Immunoenzymetrischer Assay für die quantitative In-vitro-Messung von 25-Hydroxyvitamin D 2 und D 3 (25-OH-D 2 und 25-OH-D 3 ) in Serum.

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1 Immunoenzymetrischer Assay für die quantitative In-vitro-Messung von 25-Hydroxyvitamin D 2 und D 3 (25-OH-D 2 und 25-OH-D 3 ) in Serum. ZUSAMMENFASSUNG MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 1 von 14

2 Einsatzbereich Der MicroVue 25-OH Vitamin D EIA-Test ist für die quantitative Bestimmung von 25-Hydroxyvitamin D 2 und D 3 (25-OH D 2 und 25-OH D 3 ) in Humanserum bestimmt. Die Ergebnisse sind gemeinsam mit anderen klinischen oder Laborbefunden zur Feststellung des Vitamin-D-Status eines Patienten zu beurteilen. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN Vitamin D ist der allgemeine Begriff für Vitamin D 2 oder Ergocalciferol und Vitamin D 3 oder Cholecalciferol. Vitamin D 3 wird nach der Einwirkung von UV-Licht der Sonne auf natürliche Weise in der Haut des Menschen gebildet. Vitamin D 3 wird hauptsächlich in der Leber zu 25-Hydroxyvitamin D 3 (25-OH D 3 ) metabolisiert; dies ist die wesentliche Form von Vitamin D, das im Körper zirkuliert. 25-OH D 3 ist ein Vorläufer von anderen Vitamin-D- Metaboliten und verfügt selbst über eine begrenzte Aktivität. Das aktivste Derivativ ist 1, 25-Hydroxyvitamin D 3, das von 1-Hydroxylation von 25-OH D 3 in der Niere (oder Plazenta) produziert wird. 25-OH Vitamin D stimuliert sowohl die intestinale Absorption von Calcium und Phosphor als auch die Knochenresorption und Mineralisierung. 25-OH Vitamin D kann auch in anderen Geweben aktiv sein, die für den Calciumtransport verantwortlich sind (z. B. Plazenta, Niere, Milchdrüse) und endokrinen Drüsen (z. B. Nebenschilddrüsen, Beta- Zellen). Vitamin D 3 und Vitamin D 2 sind außerdem über die Nahrungsaufnahme in Form von Nahrungsmitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln verfügbar. Da Vitamin D 2 ähnlich wie Vitamin D 3 metabolisiert wird, tragen beide zum allgemeinen Vitamin-D-Status eines Menschen bei. Es ist daher äußerst wichtig, beide Formen von 25-OH Vitamin D gleichermaßen zu messen, um eine korrekte Diagnose von Vitamin-D-Mangel, -Insuffizienz oder Intoxikation zu erhalten. Vitamin-D-Mangel ist ein entscheidender Risikofaktor für Rachitis, Osteomalazie, Altersosteoporose, Krebs und Schwangerschaftsverläufe. Außerdem ist die Messung beider 25-OH Vitamin-D-Formen erforderlich, um die Ursache von abnormen Serumcalciumkonzentrationen in Patienten zu bestimmen. Es hat sich gezeigt, dass Vitamin-D-Intoxikation Nieren- und Gewebeschäden verursacht. FUNKTIONSPRINZIP Der MicroVue 25-OH Vitamin D EIA ist ein Festphasen-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), der auf Mikrotiterplatten durchgeführt wird. Während des ersten zweistündigen Inkubationsschrittes wird bei Raumtemperatur das Gesamt-25-OH Vitamin D (D 2 und D 3 ) in den Standardlösungen, Kontrollen und Proben von bindenden Proteinen im Serum getrennt und bindet sich an den Bindungsstellen eines bestimmten monoklonalen Antikörpers. Nach dem ersten Waschzyklus konkurriert eine festgelegte Menge von biotinyliertem 25-OH Vitamin D, in Gegenwart von Meerrettich-Peroxidase (HRP), mit dem ungekennzeichneten 25-OH Vitamin D 2 und 25-OH Vitamin D 3, die an den monoklonalen Antikörper gebunden sind. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Mikrotiterplatte gewaschen, um die kompetitive Reaktion zu beenden. Die chromogene Lösung (TMB) wird hinzugefügt und für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Hinzugeben von Stopplösung gestoppt, und die Mikrotiterplatte wird bei der entsprechenden Wellenlänge gemessen Die Menge an Substratumsatz wird kolorimetrisch durch Messung der Absorption bestimmt, die proportional zur Gesamt-25-OH Vitamin D (D 2 und D 3 ) Konzentration ist. Es wird eine Standardkurve erstellt, und die Gesamt-25-OH Vitamin D (D 2 und D 3 ) Konzentrationen in den Proben werden durch Interpolation von der Standardkurve bestimmt. MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 2 von 14

