1. Aufbau Proteine sind aufgebaut aus Aminosäuren, deren allgemeine Formel hier abgebildet ist.

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1 A) Einleitung Proteine tragen wesentlich zum Aufbau und Funktionieren einer Zelle bei. Nachfolgend soll der Aufbau, die Einteilung und die Bildung von Proteinen besprochen werden. 1. Aufbau Proteine sind aufgebaut aus Aminosäuren, deren allgemeine Formel hier abgebildet ist. Abb.: 1 Aufbau Aminosäure (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck) Ein solches Molekül bildet einen Baustein eines Proteins. Im Molekül sind zwei funktionelle Gruppen zu sehen: die Carboxylgruppe -COOH und die Aminogruppe -NH 2. Mit diesen Gruppen wird die Verbindung zu den anderen Aminosäuren geknüpft. Es gibt 20 für den Proteinaufbau wichtige Aminosäuren. Manchmal wird auch noch eine 21 Aminosäure, das selten vorkommende Selenocystein, zu diesen dazugezählt. In eukaryotischen Zellen kommen nur die so genannten L Aminosäuren vor. In der Fischer-Projektion liegt bei der L-Konfiguration die Aminogruppe auf der linken Seite des Moleküls, bei der D-Aminosäure auf der rechten Seite (von dexter, lat. rechts und laevus, lat. links). Man unterscheidet Aminosäuren mit hydrophoben (Rest nicht wasserlöslich), hydrophilen (Rest wasserlöslich), sauren (Protonendonator), basischen (Protonenakzeptor) und aromatischen (Phenylring) Resten. 1

2 Abb.: 2 Einteilung Aminosäuren (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck) Es gibt zwei Aminosäuren die eine Sonderrolle spielen. Zum einen das Glycin, welches an seinem α C-Atom keine Chiralitätszentrum hat und zum anderen das Prolin, welches mittels der Amino-Gruppe und seinem Rest einen Ringschluss vollzieht. 2

3 Die Bindung zwischen zwei Aminosäuren über die Carboxyl-gruppe der einen und Aminogruppe der anderen heißt Peptidbindung. Dabei wird ein Wassermolekül abgespalten. Solche Reaktionen, bei denen Wasser abgespalten wird, heißen Kondensationsreaktionen. Die Spaltung dieser Bindung nennt man Hydrolyse. Dazu wird je ein H 2 O-Molekül benötigt. Die Abbildung unten zeigt relativ gut, dass die Verbindung der Aminosäuren über die Peptidbindung räumlich zu einer "Zick-Zack"-Kette führt. Abb.: 3 Peptitbindung (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck) 2. Struktur der Proteine Betrachtet man die Struktur der Proteine so kann man diese in verschiedene Unterstrukturen unterteilen. Zum einen gibt es die Primärstruktur welche nur aus der spezifischen Reihenfolge der Aminosäuren gegeben ist. Die Primärstruktur des blutzuckersteigernden Hormons Glucagon sieht z.b. so aus: His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 3

4 Eine weitere Struktur ist die Sekundärstruktur. Abb.: 4 α-helix und β-faltblatt (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck) Man unterscheidet zwischen der helikal angeordeten α-helix und dem antiparallel laufenden β-faltblatt. Die Ausbildung der Strukturen wird durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert. Bin Übergang von der einen Struktur in die andere kommt es oft zur aus Ausbildung einer so genannten β-schleife. Meist ist die Ursache für die Schleifenbildung die Aminosäure Prolin. Die Tertärstruktur wird durch die räumliche Faltung des Proteins gebildet. Hierbei haben Van der Waals Kräfte, Dipol Dipol Wechselwirkungen, ionische Wechselwirkungen sowie Disulfitbrücken eine wichtige stabilisierende Wirkung. Abb.: 5 Tertiärstruktur von Porin (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck) 4

