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1 EndoPredict EndoPredict Report Generator Myriad GmbH Bunsenstrasse Martinsried GERMANY +49 (0) Sividon Diagnostics GmbH Nattermannallee Köln GERMANY + 49 (0)

2 EndoPredict Report Generator Version V3.1 Benutzerhandbuch EndoPredict Report Generator ist ein Produkt für die In-vitro-Diagnostik. EndoPredict ist eine Marke von Sividon Diagnostics. VERSANT ist eine Marke von Siemens Healthcare Diagnostics. Platinum ist eine Marke von Life Technologies. SuperScript ist eine Marke von Life Technologies. Sividon Diagnostics GmbH Nattermannallee 1 D Köln GERMANY Distributor Myriad GmbH Bunsenstrasse 7 D_82152 Martinsried GERMANY +49 (0) Die Angaben in diesem trafen zum Zeitpunkt der Drucklegung zu. Sividon verbessert seine Produkte jedoch kontinuierlich und behält sich das Recht vor, Spezifikationen, Geräte und Wartungsverfahren jederzeit ohne Ankündigung zu ändern Sividon Diagnostics GmbH. Alle Rechte vorbehalten. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 2 von 31

3 Inhalt 1. Abkürzungen und Schreibweisen Funktionsweise Angabe der Zweckbestimmung Anwendung von EndoPredict Report Generator Bereitstellen der Messdaten Start der Web-Anwendung Hochladen einer Textdatei Eingabe von Chargen-relevanten Informationen Eingabe von Patienteninformationen Erstellen der Reports Der EndoPredict Report Seitenkopf des Reports Die Tumoreigenschaften Das Risiko nach EPclin Bewertung des Reports EPclin bei unbekannter Tumorgröße oder Nodalstatus Überblick über die softwareseitige Qualitätskontrolle Zusammenfassung der Qualitätskontrolle Ct-Werte im Plattenlayout Kontrollen Delta-Ct-Werte Chargen Testergebnis Meldungen Liste der Meldungen Veröffentlichte Versionen Originalsprache EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 3 von 31

4 1. Abkürzungen und Schreibweisen EndoPredict Report Generator A... Probe A, erste Probe auf der PCR-Platte B... Probe B, zweite Probe auf der PCR-Platte Ct... engl.: cycle threshold, PCR-Zyklus, bei dem der Fluoreszenz-Schwellenwert erreicht wird (normalisiert, interpoliert) Delta-Ct Werte... relative Expressionsstärke eines Gens normalisiert auf den Mittelwert der drei Referenzgene (CALM2, OAZ1 und RPL37A) EP... EndoPredict EPclin... prädiktiver Score, der aus dem EndoPredict Score, der Tumorgröße und der Anzahl positiver Lymphknoten berechnet wird EPRG... EndoPredict Report Generator EV-SSL... engl.: extended validation secure sockets layer; Verschlüsselungstechnologie, die ein authentische und abhörsichere Verbindung im Internet sicherstellt kpcr... kinetische PCR; Synonym zu qpcr LCL... engl.: lower control limit, untere Kontrollgrenze NEG... Negativkontrolle PCR... engl.: polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion PDF-Datei... Datei mit der Endung.pdf, die den EP Report enthält POS... Positivkontrolle qpcr... quantitative PCR SS III RT/Platinum Taq Mix... SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT- PCR System Custom Textdatei... Datei mit der Endung.txt, die Ct-Werte enthält und mit Hilfe der VERSANT Software erzeugt wurde UCL... engl.: upper control limit, obere Kontrollgrenze VERSANT-Software... Gerätesoftware des VERSANT kpcr Molecular Systems von Siemens Healthcare Diagnostics Im nachfolgenden Text werden folgende Schreibweisen verwendet: kursiv... Literaturverweise fett... Beschriftungen in der grafischen Benutzerschnittstelle (Menüs, Buttons, Reiter, ) fett-kursiv... Tastaturbefehle Courier... Schlüsselworte in Dateien oder Dateinamen EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 4 von 31