3 MITGELIEFERTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN Der MicroVue 25-OH Vitamin D EIA enthält Folgendes: A B-F 25-OH Vitamin-D-Standardlösungen Artikelnr. A (Kalibrator 0) Je 1 x 2 ml (Std A) Lyophilisiert. Nullstandard ist die biologische Matrix (Humanplasma) mit Gentamycin und ProClin. Mit 2 ml entionisiertem Wasser rekonstituieren. 25-OH Vitamin-D-Standardlösungen B-F (Kalibratoren 1-5) Artikelnr. B-F Je 1 x 1 ml (Std B-F) Lyophilisiert. Pferdeserum mit Gentamycin und Proclin. Jedes Fläschchen mit 1 ml entionisiertem Wasser rekonstituieren. L 25-OH Vitamin-D-Kontrolle (Kontrolle 1) Artikelnr Je 1 x 1 ml Lyophilisiert. Humanserum mit ProClin. Mit 1 ml entionisiertem Wasser rekonstituieren. H 25-OH Vitamin-D-Kontrolle (Kontrolle 2) Artikelnr Je 1 x 1 ml Lyophilisiert. Humanserum mit ProClin. Mit 1 ml entionisiertem Wasser rekonstituieren. ❶ Mikrotiterplatte Artikelnr x 8 Vertiefungen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, beschichtet mit einem monoklonalen Antikörper, der gezielt 25-OH Vitamin D 2 und D 3 bindet. ❷ Stopplösung Artikelnr. SS04 12 ml Enthält 1 M Salzsäure (HCl). ❸ 200X Waschpufferkonzentrat (Waschlösung) Artikelnr ml Enthält TRIS-HCl. Mit entionisiertem Wasser verdünnen. ❹ TMB-Substrat (chromogene Lösung TMB) Artikelnr. SB04 12 ml Gebrauchsfertig. Enthält 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidin (TMB). ❺ Biotinyliertes 25-OH Vitamin D (konzentriertes Konjugat) Artikelnr ,4 ml 25-OH konzentriertes Konjugat. Mit Rekonstitutionslösung verdünnen. ❻ Konzentrierte Meerrettich-Peroxidase (HRP) Artikelnr ,2 ml Enthält konzentrierte Meerrettich-Peroxidase (HRP). ❼ Rekonstitutionslösung (konjugierter Puffer) Artikelnr ml Gebrauchsfertig. Konjugierter Puffer mit Kasein und ProClin. ❽ Assay-Puffer (Inkubationspuffer) Artikelnr ml Gebrauchsfertig. Inkubationspuffer mit Kasein und ProClin. ProClin ist eine eingetragene Marke der Rohm und Haas Company. Hinweis: Benutzen Sie 25-OH Vitamin D Standard A (Kalibrator 0) zur Probenverdünnung mit Werten über dem höchsten Standard. Es ist kein internationales Referenzmaterial verfügbar ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL Folgendes Material wird benötigt, aber nicht mit dem Kit mitgeliefert. Entionisiertes oder destilliertes Wasser Pipetten: 50 µl, 150 μl, 200 µl und 1 ml (die Verwendung von Präzisionspipetten mit Einwegplastikspitzen wird empfohlen) Vortex-Mixer Magnetrührer Plattenschüttler (300 bis 700 U/min) Waschgerät für Mikrotiterplatten Mikrotiterplatten-Lesegerät zur Auswertung bei 450 nm und 650 nm oder 630 nm (bichromatische Auswertung) MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 3 von 14

