Petra Schwille AG Experimentelle Biophysik, MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen

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1 HANDOUT BIOPHYSIK-PRAKTIKUM, Petra Schwille AG Experimentelle Biophysik, MPI für biophysikalische Chemie, Göttingen Experiment: Analyse intramolekularer Proteindynamik in GFP (green fluorescent protein) auf Einzelmolekülebene durch Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) Ziel: Im Rahmen des Praktikumsversuchs sollen die theoretischen Grundlagen, Meßprinzip und Anwendung der konfokalen FCS erlernt werden, um dann an einem System frei diffundierender Proteine in hochverdünnter Pufferlösung (ca. nm) die Abhängigkeit intramolekularer Dynamiken von den Umgebungsbedingungen (ph) zu untersuchen. Es soll ein Verständnis dafür hergestellt werden, welche zentralen Meßgrößen mit FCS zugänglich sind, und wie sich diese aus den gemessenen Autokorrelationskurven ableiten lassen. Falls die Puffermessungen zügig abgeschlossen werden, kann daraufhin noch versucht werden, diese Studie auch intrazellulär (an lebenden Zellen) durchzuführen. Theoretischer Hintergrund: a) Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) Im Gegensatz zur konventionellen Fluoreszenzspektroskopie gewinnt die FCS thermodynamische und kinetische Information nicht aus der Messung eines Ensemblemittels, sondern aus kleinsten statistischen Abweichungen vom Gleichgewicht, die als Fluktuationen des Fluoreszenzsignals F(t) gemessen werden können. Um solche spontanen Fluktuationen δf(t) überhaupt auflösen zu können, muß das observierte System so klein wie möglich gehalten werden. Idealerweise bestehen die durch FCS gleichzeitig analysierten Ensembles daher nur aus einem oder wenigen Molekülen. Erreichen kann man diese Beschränkung durch Kombination winziger Meßvolumina mit sehr geringen Konzentrationen der fluoreszenten Moleküle. In konfokalen Setups, die gegenwärtig zu den am häufigsten eingesetzten gehören, werden kleine Meßvolumina von < l dadurch erzeugt, daß ein paralleler Laserstrahl durch die Rückapertur in ein hochauflösendes Mikroskopobjektiv (NA > 0.9) eingestrahlt wird (sog. Epi- Illumination). Der so entstehende Fokalspot von nur 0.5 µm Durchmesser wird dann wiederum auf eine Lochblende in der Bildebene des Objektivs abgebildet, um ausreichende Tiefenschärfe (ca. 2 µm) zu gewährleisten. Bei einer Detektion hinter dieser Lochblende (Pinhole) tragen nur Moleküle innerhalb des so definierten Fokalvolumens zum Signal bei. Abb.1: Konfokales Prinzip für die FCS-Detektion. Das Laserlicht wird bis auf das Auflösungslimit fokussiert, das Fokalvolumen auf ein Pinhole oder eine Faser abgebildet. Der dichroische Spiegel trennt Anregungsvon Emissionslicht

