UvA-DARE (Digital Academic Repository) Molecular markers of breast cancer metastasis Weigelt, B. Link to publication

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1 UvA-DARE (Digital Academic Repository) Molecular markers of breast cancer metastasis Weigelt, B. Link to publication Citation for published version (APA): Weigelt, B. (2005). Molecular markers of breast cancer metastasis General rights It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Disclaimer/Complaints regulations If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please send a message to: UBAcoach or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam, The Netherlands. You will be contacted as soon as possible. UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam ( Download date: 08 jan. 2017

2 Zusammenfassung Brustkrebs ist die haufigste Krebserkrankung der Frau in der westlichen Welt. Die Todesursache von Brustkrebs ist jedoch nicht der primare Tumor in der Brust, sondern die Ansiedlung von verschleppten Krebszellen in lebenswichtigen Organen wie die Leber, Lunge oder das Gehirn. Diese Tochtergeschwülste, sogenannte Metastasen, treten bei ungefahr 40% aller Patientinnen mit Brustkrebs auf. Die Vorbeugung und Bekampfung der tödiichen Ausbreitung von Krebszellen durch den Körper ist somit das wichtigste Ziel bei der Behandlung von Brustkrebs. In der Klinik werden verschiedene prognostische Indikatoren benutzt, um Patiënten mit einem erhöhten Metastase-Risiko zu identifizieren, die anschliebend eine erganzende (adjuvante) medikamentöse Therapie erhalten sollten (Chemotherapie oder hormonale Behandlung). Für Brustkrebs gibt es keine einheitliche TherapiemaBnahme, da auch zunachst scheinbar gleiche Tumorerkrankungen unterschiedlich verlaufen können. Keiner der heutzutage bewahrten prognostischen Marker, wie zum Beispiel TumorgröGe, Tumorzellbefall der axillaren Lymphknoten oder Differenzierungsgrad des Tumors, kann einer individuellen Patientin exakt voraussagen, ob der Brusttumor metastasieren wird oder nicht (besprochen in Kapitel 1). Stattdessen können diese Faktoren nur eine grobe Einschatzung des Metastasierungs-Risikos geben. Um bessere prognostische Faktoren und neue therapeutische Angriffspunkte zu identifizieren, ist es unerlasslich, den augergewöhnlich komplexen Prozess der Metastasierung zu verstehen. Bevor sich eine Tumorzelle in ein Organ einnisten und zu einer klinisch feststellbaren Lasion auswachsen kann, muss diese eine Reihe von Schritten bewaltigen: das Durchbrechen durch die extrazellulare Matrix, den Eintritt in die BlutgefaSe, das Überleben im Blutstrom, Austritt aus den BlutgefaGen in ein Organ, sowie die Entwicklung einer eigenen Blutversorgung sind dafür unerlasslich. Eine weit akzeptierte Hypothese ist, dass Metastasen aus einigen wenigen Zeilen im primeren Tumor entstehen, die in einem spaten Stadium der Tumorentwicklung zusatzliche genetische Veranderungen erworben haben. Dadurch wird es diesen besonderen Zeilen ermöglicht, die gesamte Metastasierungs-Kaskade zu durchlaufen (besprochen in Kapitel 1). Diese Doktorarbeit beschreibt zwei Ansatze, um neue Einsichten in die Biologie der Metastasierung zu erwerben: Erstens sind der Nachweis und die prognostische Bedeutung disseminierter Brustkrebszellen, der direkten Ursache von Fernmetastasen, dargestellt. Zweitens sind die Genexpressionsmuster primarer Mammakarzinome und deren zugehöriger Metastasen beschrieben. lm Gegensatz zu den prognostischen Markern, die im primeren Tumor detektiert werden, gibt der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen im Blut dynamische Informationen bezüglich der klinischen Entwicklung des metastatischen Prozesses preis. In Kapitel 2 beschreiben wir die Entwicklung eines neuen, auf mrna basierten Testsystems für die Detektion von Tumorzellgenen mit Hilfe quantitativer Echtzeit-PCR und vier Makergenen. Zwei der verwendeten Gene, p1b and PS2, wurden in unserer SAGE-Analyse identifiziert als Gene, die unterschiedlich zwischen Mammakarzinomen und Blut 123

