2 Biomoleküle. 2.1 Proteine. Enzymatische Katalyse. Transport- und Speicherfunktionen. Stütz- und Gerüstfunktionen

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1 2 Biomoleküle 2.1 Proteine Die Bezeichnung Protein wurde von Berzelius im Jahre 1836 von dem griechischen Wort proteios ( erstrangig ) abgeleitet und soll auf die Wichtigkeit dieser ubstanzklasse hinweisen. Die Proteine gehören neben den Nucleinsäuren, ligosacchariden und Lipiden zu den biologischen Bausteinen des Lebens. Die Proteine sind in ihrem Bauplan relativ einheitlich angeordnet und in allen rganismen enthalten, unabhängig davon, um welche Art, Gestalt oder Form von Lebewesen es sich handelt. Diese Biopolymere wirken entscheidend an der Entwicklung und teuerung der biologischen Lebensprozesse mit. Proteine sind hochmolekulare, überwiegend amorphe, optisch aktive Naturstoffe, die aus einzelnen Aminosäuren bestehen. Die Molekülmassen liegen zwischen ca. Zehntausend und einigen Millionen Dalton. Einige wichtige Funktionen der Proteine sind in den folgenden Punkten kurz zusammengestellt. Weitere Informationen sind den Lehrbüchern der Biochemie zu entnehmen. Enzymatische Katalyse Proteine sind meist biologisch aktiv und wirken in (bio)chemischen Prozessen als Katalysatoren. Derart spezifische Biokatalysatoren werden als Enzyme bezeichnet. In Anwesenheit eines Enzyms wird die Aktivierungsenergie der enzymatischen Reaktion erniedrigt und die Reaktionsgeschwindigkeit wird um ein Vielfaches (z.t. millionenfach) erhöht. Transport- und peicherfunktionen Proteine fungieren in den rganismen als Transportmittel. Zu den bekanntesten Phänomenen gehören der Transport von auerstoff in den Erythrocyten durch ämoglobin und der Transport von Eisen im Blut durch Transferrin. Das Protein Ferritin besitzt eine peicherfunktion und bindet Eisen als Komplex in der Leber. tütz- und Gerüstfunktionen Faserproteine üben in den Knochen und Geweben tützfunktionen aus. Wichtigster Vertreter ist das Kollagen, das auch in ehnen, Knorpeln oder in den Zähnen vorkommt. harakteristisch sind seine Zugfestigkeit, mechanische tabilität und die Unlöslichkeit seiner Faserstruktur. M.. Gey, Instrumentelle Analytik und Bioanalytik, DI / _2, pringer-verlag Berlin eidelberg 2015

2 10 2 Biomoleküle Immunabwehr ochspezifische Proteine, die als Antikörper bezeichnet werden, erkennen und binden in den rganismen Fremdsubstanzen, die sogenannten Antigene. Diese können ebenfalls Proteine, aber auch Viren oder Krebszellen sein, die durch die Immunabwehr der Antikörper unschädlich gemacht werden Aminosäurestrukturen Aminosäuren sind die Ausgangssubstanzen für die Proteinsynthese, dienen als Nährstoffe und sind am Energiestoffwechsel beteiligt. Die Proteine setzen sich aus 20 verschiedenen -Aminosäuren zusammen. Ihre Eigenschaften und insbesondere der amphotere harakter werden durch die basische Aminogruppe ( 3 + ) und die saure arboxylgruppe ( - ) geprägt. Abb. 2.1 truktur einer neutralen Aminosäure. R = eitenkette Weiterhin sind ein Wasserstoffatom () und eine eitenkette R um das Kohlenstoffatom der Aminosäure gruppiert. Ist in der Kette R eine weitere Aminogruppe angeordnet, handelt es sich um eine basische Aminosäure. aure Aminosäuren enthalten dagegen eine weitere arboxylgruppe in der eitenkette. Wie aus den folgenden rukturabbildungen hervorgeht, dienen für die Aminosäuren die ersten drei Buchstaben ihres Namens als Abkürzung. Ausnahmen bilden Asparagin (Asn), Glutamin (Gln), Isoleucin (Ile) und Tryptophan (Trp). ie können auch mit einem in der prache der Biochemiker üblichen ymbol gekennzeichnet werden. Abb. 2.2 Basische Aminosäuren