4 WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN Sicherheit Nur zur In-vitro-Diagnostik. Die menschlichen Blutkomponenten in diesem Kit wurden mit europäischen und in den USA erprobten FDA- Methoden getestet; sie waren negativ für HBsAg, anti-hcv, anti-hiv-1 und 2. Keine bekannte Methode kann jedoch vollkommene Sicherheit darüber liefern, dass menschliche Blutbestandteile nicht Hepatitis, AIDS oder andere Infektionen übertragen. Daher sollte der Umgang mit Reagenzien, Serum oder Plasmaproben in Übereinstimmung mit den Sicherheitsbestimmungen erfolgen. Alle tierischen Produkte und deren Derivate wurden von gesunden Tieren gesammelt. Komponenten von Rindern stammen aus Ländern, in denen BSE nicht nachgewiesen wurde. Trotzdem sollten Komponenten, die tierische Substanzen enthalten, als potenziell infektiös betrachtet werden. Hautkontakt mit allen Reagenzien vermeiden. Die Stopplösung enthält Salzsäure (HCl). Bei Kontakt gründlich mit Wasser spülen. Im Arbeitsbereich nicht rauchen, trinken oder essen und keine Kosmetika verwenden. Nicht mit dem Mund pipettieren. Schutzkleidung und Einweghandschuhe tragen. Weitere Informationen finden Sie auf dem Sicherheitsdatenblatt auf quidel.com. LAGERUNG Vor dem Öffnen oder der Rekonstitution sind alle Kit-Komponenten bis zum Ablaufdatum (Angaben auf Etikett) bei Lagerung bei 2 C bis 8 C stabil. Nach der Rekonstitution sind die Standardlösungen und Kontrollen acht Wochen bei 2 C bis 8 C stabil. Aliquote müssen bei längerer Aufbewahrung bei -20 C eingefroren werden; dann sind sie maximal 3 Monate haltbar. Aufeinanderfolgende Einfrier-/Auftauzyklen vermeiden. Frisch zubereitete Waschlösung sollte am selben Tag benutzt werden. Veränderungen im Aussehen der Kit-Reagenzien können ein Anzeichen für Instabilität oder Zerfall sein. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Waschpuffer Ein angemessenes Volumen Waschpuffer-Gebrauchslösung aus einem Anteil Waschlösung (200x) mit 199 Anteilen entionisiertem Wasser vorbereiten. Mit einem Magnetrührer gleichmäßig durchmischen. Nicht benutzte Waschpuffer-Gebrauchslösung am Ende des Tages entsorgen. Standardlösung A Standardlösung A mit 2 ml destilliertem Wasser rekonstituieren. Standardlösungen B-F Standardlösungen B-F mit 1 ml destilliertem Wasser rekonstituieren. Kontrollen Die Kontrollen mit 1 ml destilliertem Wasser rekonstituieren. HRP-Konjugat-Gebrauchslösung pipettieren Die HRP-Konjugat-Gebrauchslösung muss innerhalb von 15 Minuten nach Beginn des ersten zweistündigen Inkubationsschrittes vorbereitet werden. Je nach Anzahl der verwendeten Streifen ein geeignetes Volumen an HRP-Konjugat-Gebrauchslösung durch Mischen des konzentrierten Konjugats, konzentrierten HRP und Konjugatpuffers wie unten angegeben vorbereiten: Z. B. für 6 Streifen (48 Vertiefungen): µl konzentriertes Konjugat und 50 µl konzentrierter HRP zu 10 ml Konjugatpuffer. Mit einem Vortex gleichmäßig durchmischen. MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 4 von 14