3 und Knochenmark exprimiert werden. Die zwei anderen Gene, CK19 und EGP2, dahingegen wurden bereits vorher erfolgreich durch uns und andere Forschungsgruppen verwende! Mit Hilfe einer quadratischen Diskriminanzanalyse, die alle vier Markergene berücksichtigt, haben wir eine erhöhte Markergen- Expression in Blut von 30/103 Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom nachweisen können (29%), wahrend keine erhöhten Expressionswerte im Blut von 96 gesunden Frauen gefunden wurden. In Kapitel 3 zeigen wir, dass Patientinnen mit fortgeschrittenem Brustkrebs signifikant schlechtere Aussichten auf ein progressionsfreies Überleben haben und eine verkürzte Lebensdauer aufweisen, wenn Tumorzell-mRNA im Blut nachgewiesen werden kann. Das entwickelte Testsystem hat daher eine klare biologische Bedeutung und spiegelt die Anwesenheit disseminierter Tumorzeilen wider. Ob der Nachweis von zirkulierenden Krebszellen auch im Frühstadium des Mammakarzinoms für die zukünftige Diagnose und Behandlung der Krankheit von Bedeutung ist, muss jedoch noch weiter untersucht werden. Aufgrund der überzeugenden Ergebnisse, die wir mit Hilfe unseres auf mrna basierten Testsystems erhalten haben, haben wir einen ahnlichen Test für den Nachweis von Brustkrebszellen in Lymphknoten entwickelt (Kapitel 4). Heutzutage stellt das Vorliegen von Lymphknotenmetastasen zum Zeitpunkt der Krebsdiagnose den bisher wichtigsten negativen Prognosefaktor für den Krankheitsverlauf dar. Urn eine representative Aussage über den sogenannten Nodalstatus (= Lymphknoten befallen oder nicht befallen) treffen zu können, wurden bisher bei der Standardbehandlung alle Lymphknoten aus der Achselhöhle entfernt. Eine weniger drastische Methode, um den Lymphknotenbefall zu untersuchen, ist die Wachterlymphknoten- Technik. Bei dieser Prozedur wird der erste Achsellymphknoten, der im Abfluss der Brust liegt, und damit auch der Ort mit der wahrscheinlichsten Metastasierung darstellt, durch Markierungssubstanzen identifiziert und gezielt entnommen. Bei einem unauffalligem Befund kann von einer Entfemung der Achsellymphknoten abgesehen werden. Mit Hilfe eines sensitiven Echtzeit-PCR Tests von vier Markergenen (CK19, p1b, EGP2 und SBEM) zeigten sieben der 70 untersuchten Lymphknoten (10%), die nach standardisierter histologischer Untersuchung tumorfrei waren, eine erhöhte Expression dieser Markergene, was auf die Prasenz von disseminierten Brustkrebszellen hindeutet. In vier der sieben Wachterlymphknoten mit einem positiven PCR Test wurden nach zusatzlichen histologischen Untersuchungen tatsachlich Tumorzellen gefunden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Anwendung unserer Technik von klinischer Relevanz sein kann. Um neue Kenntnisse über die molekularen Mechanismen der Entstehung von Metastasen zu erwerben, haben wir die Genexpressionsprofile von primeren Tumoren und den zugehörigen Metastasen bestimmt. In Kapitel 5 zeigen wir, dass Metastasen, die erst mehrere Jahre nach der Entfernung des Primartumors detektiert werden können, das gleiche Expressionsprofil wie ihre Stammtumore haben. AuBerdem konnte kein allgemeines Set von Genen identifiziert werden, das alle primare von den metastatischen Brusttumoren unterscheiden konnte. Dieses könnte auf die kleine ProbengröBe und auf die verschiedenen Metastasenorte, die analysiert wurden, zurückgeführt werden. Die Gene, die unterschiedlich zwischen Primartumoren und Metastasen in den einzelnen Paaren exprimiert werden, sind 124

