Molekulare Diagnostik in der Pathologie. Sensitivität Spezifität - Kosten. PD Dr. Thomas Mairinger. Tumorzentrum Berlin - Buch 9.

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1 Molekulare Diagnostik in der Pathologie Sensitivität Spezifität - Kosten PD Dr. Thomas Mairinger Tumorzentrum Berlin - Buch 9. September 2015 HELIOS Kliniken GmbH

2 Was ist gemeint mit molekulare Diagnostik in Diagnostischer der Pathologie? Ansatz Prognostischer Ansatz Prädiktiver Ansatz Veränderungen am Genom Mutationen Amplifikationen Strukturelle Änderungen (z.b. Translokationen) Transkriptom Proteom Epigenetik/Methylierung

3 Was wird wie bestimmt? Analyse der DNA-Sequenz Amplifikation und Sequenzierung (Sanger, Pyro, NGS) Analyse der transkribierten RNA Umschreiben in DNA, Amplifikation und Sequenzierung,Neue Methoden Lokalisation/Amplifikation von bestimmten DNA-Sequenzen FISH, CISH Nachweis von Proteinen durch Immunhistochemie Epigenetik / Methylierungsstatus Sequenzierung

4 Grundlegendes: Primer: DNA-Sequenz, die bekannt ist und als Beginn der Hybridisierung nötig ist PCR: Polymerase-Kettenreaktion, Amplifikation eines DNA-Stücks in geometrischer Reihe um den Faktor 2 mittels TAQ-polymerase und Temperaturveränderung Sequenzierung: Bestimmung der DNA-Sequenz als Folge von AGCT Sanger-Sequenzierung: klassisch Pyrosequenzierung: mittels Luciferase und Lichtemission NGS: Next Generation Sequencing: Parallelsequenzierung von sehr vielen DNAAbschnitten (SNIPs) gleichzeitig

5 Grundsätze - Sensitivität Die Sensitivität ist stark von der verwendeten Methode abhängig FISH: Primer bindet an die korrespondierende Stelle, Detektion möglich (chromogen oder fluoreszenzbasiert) Problem:

6 Grundsätze Sensitivität II PCR-basierte Verfahren haben theoretisch eine unendliche Sensitivität (weil man die DNA im Prinzip unbegrenzt duplizieren kann) -Rationale hinter der sog. Liquid Biopsy Problem: Sehr anfällig für Kontaminationen Fraglicher Nutzen der Detektion kleiner mutierter Anteile Man findet nur was man sucht

7 COLD-PCR Durch die verminderte Adhäsion der mutierten DNA-Stränge kommt es zu einem früheren Schmelzpunkt

8 Minor Clones und COLD PCR? Kontrolle konventionelle PCR 20% mutierte DNS 4 % mutierte DNS

9 COLD PCR weist bis 0,125% Tumor-DNS nach Konv. PCR 2,5 % Tu-DNS COLD PCR 2,5 % Tu-DNS COLD PCR 0,125 % Tu-DNS COLD PCR 0,125% Tumor-DNS Fleesensee

10 Grundsätze Sensitivität III NGS-Methoden: Multiplizieren neben der Anzahl der parallel bearbeiteten Proben auch die (Hyper-) Sensitivitätsproblematik Alternative potentiell: Direkte Methoden ohne Amplifikation NanoString etc...

11 NGS Panels and more. Ion Torrent: Piezoelektrische Detektion der H+ Ionen, die bei der Inkorporation der Basen entstehen Illumina: Solid based Single Molecule Sequencing (Adapter bindet an Oberfläche, alle 4 Nukleotide werden zyklisch zugesetzt, jedes anders farbmarkiert) Maldi-TOF: Laser beschießt Probe, Flugzeit im Vakuum wird gemessen (Time of Flight) HELICOS (ohne PCR) NanoPore (ohne PCR) NanoString (ohne PCR)

12 Grundsätzliches - Spezifität Die Spezifität aller DNA-basierten Methoden ist extrem hoch. Kreuzreaktionen oder überlappende Reaktionen sind praktisch ausgeschlossen. Problem 1: Verhältnis von Tumorzellen zu nicht-tumorzellen (Epithelien, aber auch Stroma, lyphatische Zellen etc...) Wie viel Tumoranteil ist obligatorisch? Problem 2: Man findet nur was man sucht und sonst gar nichts! Problem 3: Die Länge des untersuchbaren DNS-Abschnittes ist relativ kurz NGS als Alternative um viele kurze zu untersuchen

13 Methoden Übersicht: Die Methoden sind sehr spezifisch und grundsätzlich sehr sensitiv. Probleme: Kontaminationen bei PCR-basierten Analysen Verhältnis gesuchte versus andere Zellen außerdem (neudeutsch:) You don t get what you don t ask for Do you know what you are looking for at all?

