3.2.4 Sandwich-Immunoassay Ein weiteres verwendetes Format war der Sandwich-Immunoassay (Abbildung 21).

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1 3.2.4 Sandwich-Immunoassay Ein weiteres verwendetes Format war der Sandwich-Immunoassay (Abbildung 21). Abbildung 21: Funktionsprinzip des Sandwich-Immunoassays. Abbildung 22: Schematische Darstellung einer Messung mit niedriger Analytkonzentration (1) und hoher Analytkonzentration (2), die in unterschiedlichen Signalen in der Kalibrierkurve resultieren. Hierbei wird auf der Sensoroberfläche ein Antikörper, der den Analyten spezifisch erkennt, immobilisiert. Die Probe, die den Analyten enthält, wird über die Sensoroberfläche geleitet. Der Analyt kann nun an den Antikörper auf der Sensoroberfläche binden. In einem zweiten Inkubationsschritt wird ein markierter Antikörper, der ebenfalls den Analyten spezifisch erkennt über den Sensor geleitet. Hierbei kann er mit dem bereits gebundenen Analyten wechselwirken. Die angebundenen Antikörper werden über die Fluorophore oberflächennah detektiert. Anschließend wird die Sensoroberfläche rege- 49

2 neriert und kann sofort für eine weitere Messung verwendet werden. Das entstandene Fluoreszenzsignal ist direkt proportional zur Konzentration an Antigen in der Probe Messungen mit dem TIRF-Sensor und Datenauswertung Als TIRF-Sensor wurde der River-Analyser verwendet. Das Gerät wurde im Rahmen des von der EU geförderten Projektes RIANA entwickelt. Abbildung 23: Schematischer Aufbau des direkt optischen Biosensors RIANA (River Analyser). Der Aufbau besteht hauptsächlich aus einer Laserdiode (A), einem Transducer, einer Flusszelle (B), einem FIA-System, das mit einem Autosampler kombiniert wird, Polymerfaser (C), Filtern (D), Photodioden (PD), einem Lock-In Verstärker und einem PC. Der schematische Aufbau des Gerätes ist in Abb. 23 dargestellt. Er besteht hauptsächlich aus einer Laserdiode (A) (15 mw, 635±2 nm, Coherent Deutschland GmbH), einem Glastransducer, einer Flusszelle (B), einem FIA- System, das mit einem Autosampler kombiniert wird [HTS PAL Autosampler + Cycle Composer Software (CTC Analyzics AG)], Polymerfasern (C), Filtern 50

3 (D) (680AELP, 0503, Omega Optical Inc.), Photodioden (PD), einem Lock-In Verstärker und einem PC. Ausführlichere Informationen zum Aufbau des Gerätes finden sich in der Literatur [Klotz et al. (1998), Barzen et al. (2002), Reder et al. (2004)]. Bei den im Rahmen der Arbeit verwendeten Messroutinen wurde jeweils mit einem Probenvolumen von 1 ml (kompetitiver Immunoassay) bzw. 0,5 ml (Sandwich-Immunoassay) gearbeitet. Für die Kalibrierung eines Transducers wurde die folgende Routine verwendet: 900 µl einer Probe, die mit einer definierten Menge an Analyt versetzt war, wurde mit 100 µl einer Antikörperstammlösung gemischt. Die Stammlösung enthielt neben dem Antikörper in der Regel Ovalbumin (OVA) und wurde in 10fach Puffer (PBS) angefertigt. Nach einer festgelegten Inkubationszeit wurde die Mischung aus Probe und Stammlösung über die Sensoroberfläche gepumpt. Anschließend wurde das Fluoreszenzsignal gemessen. Abbildung 24 zeigt eine Aufnahme der Rohdaten, die bei einer Messung entstehen. Abbildung 24: Rohdaten einer Messung mit dem TIRF-Sensor. Zunächst wird eine Baseline aufgenommen. Während dieser Zeit wird das Messsystem mit Puffer gespült. Anschließend wird der Laser ausgeschaltet 51

