Aufreiningung der DNA aus dem Nukleosomenleiter-Beispiel Isolierung von RNA aus Milzzellen

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1 1 2 Biochemisches Praktikum: Nukleinsäuren Teil 2 Bsp. I Bsp. II Aufreiningung der DNA aus dem Nukleosomenleiter-Beispiel Isolierung von RNA aus Milzzellen I. Lehrinhalte: Phenolextraktion zur Aufreinigung von DNA aus Proteinhaltigen Lösungen RNA Isolation nach Chomczynski und Sacchi: GITC-Lyse und saure Phenolextraktion Agarose-Gelelektrophorese von DNA und RNA II. Hintergrund: Zu den Hintergründen des Nukleosomenleiterbeispiels siehe Arbeitsvorschrift DNA (1). RNA Isolation aus Zellen und Geweben ist eine wichtige Methode im Laboralltag und hochwertige RNA ist die Voraussetzung für eine Vielzahl molekularbiologischer Methoden. Für die Isolation intakter RNA ist es wichtig einige grundlegende Maßnahmen zu beachten: Verwendung von RNase-freien Reagenzien und Puffern zügiges Arbeiten auf Eis und unter möglichst RNase-freien Bedingungen Arbeiten mit Handschuhen, gestopften Pipettenspitzen ( filter-tips ) Die RNA Isolation wird nach der Standardmethode von Chomczynski und Sacchi durchgeführt. A single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraction. Analytical Chemistry 1987 Die Methode ist schnell und zuverlässig und wurde von mehreren kommerziellen Anbietern weiterentwickelt. Fertige Reagenzien werden unter den Namen TRIzol (Invitrogen), TriReagent (Sigma-Aldrich) oder RNAgents (Promega) vertrieben. Sie enthalten Guanidinium-thiocyanate und saures! Phenol. Die Zellen werden lysiert und nahezu alle Proteine, darunter auch RNasen, denaturiert. Durch Zugabe von Chloroform entmischen sich die organische und die wässrige Phase. Da DNA in saurem Phenol in Lösung geht, befindet sich in der wässrigen Phase ausschließlich RNA die anschließend sehr leicht gefällt werden kann.

2 2 Die Methode isoliert die gesamte RNA. Im Gegensatz dazu gehen bei Säulchen-basierten Reinigungsverfahren RNAs mit einer Länge unter 200 Nukleotiden (trnas, 5S rrna, 5,8S rrna, mirna, snrna) aufgrund der geringen Bindung zu den Silica-Säulchen zum größten Teil verloren. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist, dass aus der organischen Phase nach Bedarf auch DNA und Protein aus denselben Proben isoliert werden kann. Die gefällten Nukleinsäuren aus beiden Beispielen werden im Agarosegel analysiert. Da Nukleinsäuren bei neutralem ph eine negative Ladung aufweisen, wandern sie im elektrischen Feld in Richtung der Anode. Die Agarosematrix wirkt als molekulares Sieb, das die elektrophoretische Mobilität der Fragmente in Abhängigkeit der Größe (bei RNA auch Konformation!) bremst und zu einer Auftrennung von Molekülen unterschiedlicher Größe führt.