14 Zusätzlich problematisch: Zeitschiene Molekularpathologie (Beispiel Lunge) Testung dauert zu lang ( bis zu 3 Wochen) Testzeiten nehmen allgemein zu Bis wann kann die Therapieentscheidung warten? (oder doch Chemo 1st line?) Entscheidend: - Reflex Testung nach klar definierten Kriterien - Sequentiell vs. Parallel - Wie häufig wird der Test im Labor durchgeführt? täglich/2* pro Woche / wöchentlich - Koordination Tumorkonferenz / Testverlauf?

15 Factors that impact turnaround time Histological/cytological diagnosis Testing by request (oncologist) (reporting, letter, phone call, ) 2 5 days Reflex testing 1 day EGFR mutation analysis Reflex testing 1 day 7 days Wild type Testing by request (oncologist) (reporting, letter, phone call, ) 2 5 days EML 4-ALK analysis 12 days days days = working days Prof. Bubendorf, ELCC 2012

16 semi-sequentielle Testung, Beispiel Lunge SCC + SCLC -> Nach Immun fertig NSCLC non-squamous: - kras / EGFR simultan - wenn beides negativ: EML4 Screening-PCR - Wenn positiv oder unzureichende RNA: tri-color FISH - Wie lange darf das dauern?

17 Preis (realistisch, nicht GOÄ): Die Preisgestaltung richtet sich nach verschiedenen Faktoren: Preistreiber: - Fertigkits - Personalintensive Auswertung - Hohe Hands on Time beim raussuchen, Ordnen, wegsortieren, Formulare ausfüllen etc.. - Geringe Untersuchungsfrequenzen durch Unsicherheiten und daraus resultierenden Wiederholungen - FISH-Analyse methodisch bedingt Cost Saver: - Self built kits - Große Testmengen automatisierte DNA-Extraktion Mengenrabatte - Unterstützende Algorithmen

18 was darf der Spaß Frage: Kosten pro gefundene Mutation kosten? - Bei 250 pro EGFR-Test (3 Exone) Männer: bei 3,5 % : (100*250) / 3,5 7142,85 Frauen: bei 15,5 %: (100*250) / 15,5 1612,90 - Bei 150 k-ras und sequentiell 250 EGFR Männer(25% k-ras positiv(?)): (100*150) + (75*250)/3,5 Frauen (25% k-ras positiv(?)): (100*150) + (75*250)/15, , ,67

19 Praktischer Teil

20 Beispiel Lunge Diagnostischer Ansatz: keiner (HE-Morphologie) Progostischer Ansatz: kras Mutation (dient auch zur Präselektion für EGFR-Analyse) Prädiktiver Ansatz: EGFR-Mutation (TKI-Therapie) EML4-ALK Translokation (Crizotinib) Ros-1 Bruch (Crizotinib) Immuntherapie PDL-1 (?)

21 Zeitschiene (Werktage) Seit 2009: streng standardisierte Gewebaufarbeitung für Lungenbiopsien in Heckeshorn 1 2 H&E 3 Immun Vereinbarung mit unseren Pneumologen: Basis: Typing streng nach WHO dick schneiden/gewebe extrahieren/dna isolieren/pcr/sequenzierung Interpretation / Befunderstellung Befundübermittlung B 5 6 B B

22 Histo jede PE: 1 Stufenserie 1* PAS 1* EvG -> Fall wird vorgelegt Standard Anforderungsschein Zusatzuntersuchungen Lungen-PEs

23 Nach der Immun: Gewinnung des Materials für MolPath aus dem Block Ziel: möglichst viel Material soll übrig bleiben! Markieren des zu untersuchenden Materials (mit NikonMarkierungsstempel) und Übertragen der Markierung auf einen 20 µm dicken Paraffinschnitt Abschaben des Paraffinmaterials mit einer Pipettenspitze Aufpipettieren des abgeschabten Materials