3 2.1 Proteine 11 Abb. 2.3 aure Aminosäuren Im Fall der neutralen Aminosäuren tragen die funktionellen Gruppen der Kette kaum oder gar nicht zur Dissoziation bei N N N N N Glycin Alanin Valin Isoleucin Leucin (Gly, G) (Ala, A) (Val, V) (Ile, I) (Leu, L) Abb. 2.4 Aliphatische Aminosäuren Aromatische Aminosäuren enthalten chromophore Gruppen, die ihren Extinktionskoeffizienten und den des Gesamtproteins deutlich erhöhen. Abb. 2.5 Aromatische Aminosäuren

4 12 2 Biomoleküle Diese Proteine werden deshalb im mittleren UV-Bereich oder durch Fluoreszenz mit erhöhter Empfindlichkeit detektiert. Aminosäuren mit schwefelhaltigen eitenketten können zwischen einzelnen Proteinbereichen sulfidische Bindungen ausbilden. harakteristisch für erin und Threonin ist die ydroxylgruppe in der aliphatischen eitenkette. Das Prolin gehört auf Grund seiner Iminogruppe zu den sekundären Aminosäuren N N erin Threonin (er, ) (Thr, T) Abb. 2.6 Aminosäuren mit schwefelhaltigen eitenketten Abb. 2.7 Aminosäuren bestehend aus aliphatischer eitenkette mit ydroxylgruppe Abb. 2.8 ekundäre Aminosäure Zwitterionenform und p-abhängigkeit In Abhängigkeit vom p-wert liegen die Aminosäuren in nicht ionisierter oder in ionisieter Form vor. Im neutralen p-bereich (p = 7) sind beide funktionellen Gruppen ionisiert und die Aminosäuren treten als Zwitterionen auf. Die Gruppe ist protoniert und die - -Gruppe liegt im dissoziiertem Zustand vor. Durch Zufuhr von Wasserstoffionen wird die Dissoziation der arboxylgruppe im sauren Milieu reduziert und die Aminosäure geht im stark sauren Bereich in ihre nichtionisierte Form über, während die Aminogruppe weiterhin protoniert ist. In stark basischen Lösungen tritt der entgegengesetzte Effekt ein. Die arboxylgruppe ist ionisiert und die Aminogruppe liegt in neutraler Form vor. Abb. 2.9 Ladungszustand einer Aminosäure in Abhängigkeit vom p-wert

5 2.1 Proteine 13 Die unterschiedlichen Ionisierungsformen von Aminosäuren in Abhängigkeit vom p-wert können sowohl für die Aminosäuren als auch für die Proteine zur selektiven chromatographischen und elektrophoretischen Trennung ausgenutzt werden pk-werte und isoelektrischer Punkt Die Amino- und arboxylgruppe einer Aminosäure können Protonen aufnehmen oder abgeben. Beide fungieren als äuren () und können entsprechend der Gleichung 2.1 dissoziieren. (2.1) etzt man die entsprechenden Konzentrationen in das Massenwirkungsgesetz ein, erhält man den Ausdruck für die Dissoziationskonstante K. K Nach dem Logarithmieren dieser Formel resultiert der folgende Ausdruck: (2.2) lg lg K lg (2.3) Da der p-wert der negative dekadische Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration ist (Gleichung 2.4), wird der pk-wert als negativer Logarithmus der Dissoziationskonstante definiert (2.5). p lg (2.4) pk lgk (2.5) Durch Einsetzen von Gleichungen 2.4 und 2.5 in 2.3 resultiert folgender Ausdruck: p pk lg (2.6) Dieser besagt, dass der p-wert gleich dem pk-wert (der Aminosäure) ist, wenn die äure genau zur älfte dissoziiert ist. Der isoelektrische Punkt (pi oder IEP, P I ) eines Proteins ist derjenige p-wert, bei dem seine Nettoladung Null beträgt.