5 Die letzte Struktur ist die Quartiärstruktur. Hier lagern sich mehrer räumlich gefaltete Proteine zu einem Komplex zusammen. Abb.: 6 GAPD (= Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase), (Ernst-Georg Beck) 3. Abbau von Proteinen Er Abbau von Proteinen erfolgt über so genannte Peptidasen. Es gibt Exopeptidasen und Endopeptidasen. Exopeptidasen schneiden die Polypeptitkette beliebig irgendwo der Mitte auseinander während Endopeptidasen nur die Enden eines Proteins angreifen können. Dabei unterscheidet man zwischen Carboxypeptidasen ( können nur am Carboxylende angreifen ) und Aminopeptidasen (greifen an der Aminogruppe an). 4. Bildung von Proteinen Proteine werden in der Proteinbiosynthese gebildet. Dies besteht aus zwei zentralen Vorgängen, der Transkription und der Translation. Hier soll nur näher auf die Translation eingegangen werden. Die Information über die Bildung eines Proteins ist in der DNA gespeichert. Die prä mrna entspricht einer Kopie der DNA, welche Informationen über die Bildung eines Proteins einhält. Sie wird während der Transkription gebildet. 4.1 Processing Diese prä mrna muss, bevor sie abgelesen werden kann noch verschiedene Stufen des Processings durchlaufen. Beim Splicing werden mittels Spleißsosomen die Introns, welche keine Information zur Realisierung der DNA enthalten, herausgeschnitten. An das 5 -Ende der Prä-mRNA wird beim Processing ein 7-Methyl-GTP-Rest angehängt, welcher als 5 -Cap bezeichnet wird. Er dient als Schutz der m-rna vor der Hydrolyse durch Exonucleasen und 5

6 als Erkennungsmerkmal für die Ribosomen. An das 3 - Ende wird ein Poly-A-Schwanz (Polyadenylat-Schwanz) angehängt. Dieser bewirkt ebenso Schutz vor Exonucleasen und erleichtert der mrna das Verlassen des Zellkerns. 4.2 Translation In der Translation wird die Information zur Bildung eines Proteins, welche auf der mrna gespeichert ist, in Form von einer Aminosäuresequenz realisiert. Diese Information ist in Form von Basentripletts gespeichert, welche die Aminosäuren nicht erkennen können. Als Bindeglied zwischen Aminosäure und mrna dient die trna. Sie sichert zu, dass die richtige Aminosäure dem richtigen Basentriplett zugeordnet wird. Nachfolgend ist ein t-rna-molekül dargestellt. t-rna-moleküle bestehen aus ca. 90 Basen und bilden mit sich selbst Wasserstoffbrückenbindungen aus. So entsteht im zweidimensionalen die typische Kleeblatt-Struktur mit drei Schleifen. Im dreidimensionalen spricht man von der L Form. Am 3 -Ende wird die Aminosäure angelagert. Abb.: 7 Struktur einer trna (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck) Die T Schleife spielt eine wichtige Rolle bei der Anlagerung an die Aminoacyl trna Synthetase während die D-Schleife bei der Anlagerung an die Ribosomen unterstützend wirkt. Das sogenannte Anticodon ist eine Abfolge von 3 Nukleotiden in der Anticodonschleife, die spezifisch für die einzelnen t-rna- Moleküle ist und an die komplementären Basentripletts der mrna bindet. Die Bindung der Aminosäure an die trna erfolgt mit dem Enzym Aminoacyl trna Synthetase. Unter ATP Verbrauch wird die Aminosäure an das 3 -Ende der trna gebunden. Dies geschieht mittels folgender Reaktionen: Aminosäure + ATP + Enzym Aminoacyl-AMP-Enzym + PP i Aminoacyl-AMP-Enzym + trna Aminoacyl-tRNA + AMP + Enzym 6