4 und die Probe (Probe/Antikörperstammlösung) über die Sensoroberfläche geleitet. Der Laser ist hierbei ausgeschaltet, um ein vorzeitiges Ausbleichen der Fluorophore zu vermeiden. Anschließend wird die Sensoroberfläche mit Puffer gespült und der Laser wird zur Detektion der gebundenen Fluorophore wieder angeschaltet. Es folgt die Regeneration der Sensoroberfläche. Für Kalibrierungen eines Sandwich-Immunoassays wurde ebenfalls eine Antikörperstammlösung in PBS angefertigt. Für eine Messroutine wurden die verschiedenen Konzentrationsstufen an Analyt vorbereitet. Beim Messdurchlauf wurde die Sensoroberfläche zunächst mit 500 µl der Probe und anschließend mit 500 µl der Antikörperstammlösung inkubiert. Anschließend wurde das Fluoreszenzsignal gemessen. Für eine Kalibrierung wurden 12 unabhängige Blank-Messungen gemacht und bis zu acht verschiedene Konzentrationsstufen des Analyten gemessen. Jede Konzentrationsstufe wurde hierbei bis zu sechsmal gemessen. Für alle Konzentrationen wurde die Standardabweichung (SD) berechnet. Bei der Kalibrierung des kompetitiven Immunoassays wurden die gemessenen Signale für die Blanks auf 100 % gesetzt, und für alle Konzentrationen wurden entsprechende relative Signale berechnet. Für den Sandwich- Immunoassay wurden die gemessenen Werte nicht auf die Blanks bezogen. Beim Auftragen der jeweiligen Werte (relative Signale/ Messwerte) gegen die Konzentration an Analyt ergibt sich bei einer logarithmischen Skalierung der Abszisse ein sigmoidaler Kurvenverlauf. Zur Kurvenanpassung wurde eine Logistikfunktion verwendet (Gleichung 16) [Dudley et al (1985)]. A1 A2 y = + A p x 1 + x (Gleichung 16) A 1 ist hierbei die obere Asymptote, A 2 die untere Asymptote. Der Bereich zwischen A 1 und A 2 wird als dynamischer Signalbereich bezeichnet. Der Wendepunkt der Kalibrierkurve wird durch die Variable x 0 beschrieben und repräsentiert die Konzentration an Analyt, bei der der dynamische Signalbereich bei 50 % liegt (IC 50 ). Die Steigung in diesem Punk wird durch den Parameter p gegeben. Der Arbeitsbereich der Kalibrierkurve liegt zwischen 10 und 90 % des dynamischen Signalbereiches. Eine weitere Möglichkeit den Arbeitsbereich zu bestimmen, wäre die Verwendung des Präzisionsprofils und der Horwitzkurve [Horwitz et al. (1980), Meyer (2003)]. Diese Methode wurde bei der vorliegenden Arbeit nicht verwendet.

5 Die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOQ) wurden entsprechend den IUPAC Regeln berechnet [Orange Book]. Hierbei wird für den LOD die SD dreimal vom Blankwert abgezogen und für den LOQ zehnmal Messungen mit dem RIfS-Sensor und Datenauswertung Von einer Halogenlampe erzeugtes Weißlicht wird über eine Faseroptik senkrecht auf den Transducer geführt. Das reflektierte Licht wird über denselben Lichtleiter mittels eines Y-Kopplers zum Diodenzeilenspektrometer geführt und von diesem detektiert. Als Matching-Flüssigkeit dient Glycerin (Abbildung 25). Die Messungen wurden im Durchfluss durchgeführt. Zur Probenhandhabung diente ein Fließinjektionsanalyse-System (FIA) der Firma Ismatec, bestehend aus einer variablen und einer konstanten Peristaltikpumpe, einem Scherventil und einem Auswahlventil. Die FIA-Fluidikanlage und das Spektrometer (Zeiss MCS-210) wurden mit dem Programm Measure von Kraus angesteuert [Kraus (1993)]. Abbildung 25: Schematische Darstellung des RIfS Aufbaus Eine detaillierte Beschreibung des RIfS-Aufbaus kann bei Schmitt et al [Schmitt et al. (1997)] gefunden werden. Die Auswertung der RIfS-Messungen erfolgte für die verschiedenen Testreihen rein qualitativ. Die verschiedenen Messungen wurden hierfür lediglich über den Verlauf und die Höhe der Bindung ausgewertet und verglichen. Für die Bestimmung von Affinitätskonstanten wurde eine Affinitätstitration vorgenommen. Hierbei wurde der Transducer mit einem Derivat des Analyten 53