5 Das HRP-Gebrauchskonjugat bis zur Verwendung bei Raumtemperatur lagern und direktes Sonnenlicht vermeiden (zur Vorbereitung kann ein braunes Glasfläschchen benutzt werden). Das HRP-Gebrauchskonjugat ist instabil und muss entsorgt werden, wenn es nicht benutzt wird. Anzahl Streifen Volumen biotinyliertes 25-OH Vitamin D (µl) Volumen konzentrierte HRP (µl) Volumen Rekonstitutionslösung (ml) ENTNAHME UND LAGERUNG DER PROBEN Das Kit ist für Serumproben geeignet. Serumproben müssen bei 2 C bis 8 C gelagert werden. Wird der Test nicht innerhalb von 24 Stunden durchgeführt, wird eine Lagerung bei -20 C empfohlen. Aufeinanderfolgende Einfrier-/Auftauzyklen vermeiden. ASSAYVERFAHREN Handhabungshinweise Das Kit oder die Komponenten nicht nach dem Verfalldatum verwenden. Materialien aus verschiedenen Chargen dürfen nicht untereinander vertauscht werden. Alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur bringen. Alle Reagenzien und Proben gründlich durch sanftes Schütteln oder Wirbeln mischen. Standardlösungen, Kontrollen und Proben doppelt ausführen. Vertikale Ausrichtung wird empfohlen. Für die Vorbereitung der Waschlösung einen Kunststoffbehälter verwenden. Um Kreuzkontamination zu vermeiden, eine saubere Pipettenspitze zum Hinzufügen der einzelnen Reagenzien und Proben verwenden. Zur Pipettierung des TMB-Substrats und der Stopplösung keine Pipetten mit Metallteilen verwenden. Präzisionspipetten oder ein automatisches Pipettiersystem erhöhen die Präzision. Achten Sie auf die Einhaltung der Inkubationszeiten. o Zur Vermeidung von Drift muss die Zeit zwischen dem Pipettieren der ersten Standardlösung und der letzten Probe auf die Zeit beschränkt werden, die in Abschnitt XIII, Absatz E (Zeitverzögerung) aufgeführt wird. Für jeden Durchlauf eine Kalibrationskurve erstellen, nicht die Daten von früheren Durchläufen verwenden. Das TMB-Substrat innerhalb von 15 Minuten nach dem Waschen der Mikrotiterplatte pipettieren. Während der Inkubation mit dem TMB-Substrat ist die Mikrotiterplatte vor direktem Sonnenlicht zu schützen. MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 5 von 14

6 Durchführung 1. Die für den Lauf erforderliche Anzahl von Mikrotiterstreifen auswählen. Die verwendeten Mikrotiterstreifen sollten wieder dicht im Beutel verschlossen und mit Trockenmittel bei 2 C bis 8 C gelagert werden. 2. Die Streifen im Halterahmen befestigen. 3. Jeweils 50 µl Kalibrator, Kontrolle und Probe in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren µl Assay-Puffer in die Vertiefungen pipettieren. 5. Für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler (300 bis 700 U/min) inkubieren. 6. Die HRP-Konjugat-Gebrauchslösung vorbereiten, sobald die Inkubation gestartet wird (innerhalb von 15 Minuten). 7. Die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung absaugen. 8. Die Platte dreimal wie folgt waschen: 0,4 ml Waschlösung in jede Vertiefung pipettieren. Den Inhalt jeder Vertiefung absaugen µl der HRP-Konjugat-Gebrauchslösung in jede Vertiefung pipettieren. Die Mikrotiterplatte 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler (300 bis 700 U/min) inkubieren. 10. Die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung absaugen. 11. Die Platte dreimal wie folgt waschen: 0,4 ml Waschlösung in jede Vertiefung pipettieren Den Inhalt jeder Vertiefung absaugen 12. Innerhalb von 15 Minuten nach dem Waschvorgang µl TMB-Substrat in jede Vertiefung pipettieren. 13. Die Mikrotiterplatte 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler (300 bis 700 U/min) inkubieren. 14. µl Stopplösung in jede Vertiefung pipettieren. 15. Die Absorptionen bei 450 nm (Referenzfilter 630 nm oder 650 nm) innerhalb 1 Stunde auswerten und die Resultate wie im Abschnitt Auswertung der Ergebnisse beschrieben auswerten. INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE Liegen die für Kontrolle L und/oder Kontrolle H erzielten Ergebnisse nicht in dem auf dem Fläschchenetikett angegebenen Bereich, können die Werte ohne treffende Erklärung der Abweichung nicht weiterverarbeitet werden. Falls zusätzliche Kontrollen erwünscht sind, kann jedes Labor seinen eigenen Pool herstellen, der in Aliquote eingefroren werden sollte. Kontrollen mit erhöhten Azidkonzentrationen stören die Enzymreaktion und können nicht verwendet werden. Akzeptanzkriterien für die Differenz zwischen den Resultaten der Wiederholungstests anhand der Proben müssen auf guter Laborpraxis beruhen. Es wird empfohlen, Kontrollen im Assay routinemäßig wie unbekannte Proben zu behandeln, um die Assayvarianz zu messen. Die Leistung des Assays muss mit den Qualitätskontrollkurven der Kontrollen überprüft werden. Es hat sich bewährt, die vom Computer ausgewählte Kurvenanpassung visuell zu überprüfen. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 1. Die Platte bei 450 nm gegen einen auf 650 nm (oder 630 nm) eingestellten Referenzfilter auswerten. 2. Den Mittelwert der beiden Bestimmungen berechnen. 3. Für jede Standardlösung, Kontrolle und Probe Folgendes berechnen: B/B0(%) = OD (Standardlösung B-F, Kontrolle oder Probe) OD (Standardlösung A (Nullkalibrator)) X MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 6 von 14