4 hauptsachlich spezifisch für die Organe, aus welchen die Metastasen entnommen wurden. Unsere Ergebnisse stellen das herrschende Metastasierungsmodell in Frage und implizieren, dass die genetischen Veranderungen in einem Primartumor, welche Metastasierung begunstigen, viel früher in der Tumorentwicklung stattfinden als bisher angenommen. AuBerdem spricht unsere Studie gegen das Konzept, dass bei der Translokation einer Tumorzelle zu einem fernen Organ im Körper groge Veranderungen in der Genexpression des Tumors stattfinden. Nach unseren Ergebnissen sind die Veranderungen in der Genexpression einer metastatischen Kolonie verglichen mit dem primeren Tumor viel subtiler als erwartet (Kapitel 6)- Zwei wichtige Studiën haben von der Mikroarray - Technologie Gebrauch gemacht, urn humane Brusttumore aufgrund ihrer Genaktivitat zu klassifizieren. Dabei wurden neue Gruppen von Brusttumoren identifiziert, die von grober Bedeutung für die Behandlung von Patiënten sein können. Brusttumore, die mit hierarchischem Clustering von Expressionsmustern der 'intrinsischen' Gene analysiert wurden, konnten in mindestens vier molekulare Subtypen eingeteilt werden. Diese molekularen Subtypen sind mit signifikant unterschiedlichen Krankheitsverlaufen assoziiert (Perou er al., Nature 406, 2000; Sorlie et al., PNAS 98, 2001). Mit Hilfe einer 'supervisierten' Klassifikation wurde eine 70-Gen-Signatur identifiziert, die wesentlich genauer als bisher das spatere Entstehen oder Fernbleiben von Metastasen innerhalb von fünf Jahren in jungen Brustkrebspatienten vorhersagen kann (van 't Veer et al., Nature 415, 2002). In Kapitel 7 zeigen wir, dass Metastasen nicht nur das Gesamt-Expressionsprofil, sondern auch dieselben molekularen Brustkrebs- Subtypen und die 70-Gen-Signatur aufzeigen wie ihr Primartumor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Fahigkeit eines Mammakarzinoms, Fernmetastasen bilden zu können, schon früh in der Tumorentwicklung festgelegt wird. Die axillaren Lymphknoten sind oft die ersten Stellen, die Metastasen des Primartumors beherbergen. Wir konnten zeigen, dass primare Mammakarzinome und Lymphknotenmetastasen sich auf transkriptioneller Ebene nicht durch eine gemeinsame Gengruppe voneinander unterscheiden. Jedoch können wir subtile Unterschiede in der Expression von Genen, die bei Umgestaltung der extrazellularen Matrix, den Zell-Matrix Wechselwirkungen und bei der Signalwirkung von Wachstumsfaktoren eine Rolle spielen, in den individuellen Paaren von primeren und metastatischen Tumoren nachweisen (Kapitel 8). Unsere Daten suggerieren, dass primare Mammakarzinome unikale und komplizierte 'Organe' sind, die individuelle Gensets verwenden können, urn zu den Lymphknoten zu metastasieren. Darüber hinaus konnten in dem Datensatz von 295 Brustkrebs Patiënten, der 151 nodal-negative und 144 nodalpositive Patiënten umfasst (van de Vijver et al., N Engl J Med 347, 2002), keine Expressionsmuster nachgewiesen werden, die den Nodalstatus in der Achselhöhle voraussagen können. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Metastasierung zu den Lymphknoten unabhangig von der hamatogenen Metastasierung stattfindet. Somit ist der Lymphknoten- Status ein wenig verlasslicher Pradiktor des Krankheitsverlaufs bei Brustkrebspatientinnen. Die in dieser Doktorarbeit beschriebenen Experimente zeigen, dass die Prasenz von mrnas, die von zirkulierenden Tumorzellen stammen konnten, mit einer quantitativen Multimarker PCR- Analyse in Blut und Lymphknoten 125

5 nachgewiesen werden können. Darüber hinaus suggerieren unsere Ergebnisse, dass die Prasenz von zirkulierenden Tumorzellen im Blut von prognostischer Bedeutung sind. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit haben auberdem zum weiteren Verstandnis des Metastasierungsprozesses beigetragen, da wir gezeigt haben, dass die allgemeinen Expressionsmuster, die molekularen Brustkrebs- Subtypen sowie die 70-Gen-Signatur eines primeren Mammakarzinoms wahrend der Metastasierung erhalten bleibt. Gegenwartig herrscht ein erhebliches Interesse an Genexpressionsanalysen, urn den Erfolg einer Therapie voraussagen zu können, was einen weiteren Schritt in die Richtung der 'personalisierten Medizin' für die Behandlung von Brustkrebs darstellt. Die Daten, die in dieser Doktorarbeit prasentiert werden, implizieren, dass Therapieempfehlungen, die auf Expressionsmustern des Primartumors basieren, eine vielversprechende Vorgehensweise für das Bekampfen von Mikrometastasen sind. 126

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