Anwendung der Mikroorganismen für die Synthese von chiralen Terpene-Derivaten.

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Hinrich Adler
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1 Anwendung der Mikroorganismen für die Synthese von chiralen Terpene-Derivaten. Terpene Terpene sind eine sehr große Gruppe von Naturstoffen, die in Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen zu finden sind. Diese Naturstoffe sind aus Isopreneinheiten aufgebaut. Die Terpene besitzen keine funktionellen Gruppen. Jedoch können sie mit anderen Gruppen, z.b. Alkohol, Aldehyd, Keton und Ester, verknüpft sein. Diese funktionalisierten Terpene werden aber dann als Terpenoide bezeichnet. Abbildung 1: Isopreneinheit Nach Anzahl der enthaltenen Isopreneinheit im Grundgerüst des Moleküls werden Terpene in verschieden Klassen unterteilt. In Tabelle 1 sind die verschiedenen Klassen der Terpene sowie die wichtigen Vertreter jeder Klasse aufgelistet. Zu den wichtigen Eigenschaften der Terpene gehören folgende Eigenschaften: - hohe Lipophilie durch Kohlenstoffketten - Flüchtig - Aromatischer Geruch.

Tabelle 1: Unterteilung der Terpene nach Zahl der Isopreneinheit. Terpene im Einsatz Viele Pflanzen erzeugen flüchtige Terpene, um Insekten als Fraßfeinde zu vertreiben.

2 Tabelle 1: Unterteilung der Terpene nach Zahl der Isopreneinheit. Terpene im Einsatz Viele Pflanzen erzeugen flüchtige Terpene, um Insekten als Fraßfeinde zu vertreiben. Auch spielen die Terpnen als Signalstoffe und Wachstumsregulatoren der Pflanzen eine wesentliche Rolle. Einige Terpene haben auch pharmakologische Aktivität. Sie dienen als Ausgangstoffe für die Herstellung von Vitaminen und Pharmazeutika. Andere Terpene kommen in Tumortherapie zum Einsatz ( z.b. Zerumbone und Taxol) Da die Terpene aromatisch riechende Substanzen sind, finden sie Anwendungen in Parfüm-, Kosmetika- und Lebensmittelindustrie als Geruchs-, Geschmacksstoffe. Geraniol ist ein häufiger Bestandteil blumiger Parfüm.

3 Terpenbiosynthese Die beiden isomere Isopentenylpyrophosphat (IPP) und Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) sind die Grundbausteine alle Terpene, wie es in Abbildung 2 zu sehen. In Eukaryoten und Bakterien sind diese beiden Moleküle das Endprodukt des Mevalonatwegs. Abbildung 2: Isopentenylpyrpphosphat (IPP) und Dimethylallelpyrophosphat (DMAPP) stellen die Grundbausteine alle Terpne dar. Im Mevalonatweg werden ausgehend von Acetyl-CoA und nach insgesamt 6 enzymkatalysierten Reaktionen die beiden Ausgangsstoffe IPP und DMAPP gebildet. In Plastiden der Pflanzen, Algen und in einigen Bakterien werden die Ausgangsverbindungen IPP und DMAPP durch einen anderen Weg zur Verfügung gestellt, nämlich Methylerythritol Phosphate (MEP). In Abbildung 3 und 4 sind Mevalonatweg und MEP dargestellt. Nach der Synthese von IPP und DMAPP kommt es zur Verknüpfung der beiden Grundbausteine zur aktivierten linearen Terpenen unterschiedlicher Kettenlänge (Abbildung 2)

4 Abbildung 3: Mevalonatweg: Endprodukte sind die beiden Grundbausteine IPP und DMAPP. Abbildung 4: Methylerythritol Phosphate (MEP) stellt die beiden Grundbausteine für die Terpen in Pflanzen, Algen und verschiedenen Bakterien zur Verfügung dar Taxane Taxane sind natürlich vorkommende Zytostatika. Chemische gesehen gehören Taxane zu den Diteroenoiden. Die bekanteste Quelle für Taxane ist die pazifischen Eibe. Seit Anfang der 90er Jahre werden einige Taxane in der Krepstherapie eingesetzt. Als erster Stoff aus der Gruppe der Taxane wurde das Paclitaxel, bekannt auf dem Markt unter dem Namen Taxol, im Jahr 1993 zur Therapie gelassen. Die einzige Quelle für den Rohstoff war die Eibe. Allerdings ist die Produktionsrate in der Eibe so gering, dass 2 bis 4 voll

