Vorlesung Einführung in die Bioinformatik

Transkript

1 Vorlesung Einführung in die Bioinformatik Dr. Stephan Weise

2 Einführung Gegeben: zwei Sequenzen Gesucht: Ähnlichkeit quantitativ erfassen Entsprechungen zwischen einzelnen Bausteinen beider Sequenzen feststellen Gesetzmäßigkeiten der Konservierung und Variabilität beobachten Rückschlüsse auf entwicklungsgeschichtliche Verwandtschaftsverhältnisse ziehen Anwendung: Annotation von Genomen Zuordnung von Funktion und Struktur für möglichst viele Gene Dr. Stephan Weise Folie # 2

3 Homologe Gene Homologe Gene: stammen von einem gemeinsamen Vorläufer ab Orthologe Gene: homologe Gene aus verschiedenen Organismen Paraloge Gene: Sind in einem Genom Beruhen auf einer Duplikation eines Gens innerhalb eines Genoms und der Akkumulation von Mutationen in einer der Kopien. Dr. Stephan Weise Folie # 3

4 Evolution Die Sequenzen verändern sich in der Evolution, durch die Deletion, Insertion, Mutation. Dr. Stephan Weise Folie # 4

5 Sequenzidentität S 1 : 5' ACCCTGGGACT 3' S 2 : 5' ACCCTGGGACT 3' Match Dr. Stephan Weise Folie # 5

6 Sequenzähnlichkeit S 1 : 5' ACCCTGGGACT 3' S 2 : 5' ACTCTGGGACT 3' Mismatch Match Dr. Stephan Weise Folie # 6

7 Sequenzähnlichkeit Insertion S 1 : 5' ACCCTGGGACT 3' S 2 : 5' AC.CTGGGACT 3' Deletion Dr. Stephan Weise Folie # 7

8 Sequenzähnlichkeit S 1 : 5' ACCCTGGGACT 3' S 2 : 5' AC...GGGACT 3' Indel Neben identischen (Match) und nicht-identischen Positionen(Mismatch) in einem Alignment gibt es Lücken (Gaps), die dadurch entstehen, dass in den Sequenzen Positionen eingefügt (Insertionen) oder entfernt wurden (Deletionen). Verantwortlich dafür sind Mutationen der DNA. Dr. Stephan Weise Folie # 8

9 Sequenzhomologie S 1 : 5' ACCCTGGGACT 3' S 2 : 5' ACTCTGGGACT 3' Die Kenntnisse über die Geschichte der Veränderungen liegen leider nicht vor. Man muss zwischen Sequenzidentität (100% Übereinstimmung), Sequenzähnlichkeit (Verwandtschaftsverhältnis in %) Sequenzhomologie unterscheiden. Homologe Gene haben eine signifikante Sequenzähnlichkeit, die auf eine enge evolutionäre Verwandtschaft hinweist. Dr. Stephan Weise Folie # 9

10 Zentrale Voraussetzung Ist die Funktion eines Proteins bzw. Sequenzabschnitts bekannt, kann man dieselbe Funktion nach Ähnlichkeit der Sequenzen mit bestimmter Wahrscheinlichkeit zuordnen. Dr. Stephan Weise Folie # 10

11 DOTPLOT Dotplot = Punkteschema Ähnlichkeit von zwei Sequenzen Tabelle oder Matrix: Zeilen entsprechen Bausteinen der ersten Sequenz Spalten entsprechen Bausteinen der zweiten Sequenz Wenn Übereinstimmung, dann Füllen der Felder Abschnitte mit ähnlichen Bausteinen werden als Diagonalen von links oben (Nordwest) nach rechts unten (Südost) sichtbar Beispiel (engl. Proteinkristallografin): D O R O T H Y C R O W F O O T H O D G K I N D O R O T H Y H O D G K I N Dr. Stephan Weise Folie # 11

12 DOTPLOT Dr. Stephan Weise Folie # 12

13 DOTPLOT Repetitive Sequenz: A B R A C A D A B R A C A D A B R A Dr. Stephan Weise Folie # 13

14 DOTPLOT Palindromische Sequenz: M A X I S T A Y A W A Y A T S I X A M Dr. Stephan Weise Folie # 14

15 DOTPLOT und Alignment D O R O T H Y C R O W F O O T H O D G K I N D O R O T H Y H O D G K I N Jeder Pfad von links oben nach rechts unten durch den Dotplot läuft durch eine Abfolge von Zellen, und jede dieser Zellen repräsentiert zwei Positionen- eine aus der Zeile, die andere aus der Spalte -, die einander im Alignment entsprechen, oder aber sie stellt eine Lücke in einer der Sequenzen dar! Dr. Stephan Weise Folie # 15