5 Zitate... Textbausteine aus dem EP Report 2. Funktionsweise Die Web-Anwendung EndoPredict Report Generator (EPRG) berechnet anhand von Messwerten der Expression verschiedener Gene den EndoPredict Score (EP). Aus diesem und Angaben über Tumorgröße und Anzahl positiver Lymphknoten wird zusätzlich der EPclin Score bestimmt. Die Berechnung erfolgt entsprechend der Publikation Filipits et al: A new molecular predictor of distant recurrence in ER-positive, HER2 negative breast cancer adds independent information to conventional clinical risk factors. Clinical Cancer Research, Außerdem bietet EPRG eine Analyse verschiedener Qualitätsgrößen der zugrunde liegenden Messwerte und zusätzlicher Kontrollen an. Als Ergebnis der Berechnungen wird ein Report in Form einer PDF-Datei erstellt, die vom Anwender gespeichert und ausgedruckt werden kann. EndoPredict Report Generator ist frei und ohne Authentifizierung im Internet verfügbar. Die Serveradressen lauten www1.endopredict.com und www2.endopredict.com. Die Datenübertragung zum Server und zurück ist verschlüsselt, sodass mögliche Patientendaten nicht durch Fremde mitgelesen werden können. EndoPredict Report Generator sowie die erzeugten EndoPredict Reports wurden für geschultes Fachpersonal diagnostischer Labors entwickelt. Die generierten Reports sind außerdem für Ärzte, die mit der Betreuung von Brustkrebspatientinnen befasst sind, vorgesehen. 3. Angabe der Zweckbestimmung EndoPredict Report Generator ist ein Produkt für die in vitro-diagnostik zur Bestimmung des Fernmetastasen-Risikos bei Patientinnen mit Östrogenrezeptorpositivem, Her2-negativem primären Mamma-Karzinom unter alleiniger adjuvanter endokriner Therapie. EndoPredict Report Generator darf für den vorgesehenen Verwendungszweck nur an RNA-Proben, die aus Formalin-fixiertem, in Paraffin eingebettetem Brustkrebsgewebe extrahiert wurden, und nur in Kombination mit Sividons Tissue Preparation Reagents oder den VERSANT Tissue Preparation Reagents, mit dem VERSANT kpcr AD Modul und dem EndoPredict TAQO / SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System Custom und dem EndoPredict Kit verwendet werden. EndoPredict Report Generator ist für den Einsatz durch Fachkräfte vorgesehen, die in den für die Durchführung des Tests benötigten Techniken und der Systemanwendung geschult sind. Die Ergebnisse des EndoPredict Tests sind nur im Kontext mit anderen etablierten Methoden und klinisch-pathologischen Faktoren zur Prognoseabschätzung und Stratifizierung von Patientinnen mit Brustkrebs zu verwenden. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 5 von 31

6 4. Anwendung von EndoPredict Report Generator 4.1. Bereitstellen der Messdaten EPRG erstellt einen Report aus qpcr-messdaten, die zuvor mithilfe der Gerätesoftware des verwendeten VERSANT qpcr Systems exportiert werden müssen. Zu Details siehe Gebrauchsanweisung IFU_Endopredict 1, eine einfache Anleitung zum Export der Messdaten folgt hier: Der EndoPredict Test wurde auf einem VERSANT kpcr Gerät von Siemens mit der zugehörigen Software VERSANT kpcr Software Version 1.1 (VERSANT-Software) und dem Default EndoPredict CE durchgeführt. EPRG benötigt die gemessenen Ct-Werte und prüft auch das Plattenlayout. Diese Informationen werden bereits in der VERSANT-Software definiert und dann in die Textdatei exportiert. Die Defaults definieren die Bedingungen des qpcr-laufs sowie das Plattenlayout, das Temperaturprofil, die Einstellungen für Analysis Term Settings sowie das Format des Text-Reports. Alle für den EndoPredict Test essentiellen Einstellungen sind in dem entsprechenden Default hinterlegt (siehe Gebrauchsanweisung IFU_Versant_Defaults 2 ). Am Ende der PCR sollten Sie alle qpcr-kurven visuell in der VERSANT-Software kontrollieren. Anschließend wird der Text-Report als Textdatei exportiert (File Export Text Report Export Text Report To Text File). Sie können eine Identifikation der Probe(n) z.b. anhand der Probeneingangsnummer der zugehörigen Tumorpatientin bereits in der VERSANT-Software vornehmen und dort auch abspeichern: Diese ist dann nach dem Export auch in der Textdatei enthalten und wird im EndoPredict Report angezeigt (siehe Abschnitt 5.1). Selektieren Sie dazu im Plate Setup alle Wells der betreffenden Probe (A1 bis C12 für Probe A bzw. F1 bis H12 für Probe B), öffnen Sie mit Hilfe der rechten Maustaste das Kontextmenü und wählen Sie darin Well Information. Tragen Sie dann im Dialog Well Information im Textfeld Comments den Text 3 Proben-ID:, gefolgt von der gewünschten Identifikation ein. 1 Erhältlich bei Sividon Diagnostics, Kontaktdaten siehe Seite 2 2 Erhältlich bei Sividon Diagnostics, Kontaktdaten siehe Seite 2 3 Aus Kompatibilitätsgründen mit der Version 2.0 ist alternativ auch die Eingabe PatID: möglich. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 6 von 31