7 4. Entweder linear-lineares oder semi-logarithmisches Millimeterpapier benutzen, um die (B/B0(%))-Werte für jeden Standardpunkt als Funktion der 25-OH Vitamin-D-Konzentration für jede Standardlösung zu zeichnen. Offensichtliche Ausreißer verwerfen. 5. Computergestützte Methoden können ebenfalls zur Erstellung der Standardkurve verwendet werden. Falls die Ergebnisberechnung mit dem Computer durchgeführt wird, wird die Berechnung mit einer 4 Parameter -Kurvenfunktion empfohlen. 6. Durch Interpolation der Probe (B/B0-%-Werte) die 25-OH Vitamin-D-Konzentrationen der Proben mithilfe der Standardkurve ermitteln. TYPISCHE DATEN Die folgenden Daten dienen nur zu Demonstrationszwecken und können nicht als Ersatz für die Echtzeit- Standardkurve verwendet werden. Standardlösung Absorption (OD) Ergebnis (ng/ml) A 2,54 0 B 1,71 10 C 1,27 25 D 0,61 55 E 0,23 F 0, ERWARTETE WERTE Ernährung, Ethnie, Jahreszeit und Alter können den normalen Spiegel von 25-OH Vitamin D 3 beeinflussen. Jedes Labor sollte seine eigenen Bereiche auf Grundlage der örtlichen Bevölkerung festlegen. In aktuellen Veröffentlichungen wurden die folgenden Bereiche für die Klassifizierung des 25-OH Vitamin-D-Status empfohlen: Spiegel ng/ml Mangel <10 Insuffizienz Suffizienz 30- Mögliche Toxizität > REFERENZBEREICH Die Referenzbereiche wurden anhand von 150 offensichtlich gesunden Personen aufgestellt. Die verwendeten Serumproben einzelner Patienten stammen von einer zertifizierten gewerblichen Quelle und wurden mit Einwilligung des jeweiligen Patienten von einer FDA-lizenzierten Spenderdatei entnommen. 50 Proben stammen aus dem Norden der USA (Pennsylvania), 50 Proben stammen aus der Mitte der USA (Tennessee), und 50 Proben stammen aus dem Süden der USA (Florida). Die Proben wurden in den Wintermonaten (Januar bis März) sowohl von hell- als auch dunkelhäutigen Probanden im Alter von 21 bis 92 Jahren entnommen. Die Probanden, von denen die Proben entnommen wurden, nahmen keine Vitamin-D-Ernährungsergänzung ein, und bei ihnen lag keine Familiengeschichte von Nebenschilddrüsen- oder Calcium-Regulierungserkrankungen oder Nieren-, Leber-, Nebenschilddrüsen-, Calcium-Erkrankungen oder bariatrische Chirurgie vor, und sie nahmen keine Medikamente ein, von denen bekannt ist, dass sie die Absorption und den Stoffabau von Vitamin D beeinflussen. Die folgende Tabelle ist die Zusammenfassung der Ergebnisse: Konzentration Florida Tennessee Pennsylvania Gesamt Höchste Konzentration (ng/ml) 88,6 71,7 54,6 88,6 Niedrigste Konzentration (ng/ml) 6,1 4,9 5,9 4,9 Medianwert der Konzentration (ng/ml) 20,8 15,9 14,3 17,2 Nur die mittleren 95 % (2,5 % bis 97,5 %) der beobachteten Ergebnisse wurden verwendet. MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 7 von 14