7 In der nachfolgenden Abbildung ist das Schema dieser Reaktion noch einmal bildlich in Form eines Kreislaufes dargestellt. Abb.: 8 Beladen einer trna (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck) Die Translation lässt sich grob in die Initiation, die Elongation und die Termination Abb.: 9 Initiation der Translation (Campbell, Biologie, 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum-Verlag) unterteilen. Bei der Initiation lagert sich die kleine Untereinheit der Ribosomen an ein Startcodon am 5 - Cap Ende der mrna. Nun bindet die Initiations trna (bei Eukaryoten immer Methionyl trna) an der mrna. Darauf hin lagert sich noch die große ribosomale Untereinheit an. Nun, da sich die A - (Aminoacyl trna) Stelle und die P (Peptidyl trna) Stellen gebildet haben, kann mit der Elonation begonnen werden. Die Methionyl trna sitzt auf der P Stelle. An die A Stelle kann sich eine neue trna anlagern. In einem Schritt, den die Peptit Transferase katalysiert wird die Aminosäure auf der P Stelle mit der auf der A Stelle verknüpft. Nun wandert das Ribosom weiter. Die trna, welches auf der P Stelle war wird nun frei und die trna, welche auf der 7

8 A Stelle war nimmt ihren Platz ein. Die A Stelle ist nun frei und eine neue trna kann sich anlagern. So wird der Prozess immer weitergeführt und die Peptitkette immer länger. Abb.: 10 Elongation ( Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck) Beendet wird der Vorgang durch die Termination. Sie wird eingeleitet durch ein so genanntes Stoppcoden z.b. UAG, UGA, UAA. Außerdem sind noch Release Faktoren nötig. Befindet sich ein Stoppcoden an der A-Stelle dann lagert sich keine trna, sondern der eben genannte Release - Faktor an. Dieser Faktor bewirkt den Zerfall des Komplexes aus großer und kleiner ribosomaler Untereinheit sowie der mrna. Damit ist die Translation beendet und die Polypeptitkette wird freigesetzt. Abb.: 11 Termination der Translation (Campbell, Biologie, 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum-Verlag) 8

9 5. Stickstofffixierung Pflanzen benötigen Ammonium für den Aufbau von Proteinen. Dies bekommen sie entweder direkt über Symbionten (z.b. Rhizobien), welche den Luftstickstoff fixieren können und der Pflanze zur Verfügung stellen oder sie gewinnen mittels Nitrat- und Nitritreduktasen Ammonium aus Nitrat oder Nitrit, welches sich im Boden befindet. 6. Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Die SDS-PAGE ist eine molekularbiologische Methode zur Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht. Hierbei ist es wichtig, dass die Proteine dieselbe räumliche Struktur aufweisen (eindimensional) und dieselbe Ladung tragen (negativ). Diese Voraussetzungen werden in der denaturierenden, diskontinuierlichen PAGE durch die Zugabe der Detergens SDS gewährleistet. SDS lagert sich an Proteine an, spaltet alle nichtkovalenten Bindungen und verleiht dem Protein eine negative Gesamtladung. Um auch die kovalenten Disulfidbrücken in einem Protein spalten zu können wird unterstützend ein Reduktionsmittel wie z.b. β-mercaptoethanol oder DTT, dazugegeben. Wird nun ein elektrisches Feld an das Gel angelegt, so wandern kleine Proteine mit einem geringen Molekulargewicht schneller durch die Maschen des Polyacrylamids in Richtung der Anode, als große Proteine mit einem hohen Molekulargewicht. 9

