Gewebe basierte genomische Untersuchungen: Diagnostische und prädiktive Marker in der Pathologie
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- Miriam Holst
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1 Gewebe basierte genomische Untersuchungen: Diagnostische und prädiktive Marker in der Pathologie SULM, Aurel Perren Insitut für Pathologie Universität Bern
2 Gewebe: Big Data, Forschung pnet Forschung
3 Genomische Untersuchungen Diagnostische Marker Prognostische Marker Prädiktive Marker Beispiele aus der Onkologie: Mamma-CA / Lungen-CA
4 Neuerkrankungen und Sterbefälle Anzahl pro Jahr, Frauen, CH Brust Dickdarm Lunge Melanom Gebärmutterkörper Non-Hodgkin-Lymphom Bauchspeicheldrüse Eierstöcke Schilddrüse Leukämie Mundhöhle, Rachen Magen Niere Blase Gehirn, ZNS Gebärmutterhals Leber Speiseröhre Hodgkin-Lymphom Durchschnittliche Anzahl Fälle pro Jahr ( ) 7'000 6'000 5'000 4'000 3'000 2'000 1' '000 2'000 Neuerkrankungen Sterbefälle Quelle: NICER-Neuerkrankungen, BFS-Sterbefälle 4
5 5-Jahres-Überleben bei Krebs CH nach Krebslokalisationen, Überlebensrate, (%), Relatives Überleben 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Hodenkrebs Hautmelanom Schilddrüsenkrebs Prostatakrebs Hodgkin-Lymphom Brustkrebs Corpus uteri Non-Hodgkin-Lymphom Cervix uteri Dickdarmkrebs Leukämie Blasenkrebs Magenkrebs Lungenkrebs Leberkrebs Brustfell Pankreaskrebs Quelle: NICER Männer Frauen 5
6 Aufgaben der Pathologie Art-Diagnose Benigne vs. Maligne CA vs. Lymphom vs. Melanom vs. Primärtumor vs. Metastase, Typ Prognostische Marker Staging Grading Zusätzliche Marker Prädiktive Marker
7 Aufgaben der Molekularpathologie Art-Diagnose Benigne vs. Maligne CA vs. Lymphom vs. Melanom vs. Sarkom Primärtumor vs. Metastase, Typ Prognostische Marker Staging Grading Zusätzliche Marker Prädiktive Marker
8 Invasiv duktales/nst Karzinom Art-Diagnose
9 Mammakarzinom: Aufarbeitung Klassische prognostische Marker Breast Cancer Res Treat 2008
10 Prädiktive Marker Mib1 = Vorgehen seit 20 Jahren Hohe Proliferation (MIB-1) MIB1
11 Prädiktive Marker HER2 HER2 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Rote Signale: HER2 Gen Grüne Signale: Kontroll-Gen
12 115 Mammakarzinome Sørlie, PNAS 2003
13 Mammakarzinom nicht nur EIN Tumor Typ ER Luminal A + MOL Luminal B + MOL Normal-like + MOL Basal-like - MOL* Triple-negativ - MORPH* HER2 +/- MORPH