24 KRAS Codon 12/13 LightCycler Assay mit LNA und FRET Sonde (G12C); Schmelzkurve benennt Mutation wenn Schmelzkurve nicht eindeutig: Bestätigung mittels allelspez. PCR oder Hybridisierung auf einem Chip EGFR: Pyro Exon 18, 19, 21 (n.b. 20) nach normaler Block-PCR mit eigenen Primern Pyro fragt 5 Hotspots ab Pyrogramme mit Mutationen: die PCR wird Sanger sequenziert (komplizierte Mutationen, z.b. Del im Exon 19) oder mittels allelspezifischer PCR (einfache SNPs) bestätigt Pyro (bis ca. 5-10% Mu) sensitiver als Sanger (bis ca % Mu) ALK rt-pcr für 8 der 12 Bruchvarianten (ca 90%) bei Positivität oder ALK-Überexpression oder < 15% tumor im Gewebe CISH Bei Frage nach Ros-1 FISH

25 HE Stufenserie PAS EVG TTF-1/p63 CK-7/CK 5/6 Ki-67 1 Biopsie 2 mm Her2Neu - ISH EML4ALK - ISH ROS-1 ISH Met-ISH? PDGF-1 ISH? NGS 20 µm für 10 Ng Tumor-DNA µm für Expressionsanalyse? Leerschnitte Kontroll-HE am Ende Restmaterial für zukünftige Marker Neuroendokrine Marker CD 56 Synaptophysin Chromogranin Her2Neu Immunhisto EML4ALK Immunhisto ROS-1 Immunhisto PDL-1 Immunhisto Tumorzentrum Berlin-Buch 2015 Astra Zeneca OnkoFrühstück Molekulare Testung beim NSCLC

26 Kosten GOÄ Beispiel Lunge HE-Stufen 12,65 Färbungen 40,80 Immun Minimum 204,00 Immun Maximum 306,00 MolPath ISH: (à 113,7) Her ,40 EML4-ALK 3 341,10 ROS ,40 PCR/Sequenzierung (à 113,7) K-RAS 4 454,80 EGFR 3 341,10 Summe: 1849,25 GOÄ 1-fach (minimales IH-Programm)

27 Beispiel Kolon Diagnostischer Ansatz MSI bei Grading von soliden und muzinösen Karzinomen Prädiktiver Ansatz Ras-Mutationsanalyse Kosten Resektat / Tumor onkologisch operiert mit 25 Lymphkonten Histologie konventionell ,00 Aufwand Zentrum pauschal 150, ,20 K-Ras analyse (à 113,7) 4 454,80 N-Ras analyse (à 113,7) 3 341,10 Summe 1424,10 GOÄ 1-fach MolPath: MSI Immun

28 Beispiel Mamma Diagnostischer Ansatz: Keiner Prognostischer Ansatz: Her2Neu Prädiktiver Ansatz: Rezeptoren Her2Neu RNA-Expressionstests BRCA-Mutationsanalyse (?)

29 Kosten Mamma BET (absolutes Minimum ohne Schnellschnitt!) HE-Schnitte Aufwand zentrum (pauschal) Immun Minimum 204,00 MolPath ISH: (à 113,7) Her ,40 PCR/Sequenzierung (à 113,7) Prädiktionstest (je nach Verfahren) Summe ohne Prädiktionstest: 931,40 GOÄ 1-fach (minimales IH-Programm)

30 Kosten von Vergleich zu den Patho-Kosten heute

31

32 Sachkosten Histopathologie: Modul 10.6b

33 Fälle mit Hauptdiagnose Mamma-Ca 2011 HELIOSweit -häufigste DRGHäufigste konservative DRG Häufigste operative DRG mit großer OP Häufigste operative DRG mit kleiner OP + Axilladissektion Große OP mit beidseitigem Eingriff

34 InEK-Kostenmatrix für verschiedene operative und konservative Mamma-CA-DRG: J62B: häufigste konservative DRG Sachkosten Labor gesamt (!) pro Fall: 15,40