8 METHODENVERGLEICH Die Leistung des MicroVue 25-OH Vitamin D EIA-Tests wurde anhand einer Korrelationsstudie ermittelt, die an drei verschiedenen Zentren mit insgesamt 356 Proben durchgeführt wurden. Die Proben wurden mithilfe des MicroVue 25-OH Vitamin D EIA-Tests und einem kommerziell erhältlichen 25-OH Vitamin D EIA-Test getestet. Die Ergebnisse beliefen sich von 8,0 ng/ml bis 123,0 ng/ml, der Korrelationskoeffizient zwischen den beiden Methoden betrug 0,917, mit einem 95-%-Konfidenzintervall von 87,6 % bis 93,6 %, einer Steigung von 0,954 und dem y-schnittpunkt von 3,05. Die folgenden Kurven fassen die Ergebnisse zusammen: LEISTUNG DES TESTS Grenzen des Tests 1. Der Test unterstützt die Diagnose und muss zusammen mit klinischen Befunden eingesetzt werden. 2. Die Leistung des Assays wurde nicht für pädiatrische Populationen bestimmt. 3. Proben, bei denen davon ausgegangen wird, dass sie Konzentrationen enthalten, die über dem höchsten Kalibrator liegen, sollten verdünnt getestet werden. 4. Hämolysierte Proben sollten nicht verwendet werden. MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 8 von 14

9 Nachweisgrenzen Die Leerwertgrenze (LOB), die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) wurden gemäß CLSI- Richtlinie EP17-A festgelegt. Die LOB wurde durch mehrmaliges Messen des Leerwertes und Berechnen des 95. Perzentils der Distribution der Testwerte berechnet. Die LOB wurde als 1,69 ng/ml berechnet. Die LOD wurde wie in der Richtlinie beschrieben berechnet. Die LOB wurde als 2,81 ng/ml berechnet. Die LOQ wurde durch Testen von 5 Proben mit niedrigem Wert 10 Mal in unterschiedlichen Tests berechnet. Die LOQ wurde als 4,32 ng/ml mit einem VK von 20 % berechnet. SPEZIFIZITÄT Kreuzreaktivität Die Kreuzreaktivität des MicroVue 25-OH Vitamin D EIA wurde ermittelt, indem Testserum mit aufgestockten und mit nicht aufgestockten Kreuzreaktanden getestet wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Verbindung und Konzentration Aufgestocktes Vitamin D (ng/ml) Nicht aufgestocktes Vitamin D (ng/ml) % Kreuzreaktion 1,25(OH) 2 -Vitamin D 3 bei 200 ng/ml 57,3 16,7 20,3 1,25(OH) 2 -Vitamin D 2 bei 690 ng/ml 29,9 16,7 1,9 Vitamin D 3 bei 200 ng/ml 22,5 16,7 2,9 Vitamin D 2 bei 200 ng/ml 19,3 16,7 1,3 24,25(OH) 2 -Vitamin D 3 bei 20 ng/ml 87,9 16,7 > 25,26(OH) 2 -Vitamin D 3 bei 4 ng/ml 31,1 16,7 > 3-epi-25-Hydroxyvitamin D 3 bei 20 µg/ml 31,58 16,7 0,07 25-OH Vitamin D 3 bei 10 ng/ml 26,7 16,7 25-OH Vitamin D 2 bei 10 ng/ml 25,0 16,7 83 Störsubstanzen Die Auswirkung von potenziellen Störsubstanzen auf Proben, die den MicroVue 25-OH Vitamin D EIA-Test verwenden, wurde beurteilt. Verschiedene Spiegel von Hämoglobin, Bilirubin, Triglycerid, Vitamin C, konjugiertes und nicht konjugiertes Bilirubin und Zemplar in Serumproben wurden bei Proben mit unterschiedlichen 25-OH Vitamin-D-Konzentrationen getestet. Unser Akzeptanzkriterium war eine Störung von weniger als 10 %. Die getesteten Substanzen beeinflussten nicht die Leistung des MicroVue 25-OH Vitamin-D-EIA-Tests. Substanz 25-OH Vitamin D (ng/ml) Störstoffkonzentration (mg/dl) Streuung % 7, Hämoglobin 29, ,5 % 42, ,0 50 Konjugiertes Bilirubin 50-3,5 % 21,5 38,6 50 Konjugiertes Bilirubin 7,6 50 Nicht konjugiertes Bilirubin 29,3 50 2,5 % 42,5 50 MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 9 von 14