7 Für eine umfassende Kontrolle der Messdaten sind zudem die Angabe der verwendeten EndoPredict Platte und der verwendeten qref-charge (Positivkontrolle) essentiell. Diese Daten können analog zur Eingabe der Proben-ID bereits in der VERSANT-Software hinterlegt oder nachträglich auf der Benutzeroberfläche von EPRG definiert werden. Sind die Daten bereits in die VERSANT-Software eingetragen, werden die Angaben beim Hochladen der Textdatei automatisiert in die Eingabefelder der Benutzeroberfläche übertragen. Vorzugsweise sollten für das Eintragen der Seriennummer der Platte und der qref-charge die Wells der Kontrollen (D1 bis E12) gewählt werden. Öffnen Sie mit Hilfe der rechten Maustaste das Kontextmenü und wählen Sie darin Well Information. Die Seriennummer der Platte und die qref-charge müssen dabei jeweils in einer eigenen Zeile des Textfelds Comments eingetragen werden; verwenden Sie dazu nach der Eingabe der ersten Nummer die Enter-Taste, um einen Zeilenumbruch zu erzeugen. Stehen die Seriennummer der Platte oder die qref-charge zusammen mit anderen Informationen in einer Zeile, können die eingetragenen Daten von EPRG nicht korrekt zugeordnet werden. Alternativ zur Eingabe über die Tastatur können Sie auch einen Barcode-Scanner für die Eingabe der Seriennummer der Platte und der qref-charge verwenden. Der Barcode-Scanner sollte nur am Geräte-spezifischen PC verwendet werden, da seine Werkseinstellung auf USA Keyboard gesetzt ist. Am Geräte-spezifischen PC werden alle numerischen und alphanumerischen Zeichen korrekt eingelesen Start der Web-Anwendung Starten Sie einen Browser und geben Sie als Adresse (URL) eine der folgenden Alternativen ein: www1.endopredict.com oder www2.endopredict.com EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 7 von 31

8 Der Browser zeigt nun folgende Web-Seite: Für eine sichere Datenübertragung verwendet die Webseite ein Extended-Validation- SSL-Zertifikat (EV-SSL). Dieses Sicherheitszertifikat belegt die Identität der Organisation gegenüber dem Browser. Wenn Sie die Webseite aufrufen, erkennen Sie die sichere Verbindung an dem Schloss-Symbol neben der Webseite-URL in der Adressleiste. Bei einigen Browsern wird neben dem Symbol der Name der Organisation, welche für den Inhalt der Webseite verantwortlich ist, angezeigt und/oder die Adressleiste zum Teil grün dargestellt. Wird das Schloss-Symbol angeklickt, werden weitere Informationen zur Identität der Webseite sichtbar. EPRG wurde für folgende Browser entwickelt: Chrome 33, Firefox 27, Internet Explorer 9 und 11 sowie Safari Hochladen einer Textdatei Der erste Arbeitsschritt auf der Hauptseite von EPRG ist die Auswahl einer Textdatei vom Dateisystem Ihres Computers. Klicken Sie dazu im Feld Textdatei hochladen auf den Button Durchsuchen. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 8 von 31