5 ausgewachsener Eiben nötig sind für eine ausreichende Dosierung. Noch dazu ist das Eibewachstum selbst so langsam. Außerdem sind in der Pflanze über 350 ähnliche Taxoide bekannt, was eine direkte Extraktion des spezifischen Taxoids schwerig Teuer macht, da Regio- und enantioselektive chemische Reaktionen durchzuführen sind, die ja normalerweise nicht bilig sind. Auch die chemische Synthese von Taxol ist nicht einfach: Aufrgund der komplexe Struktur sind 35 bis 51 Schritte durchzuführen, und trotzdem ist die Ausbeute so gering, dass man sich mit den Gesamtkosten nicht abfinden kann. Noch dazu kommen die unerwünschte Nebenreaktionen, die oft nicht zu vermeiden sind. Biotechnologische Produktion von Taxol In 2010 berichtete eine Arbeitsgruppe, dass sie Taxol in E.coli mit einer Ausbeute von 1 g/l produzieren konnten. Für die Produktion wurde der native MEP Weg verwendet, um die zwei Bausteine IPP und DMAPP zu synthetisieren. Gleichzeitig wurden ein Paar Enzyme in diesem Weg so optimiert, dass es eine ausreichende Konzentration der beiden Ausgangsstoffe gibt. Der zweiter Teil der Produktion ist der Terpenoidweg selbst, der ja heterolog ist. Der Herrausforderung in diesem Teil war die spezifische Hydroxylierung der Taxadien, welche ja durch Cytochromen erreicht wurde.

6 Abbildung 5: Biotechnologische Produktion von Taxol. Der Mevalonatweg und Terpenoidweg wurden in E. colie rekonstruiert. Selektive Biotransformation in Mikroorganismen 1. Stereoselektive Hydroxylierung Hydroxylierung ist die am meisten studierte Biotransformation. Die Reaktion wird durch Oxygenasen, die Sauerstoff als Oxidationsmittel verwenden.. Ein Beispiel ist die stereoselektive Hydroxylierung der Menthol in verschiedenen Spezies der Bodenpilz, Solani. Wie es in Abbildung 6 zu sehen, erfolgt die Hydroxylierung an verschiedenen Positionen in den verschiedenen Spezies: 6-hydroxymenthol, 1-hydroxymenthol und 6,8- dihydroxymenthol. Diese Strukturen sind zwischen Produkte in der Synthese von Mitteln gegen Snow blight Krankheit (Schnee Knollenfäule) Abbildung 6: Stereoselektive Hydroxylierung von Menthol in verschiedenen Spezies.

7 2. Epoxidierung Mit Epoxidierung bezeichnet man die Oxidation von C=C Bindung. Bei der Epoxidierung von Alkenen wird ein Sauerstoffatom von einer Persäure auf die C-Cdoppelbindung übertragen, wobei ein Oxiranring gebildet wird, wie es in Abbildung 7 zu sehen. Abbildung 7: Oxidation von Alkenen. Biokatalysatoren sind Oxygensaen und Peroxidasen. Während Oxygenasen den molekularen Sauerstoff als Oxidationsmittel verwenden, dient Wasserstoffperoxidase als Oxidationsmittel für Peroxidasen. Als Beispiel für die Epoxidierung von Terpenen in Mikroorgansimen ist die Biotransformation von Limonenen durch verschiedene Penicillium spezien. Die Produkte dieser Biotransformationen sind: α-terpineol wird häufig in der Parfümindustrie, γ-terpinen wirkt antimikrobiell und entzündungshemmend und Limonenoxide wirken Isektenabstoßend und werden in Isektenschutzmittel verwendet. Abbildung 8: Epoxidierung von Limonenen in verschiedenen Penicillium Spezien

8 3. Bayer-Villiger-Oxidation In der Baeyer-Villiger-Oxidation werden Ketone zu Estern beziehungsweise cyclische Ketone zu Lactonen umgesetzt. Als Oxidationsmittel werden Peroxysäuren (Peroxycarbonsäuren) eingesetzt. Abbildung 9: Bayer-Villiger- Oxidation Monooxygenasen können solche Reaktionen mit hoher regioselektivität katalysieren. Die Biotransformation der beiden Enationmeren von Dihydrocarveol ist ein Beispiel dafür.

9 Literaturverzeichnis Application of microorganisms towards synthesis of chiral terpenoid derivatives Renata; Kuriata-Adamusiak & Daniel Strub & Stanisław Lochyński Taxol: biosynthesis, molecular genetics, and biotechnological applications; S. Jennewein R. Croteau, Terpenbiosynthese in Bakterien und Pflanzen; Werner Knoss, Phawnazte in unserer Zeit / 28. Jahrg Escherichia coli Isoprenoid Pathway Optimization for Taxol Precursor Overproduction; Parayil Kumaran Ajikumar et al.; Science 330, 70 (2010). Metabolic engineering of taxadiene biosynthesis in yeast as a first step towards Taxol (Paclitaxel) production; Benedikt Engels a,1, Pia Dahmb,1, Stefan Jennewein; Metabolic Engineering 10 (2008)

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