14 Basal Luminal A Luminal B HER2/neu / hoch tief hoch hoch 40 % 20 % % % ER / PR HER2/neu Wachtstumsrate Prävalenz
15 Adjuvante medikamentöse Therapie: die gute Wahl?
16 Molekularpathologie auf RNA-Ebene RNA-Tests beinhalten Proliferationsgene, ER- HER2-Signalling Prädiktiver Test für nicht-notwendigkeit von Chemotherapie (<10% Risiko)
17 Mamma-CA Diagnostische Marker: Subtyp, definiert durch IHC (+/- Genexpression) Prognostische Marker: Gen-Expression in selektierten Fällen ER +, HER2- Prädiktive Marker: ER; HER2, kein Marker für adjuvante Chemo
18 Genomische Untersuchungen Diagnostische Marker Prognostische Marker Prädiktive Marker Beispiele aus der Onkologie: Mamma-CA / Lungen-CA
19 Prädiktive Marker: Lugen CA Lungenkarzinom Tumor mit dem höchsten Anteil an Sterbefällen weltweit und in Deutschland Starke AssoziaLon mit Rauchen Inzidenz der Männer sinkt Inzidenz der Frauen steigt Lebenszeitrisiko in Deutschland Männer 6,2% Frauen 2,5% Prozentualer Anteil der häufigsten TumorlokalisaLonen an allen Krebssterbefällen in Deutschland 2008 Robert Koch InsLtut, Krebs in Deutschland 8. Ausgabe 2012
20 Lungen-CA 40% bereits bei Diagnosestellung Stadium T4 Kaum Verbesserung der therapeulschen OpLonen in den letzten Jahrzehnten 5-Jahres Überlebensraten <20% Modell-Erkrankung für die Entwicklung zielgerichteter Therapien Robert Koch InsLtut, Krebs in Deutschland 8. Ausgabe 2012
21 Art-Diagnose Adenokarzinom ca. 40% Pla^enepithelkarzinom 25-30% Undiff. großzelliges Karzinom 10-15% Kleinzelliges Karzinom 20%
22 Signalkaskaden im Lungen-CA Rezeptor-Tyrosinkinasen GF EGFR, HER2, ALK, KIT, PDGFRα etc. Zellmembran PI3K RTK K K GRB2 SOS AKT TSC1/2 PTEN (K)RAS (B)RAF Rheb MEK mtor ERK Prolifera1on, Hemmung der Apoptose, Angiogenese Zellkern
23 Adenokarzinom der Lunge Keine Muta1on detek1ert KRAS 22% Ev. Inhibierung nachgeschalteter Enzyme (MEK) Ros Ret MEK1 MET Amp HER2 PIK3CA BRAF Doppelmuta1onen 3% EML4-ALK 7% EGFR 17% ErloLnib/GefiLnib Critozinib Nach Kris et al., J Clin Oncol 2011; 29: Abstr. CRA7506
24 Mutationsnachweis Sanger Sequenzierung Pyrosequenzierung Extraktion von Tumor- DNA Schmelzkurven-Analyse Amplifikation mittels PCR Array-Hybridisierung Mutationsnachweis
25 Input
26 Input
27 Methodenwahl Method Sensi1vity Sanger sequencing 10 20% Pyrosequencing 5% Next GeneraLon Sequencing 2% Allele specific PCR 1% Digital PCR 0.1% Sensitivity: detection of mutant allel
28 Input Laser-capture Mikrodissektion
29 Vorgehen «Salamitaktik» Histologie/ IHC ADC PEC KRAS Muta1on Keine weitere Untersuchung + EGFR Muta1on Keine weitere Untersuchung + EML4-ALK Transloka1on Keine weitere Untersuchung + Weitere Muta1onsanalysen? Keine weitere Untersuchung modified according to Horn L. and Pao W., JCO, 2009
30 Vorgehen «One stop shop» Library preparation Template preparation Maxwell DNA-Extraction 0h Ion Chef Seq Analys Torrent Server Library Preparation Template Preparation Raw Data processing 10h 20h DNA-Concentration Bioanalyzer 30h Sequencing Variant Calling Qubit Agilent 2100 PGM
31 Aktuell Schweizer Diagnostik- Standard: cancer panels (z.b. 50 Gene/ 207 Exone) Pao and Girard, Lancet Oncol., 2011
32 Qualitätskontrolle
33 Variant calling
34 Visuelle Kontrolle der Variants EGFR p.glu746_ser752>val (c.2235_2255>g
35 Zukunft Whole Exomes? Interdisziplinäre Zusammenarbeit Interinstitutionelle Zusammenarbeit
36 Genomische Untersuchungen Diagnostische Marker Prognostische Marker Prädiktive Marker Beispiele aus der Onkologie: Mamma-CA / Lungen-CA
37 Fragen?
38 EGFR-Mutationen EGF binding EGF binding TM Tyrosine kinase Autophophoryla1on Exon MutaLons associated with drug resistance D761Y T790M (50%)* D770_N771>NPG D770_N771>SVQ D770_771>G, N771T V769L S768I (<1%) (5%) Exon 18 Exon 19 Exon 20 Exon 21 G719C G719S G719A V689M N700D E709K/Q S720P (5%) E756_A750del E746_751del E746_A750>RP etc. (in-frame delelons) (45%) V765A T783A (<1%) L858R (40-45%) N826S A839T K846R L861Q G863D (40-45%) MutaLons associated with drug sensilvity Sharma SV, Nature Rev Cancer 2007
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