9 Es öffnet sich ein Dialog zur Auswahl einer Datei: Wechseln Sie in das gewünschte Verzeichnis und wählen Sie Ihre Textdatei. Anschließend wird die gewählte Datei angezeigt: Die Anzeige kann für verschiedene Browser unterschiedlich aussehen Eingabe von Chargen-relevanten Informationen Im nächsten Schritt tragen Sie die Chargennummern aller für den EP Test verwendeten Reagenzien ein, so dass alle mit dem Test im Zusammenhang stehenden Informationen später auf Seite 3 des Reports zusammengefasst aufgeführt werden können. Wurden diese Informationen bereits in der VERSANT-Software eingetragen (siehe Abschnitt 4.1), erscheinen diese Informationen automatisch in der Eingabemaske. Obligatorisch muss die Seriennummer der genutzten EndoPredict Platte und die verwendete qref-charge eingetragen werden; optional können alle weiteren für den Test relevanten Reagenzien Chargen, wie die Charge des SS III RT/Platinum Taq Mixes, des 2x Reaction Mixes und des qpcr-wassers eingetragen werden. Die Seriennummer der EndoPredict Platte ist auf dem Etikett des Aluminiumverbundbeutels aufgedruckt und nochmals auf einem schmalen Etikett am rechten Rand der EndoPredict Platte zu finden. Die Chargen-Nummer der verwendeten qref ist dem Etikett des entsprechenden Schraubverschlussröhrchens zu entnehmen. Die Kombinationen aus Zahlen und Buchstaben können manuell über die Tastatur eingeben oder mit Hilfe eines Barcode-Scanners eingelesen werden. Der Barcode- Scanner sollte nur am Geräte-spezifischen PC verwendet werden, da seine Werkseinstellung auf USA Keyboard gesetzt ist. Am Geräte-spezifischen PC werden alle numerischen und alphanumerischen Zeichen korrekt eingelesen. Wird jedoch ein PC mit einer Tastatur einer anderen Sprache oder Region verwendet, können einige EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 9 von 31

10 Zeichen nicht korrekt sein 4. Falls Sie den Barcode-Scanner nicht am Gerätespezifischen PC nutzen können, müssen Sie beim Scannen stets auf die korrekte Wiedergabe achten und die eingelesenen Zeichen ggf. korrigieren. Anderenfalls erhalten sie Fehlermeldungen der folgenden Art: EPRG greift auf Datenbanken zurück, mit deren Hilfe es die Verfallsdaten der eingetragenen Reagenzien prüft und aus denen es die für die Charge gültigen Kontrollgrenzen ermittelt (gilt nur für die qref-charge und die EndoPredict Platte). Die Ergebnisse der Prüfungen erscheinen im Report (siehe Abschnitt 5.11) Eingabe von Patienteninformationen EPRG kann ein oder zwei Proben auf einer PCR-Platte verarbeiten: Diese werden als Probe A und Probe B bezeichnet. Für beide Proben gibt es je einen Bereich für weitere Eingaben. 4 Bei einer deutschen Tastatur sind u.a. Y und Z vertauscht. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 10 von 31

11 Die Proben-ID dient der Identifikation der Probe und erscheint auf jeder Seite des Reports. Die Eingabe ist obligatorisch. Beachten Sie bitte, dass der Platz, der für die Proben-ID im Report zur Verfügung steht, begrenzt ist. Bitte verwenden Sie aus Datenschutzgründen nicht den Namen oder das Geburtsdatum der Patientin. Zusätzlich zur Proben-ID können Sie im Feld Notiz weiteren Text eingeben. Die Notiz erscheint im Report unter der Proben-ID, die Eingabe ist optional. Die Tumorgröße und der Nodalstatus sind Auswahlfelder, die mit einer Angabe aus der Auswahlliste gefüllt werden müssen. Wenn Sie über Informationen der beiden klinischen Parameter verfügen (d.h. etwas anderes als unbekannt auswählen), wird im Report der EPclin Score berechnet und grafisch angezeigt. Bitte beachten Sie die genaue Bezeichnung der Kategorien: Die Tumorgröße orientiert sich an der TNM- Klassifikation, wobei pt1a (bis 0,5cm) und pt1b (>0,5cm bis 1cm) zusammengefasst sind, aber von pt1c (>1cm bis 2cm) unterschieden werden. Der Nodalstatus hat eine eigene Einteilung, die nicht mit der TNM-Klassifikation verwechselt werden sollte! Mikrometastasen werden als 1 bis 3 positive Lymphknoten gewertet (entsprechend der TNM-Klassifikation). Wenn Sie als Angaben für Tumorgröße und/oder Nodalstatus unbekannt wählen, wird im Report eine zusätzliche Seite generiert, welche eine Tabelle mit allen 16 möglichen Kombinationen aus Tumorgröße und Nodalstatus und den jeweils zugehörigen individuellen EPclin Ergebnissen enthält. Tumorgröße und Nodalstatus haben keinen Einfluss auf den EP Score. Zusätzlich können Sie noch weiteren Freitext im Feld Bemerkungen eingeben, der auf Seite 3 bzw. 4 des Reports abgedruckt wird. Bitte beachten Sie, dass der Platz im Report auf drei Zeilen beschränkt ist, wobei Zeilen automatisch am rechten Rand des Reports umgebrochen werden. Sollte Ihre Eingabe aus Platzgründen nicht vollständig im Report abgedruckt werden können, so wird am Ende die Bemerkung <Rest abgeschnitten> angefügt. Für die weiteren Abschnitte dieser Gebrauchsanweisung betrachten wir beispielhaft die folgenden Eingaben: EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 11 von 31