10 Substanz 25-OH Vitamin D (ng/ml) Störstoffkonzentration (mg/dl) Streuung % 7,6 7, Triglycerid 29,3 7, ,3 % 42,5 7, , Vitamin C 21, ,6 % 38, , Biotin 19,8 0, ,6 % 36,1 0,2 2 4 Zemplar 17,6 0,0013 0,0025 0,0050 0,0013-4,3 % 33,5 0,0025 0,0050 MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 10 von 14

11 Präzision Die Assay-Präzision wurde mithilfe von Proben berechnet, die mindestens 20 Tage lang auf drei verschiedenen Chargen ausgeführt wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten zusammengefasst: Intra-Assay Probe N <X> ± SD (ng/ml) A B C D ,6 ± 0,4 27,4 ± 1,5 43,0 ± 1,2 81,2 ± 2,0 VK (%) 7,8 5,5 2,7 2,5 SA : Standardabweichung, VK: Variationskoeffizient Inter-Assay Probe N <X> ± SD (ng/ml) A B C D ,7 ± 1,3 26,3 ± 1,3 42,0 ± 1,9 85,4 ± 7,8 VK (%) 7,4 4,7 4,5 9,4 Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit des Assays erfolgte anhand von drei Proben, die doppelt für fünf Tage zweimal täglich an drei Zentren mit zwei Laborassistenten je Zentrum ausgeführt wurden. Die mittleren Ergebnisse sind in der Tabelle unten zusammengefasst: Probe n ng/ml , , ,8 Innerhalb eines Durchlaufs Zwischen Durchläufen Zwischen Tagen Zwischen Laborassistenten Zwischen Zentren Gesamt SA 0,217 0,611 0,975 1,537 2,206 2,59 VK 0,3 % 0,9 % 3,8 % 6,0 % 8,7 % 10,2 % SA 0,638 1,571 1,108 2,285 4,310 5,192 VK 0,9 % 2,3 % 2,1 % 4,3 % 8,2 % 9,8 % SA 1,00 1,735 1,834 3,391 4,906 6,190 VK 1,4 % 2,5 % 1,5 % 2,7 % 3,9 % 5,0 % Rückgewinnung Die Rückgewinnung wurde durch Hinzufügen verschiedener Mengen von 25-OH Vitamin D zu den Proben bewertet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten zusammengefasst: Rückgewinnungstest 25-OH-Vit D 3 hinzugefügt (ng/ml) Rückgewinnung (%) OH-Vit D 2 hinzugefügt (ng/ml) Rückgewinnung (%) MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 11 von 14