10 B) Material und Methoden 1. SDS PAGE Zur Auftrennung der Proteine aus Senfkeimlingen, die zum einen unbelichtet (etioliert) waren und zum anderen 14h vorbelichtet waren, wurde eine SDS PAGE (siehe Theorie 1...) von der Betreuerin vorbereitet. Die Pufferkammern der PAGE wurden mit Laufmittel gefüllt und anschließend die Proben geladen. Hierfür wurden je 2g Senfhypokotyle mit etwas Seesand und 5ml Boratpuffer homogenisiert, 10min bei maximaler Stufe zentrifugiert und der Überstand in Eis aufbewahrt. Vom Überstand wurden je 60µl der beiden Pflanzen mit 20µl Ladepuffer versetzt und in die Taschen gefüllt. Außerdem wurde ein Standard in eine Tasche gegeben. Die Anordnung sah wie folgt aus: unbelichtete belichtete Marker unbelichtete belichtete Senfpflanze Senfpflanze leer leer Senfpflanze Senfpflanze Teilgr. 1 Teilgr. 1 Teilgr. 2 Teilgr. 2 Zunächst wurde eine Spannung von 100 V angelegt, bis der Indikator Bromphenolblau die Trennschicht zwischen Sammel- und Trenngel erreicht hatte. Dann wurde die Spannung auf 200 V erhöht, bis das Bromphenolblau das Gel verlassen hatte. Anschließend wurde das Gel von der Betreuerin mit dem Farbstoff Coomassie angefärbt, über Nacht wieder entfärbt und zur Kontrastverstärkung in Glycerinlösung gegeben. 2. Anthocyan und Leucocyanbestimmung 2.1 Anthocyanbestimmung 2g eines belichteten und 2g eines nicht belichteten Senfkeimlings wurden jeweils mit etwas Seesand und 10ml 1M HCl homogenisiert. Anschließend wurden beide Proben für 10min bei höchster Stufe zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Von diesem wurde bei 515nm die Absorption gemessen, wobei als Leerwert HCl verwendet wurde. 2.2 Leucocyanbestimmung In drei große Reagenzgläser wurden je 8ml der Lösung A (konz. HCl und n-butanol) und 2ml der Lösung B (Lösung A und Eisensulfat) pipettiert. Anschließend wurden in zwei der Gläser 2g der beiden, unterschiedlichen Senfpflanzen gefügt und alle bei 95 C für 15min inkubiert. Nachdem die Proben abgekühlt waren, wurden 0,15ml der Extrakte mit 2,85ml der Lösung A 10

11 vermischt und deren Extinktion bei 515nm gemessen. Hierbei diente das dritte Reagenzglas, dem keine Hypokotyledonen zugefügt wurden als Leerwert. 3. Messung der PAL Enzymaktivität 3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration Hierzu wurden jeweils 1,0ml des Überstandes der beiden, unterschiedlich belichteten Senfarten mit 4ml Trichloressigsäure gemischt und die Extinktion bei 600nm gemessen. Als Leerwert wurde hier ein Gemisch aus 1,0ml Wasser mit 4ml Trichloressissäure verwendet. 3.2 Photometrische Detektion von Zimtsäure Es wurden jeweils 1,5ml Boratpuffer mit 1,0ml Phenylalanin und 0,5ml des Überstandes aus Versuch 1 in Quarzküvetten pipettiert und die Extinktion bei 290nm bestimmt. Als Nullwert diente dabei ein Gemisch aus 2,0ml Boratpuffer und 1,0ml Phenylalanin. Die Extinktion wurde alle 5 min gemessen, bis sich der ermittelte Wert nicht mehr veränderte. 11

12 C) Ergebnisse 1. SDS PAGE Die Betrachtung des PA-Gels zeigte keine deutlichen Banden, daher soll zur Auswertung das Gel der Vorgruppe (Bild siehe Anhang) verwendet werden. Zur Auswertung der Banden der Proben auf dem Polyacrylamidgel musste zunächst aus den Laufweiten der Banden des Markers eine Kalibriergerade erstellt werden. Diese ist in der folgenden Graphik dargestellt. Graphik 1: Kalibriergerade des Markers Kalibriergerade des Markers 2,3 log Molekulargewicht 2,2 2,1 2 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 y = -0,0527x + 2, Laufweite der Banden [cm] Die Ausmessung der Banden des Senfs (rechte Seite des Gels) ergab die in der folgenden Tabelle gezeigten Laufweiten, und das daraus folgende Molekulargewicht. Tab.: 1 Ermitteltes Molekulargewicht der Banden Laufweite = x [cm] y = -0,0527x + 2,5255 Molekulargewicht 10 y [kda] 6,5 2, ,05 6,7 2, ,14 7,9 2, ,13 13,3 1, ,04 12