12 4.6. Erstellen der Reports Durch Anklicken des Buttons Erstelle Report A bzw. des Buttons Erstelle Report B erzeugen Sie den Report für Probe A bzw. Probe B. Der Report ist eine PDF-Datei, die Sie nun direkt anschauen (d.h. öffnen) oder speichern können. Durch Anklicken des Buttons Erstelle Seite 1 von Report A bzw. des Buttons Erstelle Seite 1 von Report B haben Sie die Möglichkeit, lediglich die erste Seite des Reports zu erstellen, z.b. zur Weitergabe des Testergebnisses an den beauftragenden Kollegen. Haben Sie für die Tumorgröße und / oder den Nodalstatus unbekannt gewählt, so erscheint im Report zusätzlich die oben erwähnte Seite mit der Tabelle aller 16 möglichen Kombinationen aus Tumorgröße und Nodalstatus. Die PDF-Datei wird unter dem gleichen Dateinamen wie die Textdatei gespeichert, ergänzt um das Suffix _A bzw. das Suffix _B. Es wird empfohlen, dieser Voreinstellung zu folgen, damit zu einem späteren Zeitpunkt leicht nachvollzogen werden kann, welche Textdatei einem bestimmten Report zugrunde liegt. Bitte beachten Sie, dass das Verzeichnis, das der Browser zum Speichern des Reports anbietet, in der Regel nicht dem Verzeichnis der Textdatei entspricht! Sie können den Report jederzeit neu erstellen. Bei gleichen Eingaben (inklusive der Textdatei) erhalten Sie einen mit folgenden Ausnahmen inhaltsgleichen Report: Datum und Uhrzeit im Kopf des Reports sowie möglicherweise die Ergebnisse der Prüfung der Haltbarkeiten der EndoPredict Platte, der qref, des SS III RT/Platinum Taq Mix, des 2x Reaction Mix und des qpcr-wassers. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 12 von 31

13 5. Der EndoPredict Report EndoPredict Report Generator Der EndoPredict Report umfasst in der Regel drei Seiten 5. Auf der ersten Seite befinden sich die Patienteninformationen und die Ergebnisse (EP und EPclin). Die weiteren Seiten enthalten im Wesentlichen Qualitätsinformationen basierend auf den Kontrollen der qpcr-platte, auf Seite 2 in Form von Tabellen und auf Seite 3 in Form von Textmeldungen. Wurden die Tumorgröße und/oder der Nodalstatus als unbekannt angegeben, wird nach Seite 1 eine zusätzliche Seite eingefügt, welche eine Tabelle beinhaltet, die den EPclin Score und das 10 Jahres Metastaserisiko für alle 16 möglichen Kombinationen aus Tumorgröße und Nodalstatus enthält. Sind die klinischen Parameter im Nachhinein verfügbar, kann aus der Tabelle der individuelle EPclin Score und das entsprechende Rezidivrisiko ermittelt werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, die Textdatei erneut hochzuladen und die klinischen Informationen vor Erstellung des Reports einzutragen Seitenkopf des Reports Ganz oben auf der ersten Seite des Reports befindet sich ein Kopf, der links das Firmenlogo des Herstellers und rechts das des Distributors aufweist. Darunter befindet sich die Proben-ID, welche entweder aus dem in die Textdatei eingetragenen Well Comment oder aus dem Eintrag auf der Benutzeroberfläche von EPRG stammt. Widersprechen sich die Angaben der in der Textdatei hinterlegten Proben-ID und der Benutzeroberfläche eingetragenen Information, wird die in der Benutzeroberfläche eingegebene ID genutzt: In einer Meldung auf Seite 3 wird aber auf die Diskrepanz hingewiesen. Unter der Proben-ID befindet sich die Notiz, die sich genauso wie die Proben-ID verhält. Darunter wird der Zeitpunkt, zu dem der Report erstellt wurde, aufgeführt. Rechts daneben ist auf der ersten Seite des Reports Platz für den Stempel des durchführenden Labors. Ab Seite 2 sind im Kopf rechts die Seitenzahl und die Gesamtzahl der Seiten angegeben: 5 Die im Folgenden beschriebene Seitennummerierung geht von einem Report aus, für den Tumorgröße und Nodalstatus bekannt sind. Andernfalls (siehe Abschnitt 5.5) wird eine Seite 2 eingefügt, alle weiteren Seiten verschieben sich entsprechend nach hinten. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 13 von 31

