Spektroskopie. Verfahren verwendete Strahlung Übergang Bioch. Anwendungen. Absorptionsverfahren

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1 Spektroskopie Grundlagen Spektroskopische Verfahren gehören zu den wichtigsten analytischen Methoden der Biochemie. Sie sind empfindlich, benötigen also nur geringe Substanzmengen, und im allgemeinen recht selektiv. Nach ihrem Wirkungsprinzip teilt man sie in Absorptions- und Emissionsverfahren ein. Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über die in der Biochemie gebräuchlichsten spektroskopischen Methoden. Verfahren verwendete Strahlung Übergang Bioch. Anwendungen Absorptionsverfahren Röntgenspektroskopie UV/VIS-Spektroskopie ORD/CD Infrarot-Spektroskopie ESR NMR Röntgenstrahlung λ = nm UV/VIS λ = nm polarisiertes Licht λ = nm IR λ = nm Mikrowellen λ = 1 10 mm Radiowellen λ = m Emissionsverfahren Schwingungs- und Rotationsniveaus Konformationsanalyse chiraler Moleküle Qualitative und Konformationsanalyse Analyse freier Radikale Elektronenspin- Niveaus Kernspin-Niveaus Identifizierung von Metallionen, EXAFS Qualitative und quantitative Analyse Strukturaufklärung Fluoreszenz-Spektroskopie UV/VIS λ = nm Quitative und quantitative Analyse Chemolumineszenz emittierte Quanten durch chem. Rk. erzeugt Quantitative Analyse Im vorliegenden Versuch beschäftigen wir uns mit der UV/VIS-Absorptionsspektroskopie, der am häufigsten eingesetzten Absorptionsmethode, und der Fluoreszenzspektroskopie als wichtigstem Emissionsverfahren. Beide arbeiten bei Wellenlängen zwischen 180 und 750 nm, d. h. mit UV-Strahlung ( nm) oder mit sichtbarem Licht (VIS, nm). In beiden Fällen werden zunächst Lichtquanten von Molekülen absorbiert, wodurch Elektronen auf höhere Energieniveaus gebracht werden (Abb. 1). Die angeregten Elektronen kehren rasch wieder in den Grundzustand zurück, wobei die absorbierte Energie E wieder abgegeben wird. In den meisten Fällen geschieht dies "strahlungslos", d. h. die absorbierte Energie wird in andere Energieformen umgewandelt, z. B. in Schwingungen und Rotionen innerhalb des Moleküls (gestrichelte Linie). Bei mehrkernigen aromatischen Verbindungen sind intramolekulare Bewegungen erschwert. In diesen Fällen wird der grösste Teil der absorbierten Energie wieder in Form von Lichtquanten abgestrahlt (schwarzer Pfeil). Diese Erscheinung nennt man Fluoreszenz. Da das Fluoreszenzquant grundsätzlich vom untersten angeregten Niveau (S 1, v= 0) abgestrahlt wird, ist die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts grösser als die des Anregungslichts (Warum?). Deshalb kann man bei Fluoreszenzmesungen die gestreute Anregungsstrahlung blockieren, ohne die Fluoreszenz wesentlich zu beeinträchtigen (s. u.). Dies ist wichtig, weil sonst das gestreute Anregungslicht die relativ schwache Fluoreszenzstrahlung völlig überdecken würde.

2 v = 3 v = 2 v = 1 v = 0 Angeregter Zustand (S 1 Absorption E A Fluoreszenz E F < E A v = 3 v = 2 v = 1 v = 0 Grundzustand Abb. 1. Termschema zur Veranschaulichung von Absorption und Fluoreszenz Messprinzip Ein Photometer für Absorptionsmessungen (Abb. 2, links) besteht aus einer Lichtquelle (Deuteriumlampe für nm, Halogenlampe für nm), einem Filter oder Monochromator zur Erzeugung von monochromatischem Licht der Wellenlänge λ und einem Detektor zur Messung von Lichtintensitäten. Die zu vermessenden Lösungen werden in einer rechteckige Küvette aus Glas oder (bei Wellenlängen unter 340 nm) aus Quarz in den Strahlengang gebracht. Aus den gemessenen Intensitäten I 0 und I lässt sich dann die Absorption A berechnen (s.u.). Die Absorption ist eine vom Messgerät unabhängige Grösse. Die Fluoreszenz (Abb. 2, rechts) wird mit intensiver monochromatischer Strahlung der Wellenlänge λ 1 angeregt. Die emittierte Fluoreszenzstrahlung, die sich in alle Richtungen ausbreitet, wird bei der Wellenlänge λ 2 im rechten Winkel zum Anregungslicht gemessen. Die so bestimmte Intensität hängt von den Eigenschaften des Geräts ab (Stärke der Lampe, Geometrie des optischen Systems, Entfernung zwischen Küvette und Detektor usw.). Zur Kalibrierung sind deshalb Lösungen bekannter Konzentration erforderlich. Absorption Fluoreszenz Abb. 2 Messprinzip bei der Absorptions- (links) und Fluoreszenzspektroskopie (rechts)

