinvektors berechnet sich über den Operator ŝ2 mit den Eigenwerten hs(s+1), wobei h das Plancksche Wirkungsquantum in Drehimpulseinheiten bezeichnet. Die Quantenzahl s besitzt für ein einzelnes Elektron stets den Wert 1 2. Der Operator für die z- Komponente des Spinvektors ŝ z besitzt die Eigenwerte hm s, wobei m s für das einzelne Elektron die Werte und 1 2 annehmen kann. Ein Spinsystem mit zwei Elektronen A und B läßt sich entweder in der Produktbasis (Zeeman-Basis) mit den Zustandsvektoren m s,a ;m s,b oder in der Singulett-Triplett- Basis (ST -Basis) mit den Zustandsvektoren S,M S beschreiben, wobei für S und M S die Einschränkungen S = 0,1 M S = 0 für S = 0 = 1,0,1 für S = 1 gelten. Bei Abwesenheit magnetischer Wechselwirkungen sind die vier möglichen Zustände T + = 1, +1 = ;+ 1 2 T 0 = 1, 0 = 2 1 ( ; ) 2 ;+1 2 T = 1, 1 = 1 2 ; 1 2 S = 0, 0 = 2 1 ( ; ;+ 2 1 ) und (3.1) entartet. 20

33 3.3 Wechselwirkungen in der EPR-Spektroskopie Zeeman-Wechselwirkung. µ e verknüpft: µ e = g e µ B s. Mit dem Elektronenspin s ist ein magnetisches Moment (3.2) Dabei ist g e der g-faktor des freien Elektrons und µ B = 2m e h e das Bohrsche Magneton, wobei e die Elementarladung und m e die Ruhemasse des Elektrons bezeichnen. In einem Magnetfeld B 0 ist die Energie des Elektrons abhängig von der Orientierung des magnetischen Moments relativ zur Richtung des Magnetfeldes: E = µ e B 0. (3.3) Wird das Koordinatensystem so gewählt, daß das Magnetfeld mit der z-achse kollinear ist, so vereinfacht sich die Gleichung zu E = µ z B 0, (3.4) wobei µ z die z-komponente von µ e bezeichnet. Der Übergang zur Quantenmechanik liefert den Hamilton-Operator der Zeeman- Wechselwirkung : Ĥ Z = g e µ B B 0 ŝ z = g e µ B B 0 m s. (3.5) Die Zeeman-Wechselwirkung hebt die Entartung von Zuständen mit unterschiedlicher Quantenzahl m s bzw. M S auf. ĤZ ist sowohl in der Zeeman-Produkt-Basis als auch in der Singulett-Triplett-Basis diagonal. Gleichung (3.5) beschreibt streng nur die Aufspaltung der Spinterme des freien Elektrons im Magnetfeld. Ungepaarte Elektronen in Molekülen besitzen zusätzlich einen Bahndrehimpuls, der prinzipiell ebenfalls ein magnetisches Moment hervorruft, das zudem über die Spin-Bahn-Kopplung mit dem magnetischen Spinmoment in Wechselwirkung tritt. Allerdings verschwindet das effektive magnetische Bahnmoment bei nichtlinearen Molekülen, so daß nur über die Spin-Bahn-Kopplung kleine Verschiebungen ( 10 4 ) der Zeeman-Terme beobachtet werden. Sie lassen sich berücksichtigen, indem man in Gleichung (3.2) anstelle des skalaren g-faktors g e des freien Elektrons einen effektiven, anisotropen g-faktor einführt, der durch einen molekülfesten Tensor zweiter Stufe beschrieben wird. Damit sind µ e und s nicht mehr 21

34 parallel. Wegen der in der Regel kleinen Anisotropie des g-tensors kann in der Hochfeldnäherung Gleichung (3.5) zu Ĥ Z = µ B B 0 gŝs = µ B B 0 g eff ŝ z = µ B B 0 g eff m s (3.6) umgeschrieben werden, wobei g eff = (gz) gz gilt, wenn z den Einheitsvektor in Richtung des Magnetfeldes bezeichnet. Austauschwechselwirkung. Zwischen Elektronen, deren Ortsfunktionen sich räumlich überlappen, besteht eine Ortskorrelation, die vom Spinzustand abhängt. Diese Austauschwechselwirkung hebt die Entartung von Zuständen unterschiedlicher Multiplizität auf: in der ST-Basis (3.1) werden die drei Triplettzustände gegenüber S energetisch abgesenkt. Der Hamilton-Operator der Austauschwechselwirkung lautet ( ) 1 Ĥ J = J 2 + 2ŝs A ŝs B. (3.7) Die Austauschwechselwirkung ist eine isotrope Wechselwirkung, die in komplexer Weise von der Struktur der Radikale abhängt und daher nur mit großem Aufwand berechenbar ist. Für Radikalpaare kann man in guter Näherung annehmen, daß der Parameter J exponentiell mit dem Kantenabstand der spintragenden Komponenten abnimmt. Die Austauschwechselwirkung ist nur in der ST-Basis diagonal. Daher sind bei Systemen mit endlichem J die Quantenzahlen m i der einzelnen Elektronen unbestimmt. Dipol-Dipol-Wechselwirkung. Auch die dipolare Wechselwirkung der magnetischen Momente ungepaarter Elektronen führt zu einer Aufhebung der Entartung der Basisfunktionen (3.1). Anders als die Austauschwechselwirkung hängt die Größe und das Vorzeichen der Dipol-Dipol-Wechselwirkung von der räumlichen Verteilung der Spindichten ab, charakterisiert durch den Abstandsvektor ˆr. Der Hamilton-Operator der Dipol-Dipol-Wechselwirkung lautet H D = µ {ŝs 0 4π g2 eµ 2 A ŝs B B ˆr 3 3(ŝs } Aˆr)(ŝs Bˆr) ˆr 5 (3.8) = ŜS DŜS. (3.9) 22

35 Der Tensor D lautet in seinem Hauptachsensystem D (D) = 1 3 D E D + E D. (3.10) D und E sind die Nullfeldparameter, die sich bei der Integration von (3.8) ergeben. Bei typischen langreichweitigen Radikalpaaren ist E = 0 und D weist axiale Symmetrie auf. Aus dem Nullfeldparameter D ist im Rahmen der Punkt-Dipol-Näherung direkt der Abstand r der Radikale, bzw. der Schwerpunkte der Spindichte-Verteilung ablesbar: r = g 2 eµ 2 B D µ 0 4π. (3.11) Die Operatoren H J und H D werden zum Feinstrukturoperator der Spin-Spin- Wechselwirkung zusammengefaßt: H SS = H J + H D. (3.12) Hyperfeinwechselwirkung. weisen dementsprechend ein magnetisches Kernmoment Viele Atomkerne besitzen einen Kernspin I > 0 und µ N = g N γ N I (3.13) auf. Die magnetischen Momente von Atomkern und Elektron sind über die Hyperfeinwechselwirkung verknüpft, die sowohl skalare als auch dipolare Anteile enthält. Sie läßt sich daher durch einen molekülfesten Tensor zweiter Stufe beschreiben: H HFS = ŝsaîi. (3.14) In vielen Fällen genügt es, nur den Säkularanteil der Hyperfeinwechselwirkung zu berücksichtigen, der gegeben ist durch H HFS,zz = ŝ z A zz Î z. (3.15) Alle im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Rechnungen verwenden diese Säkularnäherung. 23