12 Linearität Zwei Proben, deren Konzentrationen bekanntermaßen im messbaren Bereich verteilt sind, wurden bei äquidistanten Verdünnungen getestet, um den linearen Bereich des Assays zu ermitteln. Eine lineare Regressionsanalyse wurde durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Probe 1 Probenverdünnung Theoretische Konzentration (ng/ml) Gemessene Konzentration (ng/ml) Y- Schnittpunkt R 2 Rückgewinnung (%) 1/1 1/2 96,7 48,5 96,7 47,6 98,1 1/4 24,2 24,5 1,015-0,298 0,99 101,2 1/8 12,1 11,1 91,7 1/16 6,0 6,2 103 Probe 2 Steigung Probenverdünnung Konzentration (ng/ml) Konzentration (ng/ml) gung Schnittpunkt (%) Theoretische Gemessene Stei- Y- R 2 Rückgewinnung 1/1 122,9 122,9 1/2 61,5 64, /4 30,7 31,5 1,005 0,435 0, /8 15,4 15,0 97,4 1/16 7,7 7,6 98,7 Es wurde ein linearer Assaybereich von 7,7 ng/ml bis 122,9 ng/ml ermittelt. Zeitverzögerung Der Zeitverzögerungstest zwischen den letzten Standard- und Probenzugabeergebnissen sind in der folgenden Tabelle zu sehen. Probe 1 Probe 2 Zeitverzögerung 0 min (ng/ml) 10 min (ng/ml) 20 min (ng/ml) 27,9 30,5 30,2 49,5 47,5 49,0 Die Assayergebnisse bleiben auch dann genau, wenn die Zugabe des Assay-Puffers 10 und 20 Minuten nach dem Hinzufügen der Standardlösung in die beschichteten Vertiefungen erfolgt ist. KUNDENDIENST Um eine Bestellung aufzugeben oder technischen Support anzufordern, wenden Sie sich bitte an einen Quidel- Repräsentanten unter der Nummer (gebührenfrei in den USA) oder (außerhalb der USA), Montag bis Freitag zwischen 8.00 und Uhr (Ostküstenzeit). Bestellungen können auch per Fax aufgegeben werden: Für -Support wenden Sie sich bitte an oder Für Dienstleistungen außerhalb der USA wenden Sie sich bitte an Ihren Distributor vor Ort. Weitere Informationen über Quidel, unsere Produkte und unsere Distributoren sind auf unserer Website quidel.com zu finden. MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 12 von 14

13 LITERATURVERWEISE 1. Zerwekh, J.E. Blood biomarkers of Vitamin D status. Am. J. Clin. Nutr. 2008; 87(suppl):1087S-1091S. 2. Holick, M.F. Resurrection of Vitamin D deficiency and rickets. J. Clin. Invest. 2006; 116: Heaney, R.P. Vitamin D: how much do we need and how much is too much. Osteoporos. Int. 2000; 11(7) Dawson-Hughes B., Heaney R.P., Holick M.F., Lips P., Meunier P.J. Prevalence of vitamin D insufficiency in an adult normal population. Osteoporos. Int., 1997; 7: Bischoff-Ferrari, H.A., Giovannucci, E., Willett, W.C., Dietrich, T., Dawson-Hughes, B. Estimation of optimal serum concentrations of 25-hydroxyvitamin D for multiple health outcomes. Am. J. Clin. Nutr. 2006; 84(1): Holick, M.F. Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases, cancers and cardiovascular disease. Am. J. Clin. Nutr. 2004; 80(6 suppl):1678s-1688s. 7. Heaney, R.P. Defining deficiency of vitamin D. In: Clinical Laboratory International. 2010; 34: Holick, M.F. Vitamin D deficiency. N. Engl. J. Med. 2007; 357(3): Taha, N.M., Vieth, R. The problem of an optimal target level for 25-Hydroxyvitamin D, the test for vitamin D nutritional status. In: Clinical Laboratory International. 2010; 34: Holick M.F. Vitamin D status: measurement, interpretation, and clinical application. Ann. Epidemiol., 2009;19: National Osteoporosis Foundation Prevention Vitamin D EP17-A-Protokolle zur Bestimmung von Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen; genehmigte Richtlinie, veröffentlicht vom Clinical and Laboratory Standards Institute MicroVue 25-OH Vitamin D EIA-Kit MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Deutschland Quidel Corporation McKellar Court San Diego, CA USA quidel.com 8046DE01 v2014may21 MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 13 von 14

14 Bestellnummer CE-Konformitätszeichen Autorisierte Vertretung in der Europäischen Gemeinschaft Chargencode Zur In-vitro-Diagnose Verwenden bis Hersteller Temperaturbegrenzung Einsatzbereich e-labeling-gebrauchsanweisung lesen WARNHINWEIS: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken (oral) Biologische Risiken Inhalt ist ausreichend für X Bestimmungen Inhalt/Enthält Kontrolle MicroVue 25-OH Vitamin D EIA Seite 14 von 14

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