16 Beispiel (erzeugt mit JDotter) Dr. Stephan Weise Folie # 16

17 Dotplots Sliding Window Ein Punkt repräsentiert die Ähnlichkeit zwischen Sequenzen und nicht eine einzelne Base Dr. Stephan Weise Folie # 17

18 Dotplots Dotplot CACTA Transposon Sliding Window: 5 much noise Dr. Stephan Weise Folie # 18

19 Dotplots Dotplot CACTA Transposon Sliding Window: 50 some structures not visible Dr. Stephan Weise Folie # 19

20 Dotplots Dotplot CACTA Transposon Sliding Window: 25 Dr. Stephan Weise Folie # 20

21 JDotter: A Dot Matrix Plotter for Java sliding windows zoom alignment tool Dr. Stephan Weise Folie # 21

22 Dotplots Quelle: Schulz et al. (2008) Dot-plots. a) T 1 = T 2 b) Repetitive Sequenz c) Palindromische Sequenz d) Teilweise palindromische Sequenz e) Basenwiederholung, z.b. (G) 50, Microsatellite Repeats f) Tandem Repeats, z.b. (AGCTCTGAC) 20, Minisatellite Pattern g) Homologe Sequenzen mit gemeinsamem Vorläufer h) INDEL Dr. Stephan Weise Folie # 22

23 Wie Sequenzähnlichkeit messen? Wie kann man ein quantitatives Maß für Sequenzähnlichkeit definieren? Definition von Entsprechungen Sequenz-Alignment ist der Nachweis solcher Entsprechungen zwischen Sequenzbausteinen DAS GRUNDLEGENDE WERKZEUG der BIOINFORMATIK! Zuordnung von Entsprechungen, bei der die Reihenfolge der Bausteine erhalten bleibt, ist ein Alignment Lücken sind dabei erlaubt! Beispiel: Folge 1 = a b c d e Alignment: a b c d e a c d e f Folge 2 = a c d e f Dr. Stephan Weise Folie # 23

24 Maße für Sequenzähnlichkeit Stand: Dotplots und Alignments nach Augenmaß Gesucht: quantitative Maße für Ähnlichkeiten Beispiele: Hamming-Distance: zwischen zwei per Definition gleich langen Sequenzen, ist die Zahl der Positionen mit unterschiedlichen Zeichen. agtc cgta Hamming-Abstand = 2 Levenshtein-Distance (Edit Distance): zwischen zwei Sequenzen (nicht unbedingt gleich lang), ist die Mindestzahl von Editieroperationen, die erforderlich sind, um eine Kette in die andere umzuwandeln. ag-tcc cgctca Levenshtein-Abstand = 3 Editieroperationen: Deletion, Insertion oder Punktmutation in einer Sequenz Dr. Stephan Weise Folie # 24

25 Maße für Sequenzähnlichkeit Problem: bestimmte Abweichungen unterschiedlich wahrscheinlich: Ähnliche Aminosäuren (physikalische, chemische Eigenschaften) häufiger ausgetauscht verschiedene Editieroperationen bekommen unterschiedliche Wichtung Computerprogramm ermittelt nicht nur Mindest- Editierabstand sondern auch optimales Alignment Wichtungen für Einzelschritte addieren und so Gesamt-SCORE ermitteln Bei Substitutionen wird Wert der Mutation addiert. Bei horizontalen und vertikalen Zügen wird Lückenstrafe (gap penalty) gezählt. Dr. Stephan Weise Folie # 25

26 Scoring-Schema entspricht einem Bewertungssystem Handling von Substitutionen, Insertionen und Deletionen Sequenz 1 Insertion -> Sequenz 2 Deletion und umgekehrt Gewichtung der Deletion (Lücken in Sequenz) hängt von Länge ab Hamming und Leveshtein Maße für Unähnlichkeit!!! geringer Abstand ähnlich großer Abstand unähnlich Scores in Molekularbiologie sind Maß für Sequenzähnlichkeit: ähnliche Sequenz hoher Score unähnliche Sequenz niedriger Score Algorithmen zum Finden des optimalen Alignments suchen entweder nach geringem Wert für Unähnlichkeit oder nach möglichst hohem Score für Ähnlichkeit! Dr. Stephan Weise Folie # 26

27 Similarity higher value => more similar reward for match (blastn: 1) penalty for mismatch (blastn: -3) penalty for opening a gap (blastn: -1) penalty for extending a gap (blastn: -1) t c a g - - a t c c t c c g c c a t c a Score = -2 Dr. Stephan Weise Folie # 27