3 Lambert-Beer'sches Gesetz Die Lichtabsorption hängt von mehreren Faktoren ab, z.b. von der Art und Konzentration der absorbierenden Substanz, von der Wellenlänge des verwendeten Lichts und von den Eigenschaften der Küvette. Diese Zusammenhänge werden durch das Lambert-Beer'sche Gesetz beschrieben A = ε λ c d Die Absorption A (früher: Extinktion) einer Lösung ist definiert als log T = -log (I / I 0 ), d.h. als negativer Logarithmus der Transmission I / I 0. Die Absorption, eine dimensionslose Grösse, ist proportional zur Konzentration c des aborbierenden Stoffes (in mol l -1 ) und zur Schichtdicke d (in cm). Die Proportionalitätskonstante ε λ, der sog. Absorptionskoeffizient (in l mol -1 cm-1), hängt von der Wellenlänge λ ab, nicht jedoch von der Konzentration des absorbierenden Stoffes oder den Eigenschaften des Photometers. Wie bereits erwähnt, müssen Fluoreszenzmessungen anhand von Standardlösungen kalibiert werden. Die gemessene Fluoreszenzintensität ist aber unter konstanten Messedingungen der Konzentration des fluoreszierenden Stoffes proportional. Versuch 1: Photometrische Titration von 2,4-Dinitrophenol 2,4-Dinitrophenol (DNP) ist relativ toxisch, weil es als Entkoppler wirkt. Es transportiert Protonen über die innere Mitochondrienmembran und beeinträchtigt so den Aufbau des Protonengradienten, der die mitochondriale ATP-Synthese antreibt. Dissoziiertes DNP wird aufgrund seines ungwöhnlich niedrigen pk a -Wertes (siehe "Labormethoden") im Intermembranraum protoniert, diffundiert dann durch die Membran und gibt die Protonen an die alkalischere Mitochondrienmatrix wieder ab (s. Versuch "Energiestoffwechsel" im Grundprtikum II). Im Versuch bestimmen wir den pk a -Wert von DNP anhand des Farbwechsels, der die Protonierung und Deprotonierung begleitet. Material DNP-Stammlösung 1 mm in 95% Ethanol 50 mm Citratpuffer ph 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, Durchführung Verdünnen Sie die DNP-Stammlösung im Verhältnis 1:20 mit den verschiedenen Puffern. Registrieren Sie Absorptionsspektren der Lösungen mit dem niedrigsten und höchsten ph-wert, um das Absorptionsmaximum zu ermitteln. Messen Sie dann bei dieser Wellenlänge die Absorption aller Verdünnungen gegen einen Puffer-Leerwert. Auswertung Tragen Sie die gemessenen Absorptionen gegen den ph-wert auf und schätzen Sie den ersten pk a -Wert von DNP ab. Wie kommt der ungewöhnliche Wert zustande (Phenol hat einen pk a - Wert von etwa 10)? Erklären Sie den Farbunterschied zwischen protonierter und dissoziierter Form mit Hilfe von Formelzeichnungen. Was können Sie aus Ihren Ergebnissen bezüglich der pk a -Werte von Intermembranraum und Mitochondrienmatrix schliessen? Wie könnte man den pk a -Wert dur nichtlineare Regression berechnen?