13 Die ausgewerteten Banden waren sowohl bei der belichteen, als auch bei der unbelichteten Pflanze zu erkennen. 2. Anthocyan und Leucocyanbestimmung 2.1 Anthocyanbestimmung In der nachfolgenden Tabelle.. sind die Ergebnisse der photometrischen Bestimmung der beiden Senfpflanzen aufgeführt. Eine Extinktion E von 1 entspricht dabei einem Cyanidingehalt von 0,37µmol. Tab.2: Betimmung des Anthocyangehaltes Senfpflanze Extinktion E Cyanidingehalt [µmol] Unbelichtet 0,536 0,198 belichtet 0,906 0,335 In der etiolierten, Senfpflanze waren 0,198µmol Cyanidin enthalten. Die belichtete Senfpflanze enthielt 0,335µmol Cyanidin. 2.2 Leucocyanbestimmung Die gemessenen Extinktionswerte der Leucocyanbestimmung sind in Tabelle. dargestellt. Da die Proben hierzu verdünnt wurden, müssen die Werte noch mit einem Faktor von 20 multipliziert werden. Hierbei entspricht eine Extinktion von 1 einer Cyanidinkonzentration von 0,37µmol. Von dem somit durch einen Dreisatz berechneten Wert der Cyanidinkonzentration muss nun noch der Anthocyangehalt aus 2.1 abgezogen werden, um auf den Leukocyangehalt zu kommen. Tab. 3: Bestimmung des Leucocyangehaltes Senfpflanze Extinktion Gesamtgehalt in µmol Anthocyangehalt aus 2.1 [µmol] Leucocyangehalt [µmol] Unbelichtet 0,028 0,207 0,198 0,009 belichtet 0,083 0,614 0,335 0,279 Der Gehalt an Leucocyan in der unbelichteten, etiolierten Senfpflanze betrug 0,009 µmol. Der Gehalt an Leuyocyan in der belichteten Senfpflanze war 0,279µmol. 13

14 3. Messung der PAL Enzymaktivität 3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration Die im Photometer ermittelten Extinktionen sind in Tabelle.. aufgelistet. Hierbei entspricht eine Extinktion von 0,22 einer Proteinmenge von 1mg. Tab.4 : Bestimmung der Proteinmenge Senfpflanze Extinktion Menge an Protein [mg] Unbelichtet 0,878 3,991 belichtet 1,280 5,818 In 2g der unbelichteten, etiolierten Senfpflanze waren 3,991mg an Proteinen enthalten. Dieselbe Menge der belichteten Pflanze wies hingegen 5,818mg an Proteinen auf. 3.2 Photometrische Detektion von Zimtsäure und Bestimmung der PAL-Aktivität Die im Photometer ermittelten Extinktionen sind in Tabelle..erfasst. Tab. 5: Detektion der Zimtsäure Zeitpunkt der Messung Extinktion E 1 der unbelichteten Senfpflanze Extinktion E 2 der belichteten Senfpflanze t 0 1,892 2,226 t 5 2,015 2,178 t 10 2,226 2,226 Aus den obigen Werten lässt sich nun die Enzymaktivität der PAL im belichteten und im unbelichteten Keimling berechnen. Die Formel für die Berechnung lautet: A E = Zimtsäure[ nmol] t[min]* m Pr [ mg] otein Für den unbelichteten Keimling ergibt sich nun folgende Enzymaktivität: - de = E t10 E t0 = 2,226 1,892 = 0,334 Nach Lambert-Beer ergibt sich also folgende Konzentration der Zimtsäure: c = E / ε*d = 0,334/(10 7 cm 2 /mol * 1cm) = 33,4 nmol/ml Da die Probe im Verhältnis 1:6 verdünnt war ergibt sich letztendlich eine Konzentration von 200 nmol/ml. Die resultierende Enzymaktivität beträgt: A E = 200nmol/ml / 10 min* 3,991mg = 5 nmol/ (min*mg*ml) 14