14 5.2. Die Tumoreigenschaften Unter dem Kopf folgen auf Seite 1 die Tumoreigenschaften, beginnend mit dem EP Score, welcher als Zahl und grafisch dargestellt wird. Nach Filipits et al., 2011 liegt er stets zwischen 0 und 15, wobei EP Scores kleiner als 5 als niedriges Risiko und EP Scores ab 5 als hohes Risiko bezeichnet werden. Die Risikoklasse steht in Klammern als Wortlaut hinter dem ermittelten EP Score. In bestimmten Fällen kann der EP Score nicht aus den Messdaten berechnet werden: Dann wird an dieser Stelle eine entsprechende Fehlermeldung abgedruckt; außerdem erscheint eine entsprechende Meldung (siehe Abschnitte 5.13 und 6) auf der letzten Seite des Reports, die das Problem detaillierter beschreibt. Tumorgröße und Nodalstatus werden den Eingaben im Browser (Abschnitt 4.5) entsprechend als Zahl und grafisch angezeigt. Wurden sie als unbekannt angegeben, wird auch dies hier entsprechend angezeigt: EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 14 von 31

15 5.3. Das Risiko nach EPclin Wenn Sie Angaben zur Tumorgröße und zum Nodalstatus gemacht haben, wird der EPclin Score nach Filipits et al., 2011 berechnet und auf Seite 1 des Reports angezeigt. Aus dem EPclin Score wird die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten einer Metastase innerhalb von 10 Jahren nach Filipits et al., 2011 geschätzt und beide Größen grafisch dargestellt. Die Kurven zeigen den allgemeinen Zusammenhang, der aufgrund eines Modells berechnet wurde, wobei die gestrichelten Kurven das 95%-Konfidenzintervall bilden. Das Fadenkreuz gibt die EPclin-Ergebnisse für die individuelle Patientin dieses Reports an. EPclin Scores kleiner als 3,3 (Metastasewahrscheinlichkeiten von weniger als 10% innerhalb von 10 Jahren) werden als niedriges Risiko, die übrigen als hohes Risiko bezeichnet Bewertung des Reports Auf Seite 1 unten kann das Testergebnis durch die Unterschrift des Pathologen freigegeben werden (oder auch nicht, in der Regel aufgrund der Qualitätsinformationen auf den nachfolgenden Reportseiten). Außerdem ist Platz für handschriftliche Kommentare vorhanden. Seite 1 wird abgeschlossen durch den Verweis auf die dem EndoPredict Test und der Berechnung des EP und EPclin Scores zugrunde liegende Literatur. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 15 von 31

16 5.5. EPclin bei unbekannter Tumorgröße oder Nodalstatus Haben Sie im Browser für die Tumorgröße und/oder den Nodalstatus die Einstellung unbekannt gewählt, kann der EPclin Score nicht berechnet werden. Stattdessen enthält der Report auf Seite 2 eine Tabelle mit allen möglichen Kombinationen aus Tumorgröße und Nodalstatus sowie den dazugehörigen EPclin Ergebnissen. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 16 von 31

17 Neben dem EPclin Score wird in der Tabelle auch die sich aus den Daten ergebende Wahrscheinlichkeit für eine Metastase innerhalb von 10 Jahren (siehe Abschnitt 5.3) angezeigt. Wahrscheinlichkeiten von weniger als 10% (entspricht EPclin Score kleiner als 3,3) werden als niedriges Risiko gekennzeichnet; Wahrscheinlichkeiten ab 10% werden mit hohem Risiko beschrieben und rot hinterlegt. Wenn Sie den Report ausgedruckt haben und die Tumorgröße und den Nodalstatus nachträglich ermittelt haben, können Sie den EPclin Score, die korrespondierende 10- Jahres-Metastasewahrscheinlichkeit und die EPclin Klasse aus der Tabelle ablesen und in die entsprechenden Felder unter der Tabelle handschriftlich eintragen. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 17 von 31