28 Globale und Lokale Alignments Dr. Stephan Weise Folie # 28

29 Alignment-Algorithmen Aufgabe: optimales Alignment zweier Sequenzen bestimmen Dynamische Programmierung Smith-Waterman für lokales Alignment Needleman-Wunsch für globales Alignment Heuristische Methoden: Optimales Alignment kann nicht garantiert werden Sehr gute Näherung und signifikant schneller BLAST Dr. Stephan Weise Folie # 29

30 BLAST BLAST (Altschul et al. 1990) = Basic Local Alignment Search Tool Vergleicht DNA- oder Protein-Sequenzen mit Sequenzen in einer Datenbank Vorgehen: Finden kurzer, exakter Übereinstimmungen (Initialisierung) Sukzessive Vergrößerung der Teilstücke durch benachbarte Suchwörter fester Länge Scoring dieser Suchwörter muss größer als ein angegebener Parameter sein High Scoring Pairs (HSPs) Dr. Stephan Weise Folie # 30

31 BLAST Beispiel: Lokales High Scoring Pair (HSP) entsteht durch die Erweiterung des exakten Treffers AGT (dunkelblau) Erweiterung in beide Richtungen (Verwendung von Reward, Penalty, Gap, ) Im Bsp.: lokales Maximum Sowohl Verlängern als auch Verkürzen würde den Score reduzieren Solche lokal maximalen Segmentpaare können dann zu größeren lokalen Alignments kombiniert werden (inkl. INDELs) Dr. Stephan Weise Folie # 31

32 BLAST Algorithmus: Parameter Wichtige Parameter für blastn -W word-size -r match reward -q mismatch penalty -G gap opening cost -E gap extension cost Dr. Stephan Weise Folie # 32

33 BLAST: Blastable Database erstellen Indizierung der Datenbasis für schnelle Suche formatdb i mydatabase p F -i Name der FASTA-Datei, aus der eine Blastable Database erstellt werden soll -p F für Nukleotide T für Proteine Dr. Stephan Weise Folie # 33

34 NCBI-Blast blastall p blastn i myseq d mydb o output -p -i -d -o algorithm query sequences in (multiple-)fasta blastable database output file -e 1E-10 optional e-value threshold Dr. Stephan Weise Folie # 34

35 Verschiedene BLAST-Verfahren Dr. Stephan Weise Folie # 35

36 Bedeutung des Alignments Ähnlichkeit festgestellt Zufall oder Signifikanz Bei Münzwurf Wahrscheinlichkeit eines Treffers leicht berechenbar Schwieriger in unserem Fall, wenn es um Sequenzen geht!!! Praktische Lösung des Problems: Ist die Gewichtung des tatsächlich beobachteten Alignments nicht größer als man es nach zufälliger Umstellung der Sequenz erwartet, hat man es wahrscheinlich mit einem Zufallsergebnis zu tun! Sequenz kann viele Male nach Zufallsprinzip verändert werden Danach Alignment durchführen, Scores sammeln und Ergebnis analysieren Wenn Zufallssequenzen gleichen Score ergeben, ist ursprüngliches Alignment nicht aussagekräftig Dr. Stephan Weise Folie # 36

37 BLAST Bit Score Score S der High Scoring Pairs (HSP) ist die Summe aller Einzelscores abzüglich der Strafen für Gaps Für Vergleich Normalisierung mit folgenden Parametern: l,k: Karlin-Altschul-Parameter (ergeben sich aus der verwendeten Scoringfunktion) Bit Score S : * S ln K S' l ln 2 S : Bit Score ermöglicht den Vergleich verschiedener Alignments S : unabhängig von der Datenbankgröße Dr. Stephan Weise Folie # 37

38 BLAST E-Value Erwartungswert E: Aussage über die statistische Signifikanz des Alignments Berechnung: m Länge der Suchsequenz n Summe der Länge aller Vergleichssequenzen S Bit Score E m* n s' 2 Kleiner E-Wert geringe Wahrscheinlichkeit, dass das Alignment zufällig entstanden ist E: abhängig von der Datenbankgröße Dr. Stephan Weise Folie # 38

39 FASTA-Format Format zur Repräsentation von Sequenzen Erste Zeile enthält Header-Information Beginnt mit > Gefolgt von einem Identifikator (kein Leerzeichen zwischen > und ID) Danach optional: Leerzeichen und Sequenzbeschreibung Die nächsten Zeilen enthalten die Sequenz (bis zum nächsten > oder dem Dateiende) Dr. Stephan Weise Folie # 39

40 FASTA-Format Dr. Stephan Weise Folie # 40

41 FASTA-Format Sequenzidentifikator [a-z,a-z,0-9,_] Keine Sonderzeichen (?, ; & % $! ) Identifikator darf nicht mit eine Zahl beginnen Dr. Stephan Weise Folie # 41