35 J23Z: häufigste operative DRG mit großer OP Sachkosten Labor gesamt (!) pro Fall: 107,90

36 J07B: häufigste operative DRG mit kleinem Eingriff + Axilla Sachkosten Labor gesamt (!) pro Fall: 77

37 J16Z: beidseitige Mastektomie Sachkosten Labor gesamt (!) pro Fall: 139,10

38 Molekulare Marker in Prognose und Prädiktion: Wir fordern das IKEA-AUTO Hier das Auto: IKEA plant den Verkauf von Autos: Hier das Werkzeug:

39

40 Molekulare Diagnostik - Herausforderungen Grundsätzlich neue Methoden sind verfügbar Die Methoden haben hohes Potential in der Prädiktion Entwicklung dieser Methoden ist schneller als die Biologie Entstehung von Halbwissen Finanzielle Interessen einer Diagnostikindustrie Marketingstrategien, die viele Betroffene zu vermeintlich mündigen Patienten machen Finanzielle Zwänge im Gesundheitswesen

41 In the beginning there was nothing. God said : 'Let there be light! ' There was still nothing, but now you could see it. Vielen Dank! (Dave Thomas)

42 Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

43 Barcode it! An die DNA Fragmente jeder einzelnen Sequenz werden Zusätzlich am anderen Ende noch eine adapter Sequ Damit kann man eine Vielzahl von Sequenzen zu einer L In 1 Lauf sind so viele verschiedene Genabschnitte simu Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

44 Why Wait? Go for it or what? Was wollen wir mit der Testung erreichen? Was testen wir mit solchen Panels? Was testen wir NICHT mit solchen Panels? Welche Information brauchen wir wann? und wem nützt sie dann (wie)? Wer bezahlt das alles? Wie geht s weiter? Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

45 Personalisierte Therapie (a Pathologists view ) Malignität ja/nein Standardisierter Tumortyp Standardisiertes Staging und Grading Prädiktive Faktoren Proteine Proliferation Amplifikation / Inversion / Translokation von Genabschnitten Mutationen Methylierung / Epigenetik Therapiefähigkeit des Patienten für die beste Therapie Compliance des Patienten. Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

46 Wir glauben ja viel zu wissen. Quelle: ExPASy Homepage zu.zgora.pl Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 Biochemical and Metabolic Pathways PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

47 Dauer der Untersuchungen (molekulare Diagnostik) Anzahl Mittelwert Mean 18 10,11 Juli 2010 Dauer MolPath September ,36 10 November 63 10,25 9 Dezember 73 8,04 7 Januar 74 6, Fälle Oktober 10 Februar 78 3,28 3 März 103 3,48 2 April 70 4,01 4 Mai 61 7,31 7 Juni 75 4,31 5 Juli 68 3,65 2 August 74 4, T age

48 Was testen wir mit solchen Panels / was nicht? Punktmutationen RNA Expression mirna Expression Methylierungsstatus - Amplifikation einzelner Genabschnitte (nur teilweise möglich) - Strukturelle DNA-Anomalien (Amplicons oft lange) - Proteine - Verteilung der Proteine in den Tumorzellen - Tumorzellen? - Malignität überhaupt Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

49 Welche Infos brauchen wir wann? Malignität ja/nein Möglichst rasch Tumortyp Möglichst rasch, spätestens zur TuKo Zur TuKo? Verlaufskontrolle /Wiedervorstellung? Status der Treiberevents (nicht immer Mutationen!) Biologischer Verlauf der genetischen Veränderungen im Laufe der Zeit (Rebiopsie!) Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

50 Wer bezahlt das alles? Im Moment eigentlich niemand Vereinzelt Querfinanzierung durch lokale zeitlich befristete Projek Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

51 Wie geht s weiter. Will haben wird sich durchsetzen Panels werden auch in absehbarer Zeit nur einige wenige wirklich entscheidende Informatio Das Design der Panels wird entscheidend sein und kann nur in Zusammenarbeit Klinik/Diag Tumordiagnostik wird sich auf wenige Zentren konzentrieren Entweder Zeitverzögerung durch Kooperation oder Komplettlösung durch wenige Anbieter Diagnostik in der Pathologie wird aufwändiger und teurer vermutlich ohne vollständige Ko Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