6 14 2 Biomoleküle D- und L-Konfiguration Die proteinogenen Aminosäuren treten nur in der L-Form auf. Die Abbildung 2.10 zeigt, dass auf Grund der tetraedrischen Anordnung der Gruppen ( + 3 -, - -, + -Gruppe und eitenkette R) um das Kohlenstoffatom (--Atom) zwei spiegelbildlich gegenüberstehende Formen entstehen, die als L- und D-Isomer bezeichnet werden. Diese trukturen verleihen den Aminosäuren ihre optische Aktivität. Durch die Entwicklung chiraler stationärer Phasen und mobiler elektoren können strukturell so geringfügig unterschiedliche isomere Verbindungen chromatographisch getrennt und quantifiziert werden. - R R L- Isomer + 3 D- Isomer Abb Konfiguration des D- und L-Isomeren einer Aminosäure Proteinstrukturen Peptidbindung In Proteinen sind die einzelnen Aminosäuren durch Peptidbindungen miteinander verknüpft. Die -arboxylgruppe der Aminosäure 1 reagiert mit der -Aminogruppe der Aminosäure 2 unter Austritt von Wasser. Beide Aminosäuren bilden ein Dipeptid, drei oder fünf Aminosäuren entsprechend ein Tri- oder Pentapeptid. Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt auf der eite der ydrolyse. Für die ynthese einer Peptidbindung ist deshalb ein hoher Energieaufwand notwendig, während ihre paltung freiwillig abläuft. + 3 N R N R N N - R 1 R 2 Peptidbindung 2 Abb Entstehung der Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren

7 2.1 Proteine ulfidbindung Einige Proteine enthalten ulfidbindungen bzw. ulfidbrücken. Diese entstehen aus den ulfhydrylgruppen (--) der schwefelhaltigen Aminosäure ystein durch xidation. Das resultierende Disulfid wird als ystin bezeichnet. Insbesondere extrazelluläre Proteine besitzen diese sulfidischen Querverbindungen. Abb Entstehung der Disulfidbindung Aminosäuresequenz Die Aminosäuresequenz ist die Aufeinanderfolge der einzelnen Aminosäuren in einem Protein. ie enthalten nur L-Aminosäuren, die kovalent über Peptidbindungen verknüpft sind. Die Aminosäuresequenz von Rinderinsulin (. anger 1953) ist in der folgenden Abbildung dargestellt. Das Protein besteht aus einer A- und B-Kette, die über Disulfidbindungen verbunden sind. A-Kette R 1 ys ys Ala er Val ys R 2 ys Asn R 3 ys Gly er is R 4 ys R 5 B-Kette R 1 : Gly Ile Val Glu Gln R 2 : er Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr R 3 : Phe Val Asn Gln is Leu R 4 : Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val R 5 : Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Abb Aminosäuresequenz von Rinderinsulin

8 16 2 Biomoleküle N PIT 2 N Gly Asp Phe Arg Gly Peptid - p > 8 Gly Asp Phe Arg Gly PT-Peptid - Abb Kopplung mit PIT Die equenzierung eines Proteins oder Peptides kann nach dem von Pehr Edman (1950) entwickelten Aminosäureabbau (Edman-Abbau) erfolgen. Dabei reagiert Phenylisothiocyanat (PIT) unter milden basischen Bedingungen mit der N- terminalen Aminogruppe des Proteins bei Temperaturen um 50 unter Bildung des Phenylthiocarbamoyl (PT)-Adduktes. Die Zeit beträgt ca. 30 min. Ein Beschleunigung der Reaktion kann durch Erhöhung des p-wertes auf 9 erfolgen. Damit ist jedoch die verstärkte Bildung des Nebenproduktes Diphenylthioharnstoff (DPTU) verbunden, der die PL-Analyse von PT-Aminosäuren beeinträchtigen kann (Abbildung 2.15). Das PT-Addukt wird in einer Inertgasatmosphäre unter Feuchtigkeitsausschluss mit Trifluoressigsäure versetzt. Dadurch erfolgt der nucleophile Angriff des chwefels an der arbonylgruppe der ersten Peptidbindung, der zur Abspaltung einer Aminosäure als heterocyclisches Anilinothiazolinon-(ATZ-)Derivat führt. Die reduzierte hydrophobe AT-Aminosäure wird vom hydrophilen Restprotein durch Extraktion mit einem entsprechend hydrophoben Lösungsmittel (Ethylacetat) abgetrennt. Durch inzufügen wässriger äure wird der heterocyclische Ring der AT-Aminosäure geöffnet. Diese wird bei erhöhter Temperatur in die stabilere Phenylthiohydantoin (PT)-Aminosäure umgelagert. Das bezeichnet man als Konvertierung. N PIT 2-2 Anilin N 2 DPTU Abb Nebenproduktbildung