18 5.6. Überblick über die softwareseitige Qualitätskontrolle Die Seiten 2 und 3 des Reports behandeln im Wesentlichen die Qualitätskontrolle der PCR Messungen. Diese wird mit Hilfe einer Reihe von Qualitätsprüfungen in Form einfacher Regeln durchgeführt. Schlägt eine solche Qualitätsprüfung fehl (d.h. ist ihre Regel verletzt), wird dies im Report an verschiedenen Stellen markiert: (i) in der Zusammenfassung (Abschnitt 5.7), (ii) in einer der Tabellen auf Seite 2 oder Seite 3 in Form einer farbigen Markierung (Abschnitte 5.8 bis 5.11) und (iii) auf Seite 3 in Form einer textuellen Meldung (Abschnitt 5.13) Zusammenfassung der Qualitätskontrolle Seite 2 des Reports beginnt mit einer Zusammenfassung der Ergebnisse der Qualitätsprüfungen. Die Qualitätsprüfungen sind dabei in vier Kategorien eingeteilt: Zeigen alle vier einen grünen Haken, so sind alle Prüfungen bestanden. Sind eine oder mehrere Qualitätsprüfungen fehlgeschlagen, wird in der entsprechenden Kategorie statt des grünen Hakens ein rotes Kreuz angezeigt. Hinter dem roten Kreuz erscheint zusätzlich ein entsprechender Text. Auf Seite 3 des Reports werden alle identifizierten Probleme unter der Rubrik Meldungen einzeln aufgelistet Ct-Werte im Plattenlayout In der Mitte von Seite 2 befindet sich eine Übersichtstabelle der Ct-Werte, die die Anordnung der Wells auf der PCR-Platte darstellt. Die Hauptfunktion dieser Tabelle ist die übersichtliche Darstellung der unmittelbaren Messergebnisse. Da jeder Report die Ergebnisse nur eines Patienten beinhaltet, werden Ct-Werte einer möglicherweise vorhandenen anderen Probe auf der gleichen qpcr-platte nicht angezeigt: Im Bild unten in den Zeilen F bis H. Neben den Ct-Werten enthält die Tabelle das EndoPredict Plattenlayout, das für jedes Well das Gen und das Material ( A für Probe A, B für Probe B, POS für Positivkontrolle und NEG für Negativkontrolle) kennzeichnen. Ist ein Well nicht in EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 18 von 31

19 der Textdatei beschrieben (siehe Gebrauchsanweisung IFU_Endopredict ), wird die entsprechende Zelle mit <entfernt> gekennzeichnet und gelb hinterlegt. Bei allen Kontroll-Wells wird geprüft, ob der Ct-Wert im von den Kontrollgrenzen erlaubten Bereich liegt: Wenn ja bleibt die entsprechende Zelle weiß, wenn nicht wird die Zelle rot. Nach Filipits et al., 2011 werden die Replikate eines Gens während der Berechnung des EP Scores auf Ausreißer untersucht. Wird ein Ausreißer entdeckt, wird er für die Berechnung des EP Scores nicht verwendet und in der Tabelle hellblau markiert. Einzelne Ausreißer kommen bedingt durch die PCR als Analysemethode gelegentlich vor und stellen kein relevantes Qualitätsrisiko dar. Sie sind der Grund warum die Messung in Triplikaten erfolgt Kontrollen Es folgt ein Abschnitt zu Kontrollen, der mit der Prüfung des Schwellenwerts zur Bestimmung der Ct-Werte innerhalb der PCR-Software beginnt. Dieser wird in der Oberfläche der VERSANT-Software als Threshold Fluorescence bezeichnet und ist in der Textdatei in der Spalte Threshold (drn) enthalten. Er wird automatisch von der VERSANT-Software aus den Fluoreszenzkurven bestimmt und auf Seite 2 im Abschnitt Kontrollen unter der Überschrift aufgeführt. Ist er zu klein, liegen die Ct-Werte der Kontrollen häufig nicht innerhalb der Spezifikationen und es wird empfohlen, in der VERSANT-Software die entsprechenden Einstellungen zu korrigieren, um einen adäquaten Threshold Fluorescence zu erreichen (siehe dazu Gebrauchsanweisung IFU_Endopredict, Abschnitt Threshold Fluorescence kleiner als 0,01 ). Ein EndoPredict Report wird nur generiert, wenn der Threshold Fluorescence größer als 0,01 ist, andernfalls wird die folgende Fehlermeldung im Browser erzeugt. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 19 von 31