52 LungCarta Panel Agena (MALDI-TOF) NanoString PanCancer Pathway Panel 770 Essential Genes Representing 13 Canonical Pathways 606 Pathway Genes: Notch, Wnt, Hedgehog, TGFB, MAPK, STAT, P13K, RAS, Chromatin Modification, Transcriptional Regulation, DNA Damage Control, Cell Cycle, Apoptosis 124 cancer driver genes 40 reference genes Customize with Panel-Plus option flexibility to include 30 genes of your choice Tumorzentrum Berlin-Buch 2015 Astra Zeneca OnkoFrühstück Molekulare Testung beim NSCLC

53 1 Biopsie 2 mm HE Stufenserie PAS EVG TTF-1/p63 CK-7/CK 5/6 Ki-67 Her2Neu - ISH EML4ALK - ISH ROS-1 ISH Met-ISH? PDGF-1 ISH? NGS 20 µm für 10 Ng Tumor-DNA µm für Expressionsanalyse? Leerschnitte Kontroll-HE am Ende Restmaterial für zukünftige Marker Neuroendokrine Marker CD 56 Synaptophysin Chromogranin Her2Neu Immunhisto EML4ALK Immunhisto ROS-1 Immunhisto PDL-1 Immunhisto Tumorzentrum Berlin-Buch 2015 Astra Zeneca OnkoFrühstück Molekulare Testung beim NSCLC

54 Standardisierte Probenaufarbeitung

55 Bronchioskopiekurs Zwickau

56 Wesentliche Empfehlungen III Gewebe sparen! Bronchioskopiekurs Zwickau

57 Zeitschiene (Werktage) Seit 2009: streng standardisierte Gewebaufarbeitung für Lungenbiopsien in Heckeshorn 1 H&E Immun Vereinbarung mit unseren Pneumologen: Basis: Typing streng nach WHO dick schneiden/gewebe extrahieren/dna isolieren/pcr/sequenzierung Interpretation / Befunderstellung Befundübermittlung B B B

58 Es geht weiter. Stand November 2014 Neuerungen: EML4-ALK und ROS-1 sind etabliert EGFR T790M Mutation gewinnt an Bedeutung Exakte Angabe der Lokalisation einer aktivierenden EGFR Mutation ist erforderlich (Exon Alle reden von Krebspanels und neuen Technologien in der MolPath Eine Modifikation des Procedere ist nötig Eine Überprüfung der Prozesse und der Zeitschiene ist angezeigt Bronchioskopiekurs Zwickau

59 Take home Die Kooperation zwischen Klinik und Pathologie kann nicht oft genug beschworen werden Der Pathologe ist maximal so gut, wie die klinischen Informationen (und damit der klinische Partner) ihn sein lassen Die verschiedenen Methoden der Materialgewinnung sind für unterschiedliche Fragestellungen unterschiedlich ergiebig Daher wünschen wir uns: Einen klaren klinischen Ansprechpartner, der ansprechbar ist Die relevanten Informationen auf dem Antragsschein Bei der Wahl der Materialgewinnung zu berücksichtigen, wo die Methode an ihre Grenzen stoßen wird Bronchioskopiekurs Zwickau

60 nicht weil die Dinge schwierig sind, wagen wir sie nicht, sondern weil wir sie nicht wagen, sind sie schwierig. Vielen Dank! Bronchioskopiekurs Zwickau

61 Zwischenfazit Weiterführende Untersuchungen scheinen möglich Proteomics ist aufwändig (upa/pai1) RNA-basierte Systeme scheinen vielversprechend Langzeiterebnisse fehlen (natürlich) noch Black-Box Mentalität der Algoritmen und Fremdversand kritisch

62

63 Take Home

64 Herzlichen Dank! PD Dr. Thomas Mairinger Inst.f. Gewebediagnostik am MVZ am HK Emil von Behring

65 Rationale Treiber Muationen gelten als DIE Hoffnung und Basis der Personalisierten Medizin Mutationsanalyse wurde bislang auf einer 1:1 Basis durchgeführt = 1 Mutation in 1 Untersuchung Grund: PCR Amplifikation der untersuchten Gensequenz mit entsprechendem Primer und anschließender Sequenzierung pr Fall/Gen in 1 Well möglich wie sonst die einzelnen Fälle/Gene auseinander halten? Bei vielen verschiedenen Mutationen Zeit- und Ressourcenraubend. Tumorzentrum Berlin-Buch Havelhöhe, ß014 PD Mairinger, Pathologie HELIOS Berlin

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