15 Da bei der belichteten Pflanze die Extinktionswerte zu Beginn und am Ende gleich sind, ist es nicht sinnvoll eine Berechnung der Enzymaktivität durchzuführen, da hieraus eine Konzentration der Zimtsäure von 0 resultieren würde und somit auch die Enzymaktivität 0 wäre. 15

16 D) Diskussion 1. SDS-PAGE Durch die SDS-PAGE konnte gezeigt werden, dass sowohl in der unbelichteten Probe, als auch in der belichteten Probe Proteine vorhanden waren. Es wäre jedoch zu erwarten gewesen, dass das Bandenmuster nicht wie in unserem Fall identisch ist, denn im unbelichteten Zustand werden andere Proteine synthetisiert als im belichteten. Außerdem wären in der unbelichteten Probe mehrere verschiedene Proteinbanden zu erwarten gewesen, da die Speicherproteine oftmals erst bei Belichtung abgebaut werden (siehe Aktivität der PAL). 2. Anthocyan- und Leukocyanbestimmung Bei der Bestimmung des Anthocyangehaltes zeigte sich, dass in der belichteten Probe mehr Anthocyane enthalten waren, als in der unbelichteten (0,335 µmol gegenüber 0,198 µmol). Dies war auch zu erwarten, da die Synthese dieser Farbstoffe durch die Aktivität der PAL bestimmt wird, welche durch Belichtung induziert wird. Die PAL wandelt Phenylalanin in trans-zimtsäure um, aus der im Folgenden verschiedene sekundäre Pflanzenstoffe, u.a. Anthocyane, synthetisiert werden. Jedoch sollte man eigentlich erwarten, dass in der unbelichteten Pflanze gar keine Anthocyane enthalten sind, da deren Synthese wie schon erwähnt lichtabhängig ist. Die geringen Konzentrationen, die in unserem Fall vorhanden waren, lassen sich dadurch erklären, dass die Proben im belichteten Raum bearbeitet wurden, so dass die PAL aktiv werden konnte. Die Bestimmung der Leukocyane zeigte, dass im unbelichteten Keimling bereits Leukocyane, die Vorläufer der Anthocyane, enthalten waren. Es wäre zu erwarten gewesen, dass im etiolierten Keimling viele Leukocyane enthalten sind, da die Pflanze diese als Speicher anlegt, um bei Belichtung sofort mit der Synthese von Anthocyanen beginnen zu können. 16

17 3. Messung der PAL-Aktivität Die Bestimmung der Proteinmasse im belichteten und im unbelichteten Keimling ergab, dass in der belichteten Pflanze mehr Proteinmasse vorhanden war, als im etiolierten Keimling. Die Photometrie der Zimtsäure ergab keine zufrieden stellenden Ergebnisse. Die Werte für die Extinktion bei der unbelichteten Pflanze zeigen den richtigen Trend, jedoch fiel beim belichteten Keimling die Extinktion zunächst ab, um bei der nächsten Messung auf den Ausgangswert zurück zu gelangen. Da der letzte Messwert bei beiden Pflanzen exakt identisch war, liegt die Vermutung nahe, dass das etwas ältere Photometer keine genauen Werte lieferte. Es wäre zu erwarten gewesen, dass die Extinktion zu Beginn bei der belichteten Pflanze höher ist, dass die Extinktion bei der unbelichteten Pflanze im Verlauf der Messungen jedoch stärker zunimmt, als bei der belichteten Pflanze. Die aus diesen Extinktionsmessungen resultierenden PAL-Aktivitäten sind daher keinesfalls repräsentativ. Wie dem Ergebnisteil zu entnehmen ist, zeigte die PAL im belichteten Zustand keinerlei Aktivität. Es wäre zu erwarten gewesen, dass die PAL-Aktivität bei längerer Belichtung zunimmt. 17