20 Unter dem Threshold Fluorescence werden die Kontrollen der Ct-Werte in einer Tabelle dargestellt. Zu jedem der zwölf Gene des EP Algorithmus (acht informative Gene in alphabetischer Reihenfolge, drei Referenzgene ebenfalls in alphabetischer Reihenfolge und ein DNA-Markergen) gibt es jeweils eine Positiv- und eine Negativkontrolle. Außerdem gibt es noch eine DNA-Negativkontrolle der Probe (hier mit Proben-HBB bezeichnet). Der durch Qualitätsregeln kontrollierte Ct-Wert wird in den beiden Spalten Ct dargestellt. Bei der Proben-HBB Negativkontrolle ist dies der Mittelwert der drei Replikate, wobei für die Mittelwertbildung No Ct als 40 gewertet wird. Liegt der kontrollierte Wert zwischen LCL und UCL (Positivkontrollen) bzw. oberhalb des LCL (für Negativkontrollen), so sind diese Kontrollen innerhalb der Spezifikationen und die entsprechende Zelle der Kontroll -Tabelle bleibt weiß. Liegt der kontrollierte Wert nicht dort, ist die Kontrolle außerhalb der Spezifikationen und sie wird rot markiert. Fehlt zu einer Kontrolle der entsprechende Ct-Wert, wird in der Spalte Ct lediglich ein leeres, gelb hinterlegtes Feld angezeigt. Liegen Kontrollen außerhalb der Spezifikationsgrenzen oder fehlen die zugehörigen Ct-Werte, ist die Validität des Ergebnisses nicht gegeben. Der Test sollte wiederholt werden. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 20 von 31

21 5.10. Delta-Ct-Werte Unten rechts auf Seite 2 des Reports befindet sich die Delta-Ct -Tabelle. Der Delta- Ct-Wert stellt ein Zwischenergebnis bei der Berechnung des EP Scores dar und wird aufgeführt, um einfacher nachvollziehen zu können, wie der EP-Score berechnet wird. Der Mittelwert der Ct-Werte der drei Referenzgene unter der Tabelle ist ein Maß für die Gesamt-RNA-Menge der Probe. Diese darf nicht zu klein sein, da sonst die informativen Gene potenziell nicht ausreichend präzise gemessen werden können. Daher wird dieser Wert einer Qualitätsprüfung durch EPRG unterzogen: Liegt er über EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 21 von 31

22 27 wird die Zahl rot hinterlegt. Der Test sollte mit erhöhter Gesamt-RNA-Menge wiederholt werden (siehe dazu Gebrauchsanweisung EndoPredict Abschnitt Problembehandlung zu wenig Ausbeute ) Chargen Auf Seite 3 des Reports werden die verwendeten Serien- und Chargennummern aufgeführt, soweit diese eingegeben wurden. Über die Serien- bzw. Chargennummern wird die Haltbarkeit der EndoPredict Platte, der qref-charge, des SS III RT/Platinum Taq Mix, des 2x Reaction Mix und des verwendeten qpcr-wassers (sofern angegeben) geprüft. Verläuft die Prüfung positiv, wird in der Spalte Haltbarkeit ein grüner Haken angezeigt, andernfalls wird ein rotes Kreuz abgebildet und es erscheint eine entsprechende Meldung. Wurden Daten für die EndoPredict Platte, die qref-, die SS III RT/Platinum Taq Mix-, die 2x Reaction Mix- oder die qpcr-wassercharge bereits in der PCR-Software eingetragen und stehen im Widerspruch zu den im Browser eingegebenen Daten, werden die Daten aus dem Browser verwendet, im Abschnitt Meldungen wird aber auf die widersprüchlichen Eingaben hingewiesen. Zudem erscheint in der Zusammenfassung der Qualitätskontrolle auf Seite 2 unter der Rubrik Chargen ein rotes Kreuz. Entsprechendes erfolgt, wenn abgelaufene Chargen verwendet wurden. EPReportGenerator_V3.1.1_DE.pdf Seite 22 von 31

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