3 3 III. Aufgabenstellung der Versuche: A. Reinigung und elektrophoretische Auftrennung der Nukleosomenleiter DNA mittels Agarose-Elektrophorese. Abschätzen der Fragmentlänge in Abhängigkeit der Dauer der MNase Behandlung. B. Isolierung von Gesamt RNA aus Mausmilzzellen, Elektrophoretische Analyse der RNA: Identifizierung 18S und 28S rrna Banden ( Intaktheit der RNA Proben). IV. Durchführung der Experimente: Experiment I: Reinigung von DNA mittels PCI Extraktion Fortsetzung des Nukleosomenleiterexperiments vom ersten Praktikumstag: (15) Die Proben der letzten Woche werden in einem zweiteiligen Arbeitsgang extrahiert: Dabei werden Proteine in die organische Phase gezogen (=extrahiert), während Nukleinsäuren in der wäßrigen Phase verbleiben. (aus Sicherheitsgründen ist die PCI / CI Extraktion ausschließlich in Schraubeppis durchzuführen!!!) (a) Zugabe von 200μl PCI (Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol-25:24:1) Vortexen und kurzes Zentrifugieren ( 1min bei ca rpm ) Durch die Zentrifugation wird lediglich die Phasentrennung beschleunigt. Die wässrige Phase abpipettieren, ohne sie mit der unteren organischen Phase zu kontaminieren. Überstand in vorher eindeutig beschriftetes (!) 1.5ml Schraubverschluß- Eppendorf Reaktionsgefäß transferieren. Langsam pipettieren (mit der 100µl Pipette), besonders wenn DNA hochmolekular ist! Die organische Phase ist durch das dem Phenol als Oxidationsschutz hinzugefügte 8-Hydroxy- Chinolin gelbgefärbt und somit leicht von der wässrigen Phase zu unterscheiden! (b) Extraktion der wässrigen Phase mit Chloroform: Zugabe von 200μl Chloroform zum wässrigen Überstand der PCI Extraktion, Vortexen und Trennen der Phasen durch Zentrifugation wie bei Schritt (a). Transferieren des Überstandes in ein neues Eppendorf - Reaktionsgefäß. Für die nachfolgende Ethanolfällung ist es erforderlich das Volumen des Überstands zu ermitteln.

4 4 (16) (a) Zugabe von 3 M NaAcetat, uzw. 1/10 Volumenanteil des ermittelten Überstand- Volumens. Damit die Präzipitation quantitativ verlaufen kann, ist eine entsprechende Konzentration an monovalenten Kationen (i.u.f. Na + ) zur Neutralisierung der negativ geladenen Phosphatgruppen erforderlich. (z. B. wenn Üst.-Vol nach der CHCl 3 - Extraktion 150μl beträgt, müssen 15μl der 3 M Acetat-Lösung zugegeben werden.) (b) Zugabe von 1µl (5mg/ml) linearem Polyacrylamid (LPA) Um geringe DNA-Mengen quantitativ zu fällen oder für DNA-Mengen <5μg ist zum Sichtbarmachen des Pellets die Zugabe eines Carriers empfehlenswert; Details siehe Begleitvorlesung) (17) EtOH-Fällung: Zugabe von doppeltem Volumen eisgekühlten Ethanols, bezogen auf das Gesamtvolumen (CI-Überstand + Acetat-Lösung+ LPA). Kurzes Vortexen. Dicht verschraubtes Reaktionsgefäß etwa ½ Stunde in Eiswasser lagern. Wenn der Alkohol nicht mit der Probe vermischt wird, kommt es auch zu keiner Präzipitation! Die vielfach empfohlene Lagerung bei 20 oder 70 bringt keinen Vorteil, sondern provoziert höchstens die störende Copräzipitation von Salzen! Reaktionsgefäße 10 min bei maximaler Umdrehzahl zentrifugieren. (18) Überstand vollständig abheben und verwerfen. Das DNA-Präzipitat soll unter keinen Umständen versehentlich in die Pipettenspitze gelangen; d.h. langsam pipettieren unter ständiger Beobachtung des Pellets! EtOH-Pellet ca. 20 min Lufttrocknen dann in 100μl Wasser lösen. (20) 20μl des gelösten Pellets werden entsprechend mit 6x Probenpuffer versetzt und mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Gelkonzentration 1.8% (w/v) Details werden in der Begleitvorlesung besprochen! (21) Die Sichtbarmachung der DNA-Banden erfolgt mittels Ethidiumbromid-Fluoreszenz, die Auswertung der Gele mit Hilfe eines Videokamera-Systems. Achtung: Ethidiumbromid steht im Verdacht karzinogen zu sein!!! Befolgen Sie deshalb strikt die Anweisungen der Lehrpersonen!