18 Weiterführende Fragen Was bedeutet -L-Aminosäure? Welche Aminosäure in Abb.1 des Praktikumsskripts Proteine besitzt unter diesem Aspekt eine Besonderheit? Eine α-l-aminosäure ist eine Aminosäure, die eine Amino- und eine Carboxylgruppe an einem chiralen (assymmetrischen) α - C-Atom gebunden hat. Dies verleiht dem Molekül eine optische Aktivität. Das L bedeutet, dass das Molekül in der Fischer-Projektion, die Aminogruppe auf der linken Seite des chiralen C-Atoms hat. Die Aminosäure Threonin hat, im Gegensatz zu den anderen abgebildeten Aminosäuren, ein zweites chirales Zentrum. PAL wird in der Pflanzenentwicklung neu synthetisiert. Können sie andere Mechanismen der Regulierung der Enzymaktivität nennen? Andere Mechanismen zur Regulierung der Enzymaktivität sind zum Beispiel die Endprodukt- Repression, die allosterische Hemmung oder Feedforward-Stimulierung. Bei der Endprodukt- Repression wird durch die Anhäufung des Endproduktes die Enzymsynthese gehemmt (Feedback-Hemmung). Bei der allosterische Hemmung werden die Enzyme durch so genannte Regulator-Moleküle (Effektoren oder Modulatoren) beeinflusst. Diese Moleküle hemmen das Enzym durch Binden an ein allosterisches Zentrum am Enzym. Dadurch kommt es zu einer Konformationsänderung des Enzyms und es verliert seine Funktion. Bei den Regulatoren kann es sich um das Substrat der vom Enzym katalysierten Reaktion oder um andere Stoffe handeln. Viele Enzyme sind auch nur in Kombination mit einem Cofaktor aktiv. Fehlt dieser, hat das Enzym keine Wirkung. Eine andere Form der Enzymregulierung ist die Interkonversion. Hier wird das Enzym durch eine Modifikation, zum Beispiel eine Phosphorylierung, verändert. Dies kann, je nach Enzym und Modifikation zu einer Aktivierung oder einer Deaktivierung des Enzyms führen. Wird die Enzymsynthese durch ein Produkt eines vorgeschalteten Stoffwechsels gesteuert, spricht man von einer Feedforward- Stimulierung. 18

19 Warum wandern bei der SDS-PAGE alle Proteine zur Anode? Bei der SDS-PAGE werden die Proteine der Probe mit SDS (Natriumdodecylsulfat), einer Seife, denaturiert. SDS-Moleküle haben einen hydrophoben Schwanz und einen polaren, negativ geladenen Kopf. Diese Moleküle lagern sich mit den negativen Ladungen nach außen an die Proteine an, die somit Kationen gleichen. Kationen wandern immer in Richtung der Kathode. Sehen Sie bei der Gelelektrophorese im Vergleich des Materials Unterschiede? Im Gegensatz zur normalen Gelelektrophorese wird hier ein Gel verwendet, das aus zwei Phasen besteht. Bei der Gelelektrophorese läuft die Probe durch ein einphasiges Gel. Der Vorteil des zweiphasigen Gels ist, dass die Proben auf ein Level gebracht werden und so alle den gleichen Startpunkt haben. Ein weiterer Vorteil gegenüber der Gelelektrophorese ist die Verwendung eines ungiftigen Farbstoffes (Coomassie Brilliant Blue G), bei der Gelelektrophorese wird toxisches Ethidiumbromid verwendet. Doch auch bei der SDS-PAGE werden giftige Substanzen verwendet (Acrylamid und Bisacrylamid, Bestandteile des Trenngels), die aber nach dem Polymerisieren nicht mehr toxisch sind. Ein auf den Farbstoffen beruhender Unterschied ist, dass das Gel aus der Gelelektrophorese nur auf der UV-Box betrachtet werden kann, bei dem PAGE-Gel kann man ohne Hilfsmittel das Ergebnis ablesen. 19