9 2.1 Proteine 17 Gly Asp Phe Arg Gly PT-Peptid - + N + 3 N + Gly Asp Phe Arg Gly - ATZ-Aminosäure Peptid minus Aminosäure Abb Abspaltung der ersten Aminosäure Die Analyse der PT-Aminosäuren erfolgt mittels ochleistungsflüssigchromatographie an Reversed-Phase-äulen. + 2 N 2 ATZ-Aminosäure + N PT-Aminosäure 2 Abb Konvertierung Das Restprotein wird danach erneut dem Edman-Abbau unterzogen, um die nächste Aminosäure abzuspalten und sie als PT-Derivat zu analysieren. Dieser sich ständig wiederholende Vorgang ist vereinfacht in Abbildung 2.18 dargestellt. Mit kommerziellen equenzautomaten beträgt die Zeit für den Edman-Abbau einer Polypeptidkette etwa zwei tunden. Die größte Bedeutung hat jedoch die DNA-Rekombinationstechnik, mit der die Aminosäuresequenz eines Proteins an and der equenzanalyse der DNA-Basen Adenin, Thymin, Guanin und ytosin ermittelt wird.

10 18 2 Biomoleküle Koppeln Ala Gly Asp Phe Arg Gly PIT Ala Gly Asp Phe Arg Gly palten + Konvertieren PT Ala Gly Asp Phe Arg Gly Koppeln PIT Gly Asp Phe Arg Gly palten + Kovertieren PT Gly Asp Phe Arg Gly Abb Verlauf des Edman-Abbaus Primär-, ekundär-, Tertiär- und Quarternärstruktur Die enzymatische Aktivität und die biologischen Eigenschaften eines Proteins hängen entscheidend von seiner räumlichen und strukturellen Anordnung ab. Als Primärstruktur eines Proteins wird die Aminosäuresequenz, d.h., die Aneinanderreihung einzelner Aminosäuren in seiner Polypeptidkette(n) bezeichnet. Die ekundärstruktur ist eine räumliche Anordnung der Polypeptidkette. ie beschreibt die relative Anordnung ihrer monomeren Bausteine und wird neben der Primärstruktur auch durch Wasserstoffbrücken zwischen den einzelnen Elementen bestimmt. harakteristische trukturelemente sind u.a. elices und Faltblätter (vgl. Abbildung 2.21 und 2.22). Die Tertiärstruktur ist die vollständige dreidimensionale Ausdehnung der gesamten Polypeptid- bzw. Proteins-Kette. Bei globulären Proteinen befinden sich die hydrophoben trukturteile im Inneren des Proteine, während die hydrophilen und/oder geladenen Bereiche dem wässrigen Milieu zugewandt sind. Zur tabilisierung von Tertiärstrukturen dienen Disulfidbrücken (besonders starke Bindungen), Ionenbindungen sowie relativ schwache Bindungen wie Wasserstoffbrücken oder hydrophobe Wechselwirkungen. Die Quarternärstruktur tritt bei Proteinen mit zwei und mehr Polypeptidketten auf und beschreibt die räumliche Anordnung der Untereinheiten, die durch Disulfidbindungen verknüpft sind. Die knäuelartige truktur wird weiterhin durch nichtkovalente Wechselwirkungen wie Wasserstoffbrückenbindungen und/oder elektrostatische Interaktionen hervorgerufen elix und ß-Faltblatt Die Ausbildung der Polypeptidstruktur von -elix und ß-Faltblatt hängt eng mit den beschriebenen rganisationsebenen der Proteinstrukturen zusammen. Grundlegende Ursachen sind vor allem strukturelle Besonderheiten der Peptidbindung.

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