4 Versuch 2: Bestimmung der Schmelztemperatur von DNAs Nucleinsäuren zeigen wegen ihres Gehalts an aromatischen Nucleobasen starke UV-Absorption mit einem Maximum bei etwa 260 nm. Die Absorptionskoeffizienten der einzelnen Basen sind unterschiedlich. Für DNA gelten folgende Werte ε 260 (dg) = l mol -1 cm -1 ε 260 (dc) = l mol -1 cm -1 ε 260 (da) = l mol -1 cm -1 ε 260 (dt) = l mol -1 cm -1 Die UV-Absorption von DNA hängt also von ihrer Basenzusammensetzung ab. Auch zwischen einzelsträngiger(ssdna) und doppelsträngiger DNA (dsdna) bestehen deutliche Unterschiede. In dsdna stehen die Basen im hydrophoben Inneren der Doppelhelix in engem Kontakt miteinander, während sie in ssdna dem Wasser ausgesetzt sind. Dies führt zu einem im Vergleich zur ssdna erheblich niedrigeren Absorptionskoeffizienten von dsdna (hypochromer Effekt). Den hypochromen Effekt kann man sich zunutze machen, um die Denaturierung bzw. Renaturierung von DNA zu beobachten. Trennen sich die beiden Stränge von dsdna z.b. aufgrund hoher Temperaturen, nimmt die A 260 zu. Die Temperatur, bei der dies eintritt, wird als Schmelztemperatur (T m ) bezeichnet. Für DNAs unterschiedlicher Herkunft und damit unterschiedlicher Basenzusammensetzung sind auch die Schmelztemperaturen verschieden. Da G/C-Basenpaare durch drei, A/T-Paare aber nur durch zwei Wasserstoffbrücken stabilisiert werden, ist die T m von DNA umso höher, je höher ihr Anteil an G und C ist. Ausserdem spielt die Salzkonzentration im Medium eine wesentliche Rolle. Dafür gilt folgende Faustregel: T m = log ([NaCl]) (% G/C) ( in C) Im Versuch messen wir T m für verschiedene DNA-Arten durch Bestimmung der Temperaturabhängigkeit ihrer UV-Absorption. Material TE-Puffer (10 mm Tris HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0) DNA-Lösungen in TE-Puffer Paraffinöl Photometer mit thermostatisierbarem Küvettenhalter Digitalthermometer Durchführung Die DNA-Lösung wird mit TE-Puffer auf A verdünnt (Gesamtvolumen 5 ml) und im Vakuum entgast. 2.5 ml der Lösung werden in einer Quarzküvette mit 200 µl Mineralöl überschichtet. Registrieren Sie zunächst im Zweistrahlphotometer ein Absorptionsspektrum der Lösung ( nm). Überführen Sie die Küvette in das für den Versuch vorgesehene Einstrahlphotometer und temperieren Sie sie auf 40 C. Dann wird die Temperatur des Wärmebades langsam auf C erhöht ( T = 1-2 C/min). Die Temperatur mit einem Digitalthermometer laufend gemessen. Notieren Sie zunächst alle 5 C, im Schmelzbereich häufiger die A 260 bis keine Änderung mehr eintritt.

5 Auswertung Tragen Sie die A 260 gegen die Temperatur auf und ermitteln Sie so genau wie möglich die Schmelztemperatur T m. Berechnen Sie nach der o. g. Formel den G/C-Gehalt unter der Annahme, dass [NaCl] = 0.01 M. Ermitteln Sie aus Ihren Daten das Ausmass des hypochromen Effekts (in %). Welche Konzentration hatte die DNA in Ihrer Probe ungefähr? Versuch 3: Bindung von ANS an Serumalbumin Die bei gegebener Konzentration gemessene Fluoreszenzintensität und das Wellenlängenmaximum der Fluoreszenz-Emission hängen stark von der Polarität des Mediums ab. Darauf beruht z.b. die Färbung von DNA mit Ethidiumbromid (s. Versuche "PCR" und "Mutation"). Es gibt aber auch Anwendungen des Effekts in der Proteinanalytik (s. Versuch "Proteinfaltung" im Grundpraktikum II). In vorliegenden Versuch nutzen wir die Abhängigkeit der Fluoreszenz von Polaritätsänderungen um die Bindung des Fluoreszenzfarbstoffs 8-Anilinonaphthalinsulfonat (ANS, s. Formel) an Rinder-Serumalbumin (BSA) zu verfolgen. Zur Vorbereitung messen wir zunächst die Emissionsspektren von ANS in verschiedenen Lösungsmitteln zunehmender Hydrophobizität. Material 50 mm Na-Phosphatpuffer, ph 7.4 ANS 250 µm in Phosphatpuffer BSA etwa 50 µm in Phosphatpuffer Ethanol n-butanol n-octanol Spektralfluorimeter BioTek SFM-25 Fluoreszenzküvetten (Vorsicht! Sehr teuer!) Durchführung a) Bestimmung der BSA-Konzentration Registrieren Sie das UV-Spektrum einer 1:5 mit Puffer verdünnten BSA-Lösung im Bereich nm. Der Absorptionskoeffizient von BSA bei 280 nm ist l mol-1 cm-1 a) Lösungsmitteleffekte auf die ANS-Fluoreszenz Verdünnen Sie die bereitstehende ANS-Lösung im Verhältnis 1:20 mit Wasser, Ethanol, Butanol und Octanol und registrieren Sie jeweils ein Emissionsspektrum im Bereich 390 nm 600 nm (Anregungswellenlänge: 370 nm) c) Bindung von ANS an Serumalbumin Bereiten Sie folgende Ansätze in Kunststoff-Reagenzgläsern vor und mesen Sie nach 5 min die Fluoreszenzintensität bei 470 nm. Ansatz Nr BSA (5 µm) ml Puffer ml ANS (250 µm) ml

6 Auswertung a) Berechnen Sie die BSA-Konzentration der Stammlösung in mol l -1 und in µg ml (molekulare Masse von BSA = 68 kda). b) Tragen Sie die registrierten Spektren in einem Diagramm auf und ermitteln Sie für jedes Lösungsmittel das Emissionsmaximum (in nm) und die maximale Fluoreszenzintensität relativ zu Wasser. c) Tragen Sie die gemessene Fluoreszenzintensität gegen die ANS-Konzentration auf und schätzen Sie die Bindungskonstante K d ab. Näherungsweise entspricht sie der ANS-Konzentration bei halbmaximaler Fluoreszenz. Notizen