5 5 Experiment II: Isolierung von RNA aus Milzzellen. Ca. 5x10 6 Milzzellen sind für die RNA Isolierung in 500µl Trizol lysiert worden. In Trizol können RNA Proben bei -80 C problemlos mehrere Wochen gelagert werden. Trizol enthält auch Phenol, es gelten dieselben Sicherheitsmaßnahmen wie bei der PCI Extraktion. Vor Beginn: Vorbereiten des Arbeitsplatzes Bevor mit der RNA Isolation begonnen wird, sollte sichergestellt werden, dass eine Eisbox und gestopfte Pipettenspitzen, sowie alle notwendigen Reagenzien in Reichweite sind. Wenn Kühlzentrifugen vorhanden sind, sollten diese rechtzeitig auf 4 C vorgekühlt werden. (1) Klären der Trizolproben, Zentrifugation für 10 Minuten bei max. RPM Da relativ viel Material im Trizol gelöst ist, ist es notwendig unlösliche Bestandteile (Protein und hochmolekulare DNA) vor der weiteren Prozessierung der Proben abzutrennen. Überführen des Trizols in ein Schraubeppi! (2) Zugabe von 100µl Chloroform CHCl 3 ) pro 500µl Trizol Chloroform ist dichter als Trizol und sinkt an den Boden des Eppis. Es erfolgt zu diesem Zeitpunkt noch keine Phasentrennung. (3) Mischen der Proben am Vortex für ca. 10 sec. Danach 15 Minuten bei max. RPM Zentrifugieren Ordentlich mischen Chloroform und Trizol ergeben ein rosa Emulsion. Durch das Chloroform wird eine Entmischung der organischen und der wäßrigen Phase bewirkt. Die Zentrifugation beschleunigt die Phasentrennung (4) Abheben der wäßrigen Phase (ca. 200µl) Trizol enthält einen roten Farbstoff, die Phasengrenze ist sehr einfach zu erkennen. Da im Anschluß kein CI Extraktion gemacht wird, ist es umso wichtiger nichts von der organischen Phase zu erwischen. (5) Fällen der RNA durch Zugabe von 250µ Isopropanol und Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Proben unbedingt mischen!

6 6 Da in der wäßrigen Phase ausreichend Salz gelöst ist, ist eine Zugabe von Na-Acetat nicht notwendig. Für sehr kleine RNA Mengen empfiehlt sich die Zugabe eines Carriers (LPA). 10 Minuten bei max. RPM zentrifugieren. (6) Abheben des Überstands. Waschen des Pellets in 180µl Ethanol (70%) Vorsicht!!! Pellets aus Isopropanol-Fällungen kleben nicht besonders gut an den Reaktionsgefäßen. Pellet nicht in die Pipettenspitze einsaugen! Da noch ein Waschschritt folgt dürfen ein paar Microliter zurückbleiben. 5 Minuten bei max. RPM zentrifugieren. (7) Abheben des Überstands (quantitativ) und Trocknen des RNA Pellets Wichtig! Darauf achten, dass der gesamte Überstand entfernt wird. RNA Pellets sind milchig weiß, werden aber sobald sie trocken sind beinahe durchsichtig. Pellets sollten auch nicht übertrocknet werden, da sie sich sonst nur noch sehr schwer lösen lassen. (8) Lösen des RNA Pellets in 50µl RNase-freiem Wasser Pellet nicht(!) resuspendieren. Wasser zugeben und Pellet für einige Minuten quellen lassen. Danach kann das Pellet durch Vortexen oder Resuspendieren sehr einfach gelöst werden. (9) 20μl des gelösten Pellets werden entsprechend mit 6x Probenpuffer versetzt und mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Gelkonzentration 1% (w/v) (10) Die Sichtbarmachung der RNA-Banden erfolgt mittels Ethidiumbromid-Fluoreszenz, die Auswertung der Gele mit Hilfe eines Videokamera-Systems. Die scharfe Abgrenzung der rrna Banden ist ein Kriterium für die Qualität der RNA

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