2 Für die zeitliche Analyse der mittleren Fluktuationen im Fluoreszenzsignal δf(t), gemessen mit einer ultrasensitiven Avalanche-Photodiode, betrachten wir die folgende normierte Fluoreszenz-Autokorrelationsfunktion G(τ) in Abhängigkeit der Intervallzeit τ: G ( τ) = δf ( t ) δf ( t + τ) F( t) ii i i G(τ) kann im Prinzip als eine gewichtete Fluktuations-Zerfallsfunktion betrachtet werden (gewichtet mit der Intensität des Meßsignals im beobachteten Meßvolumen). Die Amplitude und das Abklingverhalten dieser Funktion sind durch die relative Stärke der Fluktuationen, sowie durch die Natur der sie induzierenden Prozesse bestimmt. Die ausgeprägtesten Fluktuationen, sozusagen ein Zeitfenster für die Messung aller schnelleren Dynamiken, entstehen durch die freie dreidimensionale Diffusion von in Lösung befindlichen Fluorophoren durch das offene Meßvolumen. In diesem Fall beschreibt die charakteristische Zerfallszeit von G(τ) einfach die mittlere Aufenthaltsdauer eines einzelnen Moleküls im Fokalbereich des Objektivs. Durch die Poisson sche Natur dieser Fluktuationen bei geringen Konzentrationen ist die Amplitude G(0) der normierten Korrelationsfunktion genau umgekehrt proportional zur mittleren Anzahl von Teilchen im Meßvolumen. Für frei diffundierende Moleküle einer Spezies i der Konzentration C i, gilt bei 3D-Gaußförmiger Ausleuchtung des Fokalvolumens folgender Zusammenhang: G diff ( ) = V 1 1 eff C i d,i z 0 d,i ( ) 1 2 ( 1 + r 0 ) 1 / mit dem effektiven Meßvolumen V eff und der mittleren Aufenthaltsdauer τ d,i eines Moleküls der Spezies i in V eff. r 0 und z 0 sind die 1/e 2 Halbachsen des Illuminationsprofils im Objektraum. Der Zusammenhang zwischen τ d,i und dem Diffusionskoeffizienten der Spezies i, D i, ist gegeben durch τ d,i = r 0 2 /4D i. Für den Fall, daß nun zusätzlich zu den mobilitätsabhängigen Fluktuationen noch weitere intramolekulare Dynamiken Fluktuationen im Fluoreszenzsignal induzieren, die phänomenologisch als ein hell-dunkel-blinken auf einer schnelleren Zeitskala (während des Aufenthalts einzelner Moleküle im Fokus) beschrieben werden können, ist G(τ) wie folgt zu modifizieren: G t τ f = (1 F + F e ) dif + fast F beschreibt hierbei die Fraktion der Moleküle, die sich zu jedem Zeitpunkt im dunklen Zustand befinden, bzw. die mittlere Zeit, die ein einzelnes Molekül in diesem Zustand verbringt. τ f ist die Inverse der charakteristischen Blinkrate: τ f = 1/(k d +k d ), wenn k d und k b die jeweiligen Übergangsraten vom Hell- zum Dunkelzustand und zurück bezeichnen. b) Das zu untersuchende Proteinsystem G dif Green fluorescent protein (GFP), ist ein kleines Protein, das natürlicherweise in der Hochseequalle Aequorea victoria vorkommt. Durch seine stabile Fluoreszenz, aber auch durch die Möglichkeit, es in verschiedensten Organismen zu klonieren, hat sich GFP zu einem der wichtigsten Hilfsmittel der Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. (links Abb. 2: Proteinstruktur von GFP, Chromophor in grün) 2

3 A pk-5.7 AH Es wurde gezeigt, daß bei niedrigen ph-werten das normalerweise anionische Chromophor extern (d.h. aus der Pufferumgebung des Proteins) protoniert wird, woraufhin sich das Absorptionsmaximum zu kürzeren Wellenlängen, von ca. 488 nm nach 400 nm verschiebt (Abb. 3). Für die FCS-Experimente bedeutet das, daß das Protein nicht mehr länger durch die eingestrahlte Laserlinie bei 488 nm angeregt werden kann und während der Lebenszeit des protonierten Zustandes dunkel erscheint. Die durch reversible Protonierung und Deprotonierung induzierte hell-dunkel-dynamik des Fluoreszenzsignals auf der Basis einzelner Moleküle ist repräsentiert durch eine charakteristische Schulter in der gemessenen Autokorrelationsfunktion, deren Analyse mittels der oben genannten Gleichungen wiederum eine exakte Bestimmung der Protonierungs- und Deprotonierungsraten sowie der Gleichgewichtskonstanten erlaubt. R bright O + H + k d k b R a dark OH b) Blinken a) Diffusion a) Abb. 4 oben: Protonierungsschema mit Hell-(deprotoniertem) und Dunkel- (protoniertem) Zustand im Falle einer Anregung bei 488 nm. Rechts sind die Autokorrelationsfunktionen abgebildet, die bei unterschiedlichen Pufferlösungen erhalten werden können. Die Schulter im schnellen Zeitbereich zeigt die Protonierungskinetik, die im langsamen Zeitbereich die Diffusion. Es ist deutlich zu sehen, daß sich die Fraktion der Moleküle im Dunkelzustand (Amplitude F der schnellen Dynamik) bei sinkendem ph vergrößert, während die Zeitkonstante τ f = 1/(k f +k d ) abnimmt. Praktische Arbeit: illuminated volume bb) 1. Setup Die Messungen werden an einem kommerziell erhältlichen Gerät der Firma Zeiss (ConfoCor II, kombiniert mit einem Laser-Scanning-Mikroskop) durchgeführt. Um in Puffer zu messen, werden einfach Tropfen der zu vermessenden Lösung auf das Mikroskopobjektiv aufgebracht. Die korrekte Anregungs-Wellenlänge sowie geeignete dichroische Spiegel und Bandpaßfilter können aus einer Liste ausgewählt werden und werden vom Gerät automatisch justiert (es empfiehlt sich, sich schon vorher über geeignete Filter/Spiegel/Laser Gedanken zu machen..) Die Anregungsintensität sollte den Versuchsbedingungen angepaßt werden. Was für Effekte sind bei zu hohen/ zu niedrigen Intensitäten zu erwarten? Wie beeinflußt die Intensität die Meßkurven tatsächlich? Messungen in Zellen (falls Zeit reicht) werden in eigens dafür konzipierten Kulturschalen durchgeführt. Vorsicht! Hier sind extrem niedrige Intensitäten auszuwählen. Warum?

4 2. Material Zunächst werden GFP-Pufferlösungen bei verschiedenen ph Werten untersucht. Eingesetzt werden Phosphat-Zitrat-Puffer bei ph 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 8, 9 und 10. Die Konzentration der GFP-Moleküle sollte unter 100 nm liegen, muß bei geringen ph-werten, bei denen ein Teil des Proteins bereits denaturiert ist, allerdings im meßbaren Bereich gehalten werden (ggf. höher konzentrieren). Die von uns untersuchte Mutante ist EGFP (Clonetech), mit einer gegenüber dem Wildtyp erhöhten Fluoreszenzausbeute und stabilität. Falls die Messungen in Puffer zufriedenstellend verlaufen, kann im Anschluß daran versucht werden, GFP in einer dieses Protein exprimierenden, lebenden Zelle zu messen. Hierbei ist es interessant, ob an unterschiedlichen Stellen in der Zelle unterschiedliche ph- Werte zu beobachten sind (Indikator ist jeweils die Protonierungs-Schulter in den FCS-Kurven). Kann die GFP-Bewegung in der Zelle als freie Diffusion mit homogenem Diffusionskoeffizienten beschrieben werden? 3. Datenauswertung Das Zeiss ConfoCor bietet eine automatische Fitroutine auf Basis des Marquardt- Levenberg Algorithmus, um die gemessenen Kurven durch die theoretischen Korrelationsfunktionen (s.o.) zu beschreiben. Die verfügbaren Modelle enthalten eine bis drei unabhängig diffundierende Spezies sowie einen Exponentialterm für schnelle Kinetiken (ursprünglich für Berücksichtigung des Triplett-Zustands bei hohen Intensitäten, aber in unserem Fall auch für die reversible Protonierung zu verwenden). Fragen zum eigenen Verständnis: 1. Welche Parameter könnte man als die zentralen Meßgrößen der FCS bezeichnen? 2. Was für Bedingungen sind phänomenologisch an ein zu untersuchendes System zu stellen, damit es überhaupt durch FCS analysierbar ist? 3. Inwiefern handelt es sich bei der FCS um eine Einzelmolekülmethode? 4. Welche Rolle spielt die konfokale Optik? Könnte man FCS auch anders durchführen? 5. Wenn ein Molekül nicht zwischen hell und dunkel, sondern zwischen hell und weniger hell blinkt, wie macht sich das voraussichtlich in der FCS-Kurve bemerkbar? Literature Eigen, M., and R. Rigler Sorting single molecules: Applications to diagnostics and evolutionary biotechnology. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 91: Elson, E.L., and D. Magde Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13:1-27. Haupts, U., S. Maiti, P. Schwille. and W.W. Webb Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: Magde, D., E.L. Elson, and W.W. Webb Thermodynamic fluctuations in a reacting system - measurement by fluorescence correlation spectrocsopy. Phys. Rev. Lett. 29: Rigler, R., Ü. Mets, J. Widengren, and P. Kask Fluorescence correlation spectroscopy with high count rates and low background: analysis of translational diffusion. Eur. Biophys. J. 22: Schwille, P FCS: Analyse biochemischer Systeme auf Einzelmolekülebene. Dissertation, TU Braunschweig

5 Thompson, N.L Fluorescence correlation spectroscopy. In Topics in Fluorescence Spectroscopy. Vol.1. J.R. Lakowicz, editor. Plenum Press, New York Tsien, RY The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67: Widengren, J., Ü. Mets, and R. Rigler Fluorescence correlation spectroscopy of triplet states in solution: A theoretical and experimental study. J. Chem. Phys. 99: