Nachweis und Verhalten von Antibiotikaresistenzen im Abwasser und in Behandlungsanlagen

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1 Nachweis und Verhalten von Antibiotikaresistenzen im Abwasser und in Behandlungsanlagen Dr. Helmut Bürgmann «Keime, Antibiotikaresistenz und Desinfektion in Wassersystemen» - Basel.Area Swiss 7. «Wassertechnologie» Veranstaltung, Basel Eawag: Das Wasserforschungs-Institut des ETH-Bereichs

2 Konventionelle Kläranlagen als Resistenz Hot Spots Verbreitungswege von Resistenzgenen Konsum, Kontakt Tierhaltung Aquakultur Bevölkerung Spitäler Pharma- Industrie Selektionsdruck: Mutationen die Resistenz vermitteln Gülleapplikation Klärwerke Trinkwasser Bewässerung Gewässer Boden Sickerung und Erosion Aquifer Lagasse, E., Cancer stem cells with genetic instability: the best vehicle with the best engine for cancer. Gene Ther 2007, 15, (2), Figure modifiied from Kim and Aga, 2007 J. Toxicol. Environ. Health, Pt. B Crit. Rev. vol. 10, and Baran et al., Hazard. Mater. Vol

3 Konventionelle Kläranlagen als Resistenz Hot Spots Verbreitungswege von Resistenzgenen Konsum, Kontakt Tierhaltung Aquakultur Bevölkerung Spitäler Pharma- Industrie Selektionsdruck Mutationen die Resistenz vermitteln Fuller & Braverman, National Science Foundation Gülleapplikation Klärwerke Trinkwasser = Horizontaler Gentransfer Boden Bewässerung Sickerung und Erosion Gewässer Aquifer Kreuzselektion durch andere Verunreinigungen, z.b. Schwermetalle, Biozide Kläranlagen: hohe Zelldichten, Schadstoffe gute Bedingungen für Selektion, HGT, Resistenzen

4 Untersuchungen an Schweizer ARAs Romont Sévery ProRheno AG Basel Niederdorf Messen Erlach Colombier Birs Hochdorf Kernenried Hornussen Neugut Wädenswil Buttisholz Uerikon Herisau Rothenthurm Bühler Dürnten Davos Brusio Capacity < Treatment C C P C P NH4+ C P NH4+ F C P NH4+ N2 C P NH4+ N2 F C P NH4+ N2 F ++ Catchment Pharma-Industrie Beprobung Vorfluter Krankenhäuser Ozonung / UF 3

5 Untersuchungen an Schweizer ARAs ARA eliminieren Bakterien und resistente Keime CFU [ml -1 ] 1e+8 1e+7 1e+6 1e+5 1e+4 1e+3 1e+2 1e+1 1e+0 Gesamt LKZ S/T/T resistent 1e+8 Bühler 1e+7 Brusio 1e+6 Basel Ind. CFU [ml -1 ] Uerikon 1e+5 1e+4 1e+3 1e+2 1e+1 1e+0 Bühler Brusio Basel Ind. N/C resistent 1e+8 1e+7 1e+6 1e+5 1e-1 1e-1 1e Zulauf Ablauf Zulauf Ablauf Zulauf 1 Ablauf 2 o Reduktion von (multi)resistenten Bakterien um 90-99% CFU [ml -1 ] 1e+4 1e+3 1e+2 1e+1 1e+0 Buttisholz Brusio Brusio Czekalski et al. 2012; Czekalski, unpublished data

6 Untersuchungen an Schweizer ARAs Identifikation von resistenten Bakterien im Ablauf: Norfolxycin/Ceftazidim (N/C): Sulfonamid/Trimethoprim/Tetrazyklin (S/T/T): Microbacterium Acetobacter Harmlose Kommensalen Chryseobacterium Stenotrophomonas opportunistisch pathogen Afipia (Link Klinik-Trinkwasser?) Escherichia/Shigella Enterococcus Fäkalkeime ARA-Abläufe entlassen multiresistente Bakterien mit transferierbaren Resistenzgenen in die Umwelt Einige dieser Arten sind in der Umwelt überlebensfähig

7 Auswirkungen auf die Gewässer Einleitung von Abwasser erhöht die Resistenzhäufigkeit in Fliessgewässern sul1 tet(w) o Mischung erklärt Abundanz der Resistenzgene flussabwärts nicht ausreichend

8 Auswirkungen auf die Gewässer Einleitung von Abwasser erhöht die Resistenzhäufigkeit in Fliessgewässern 1e+0 1e-1 sul1,tet(w) / 16S Genkopien 1e-2 1e-3 1e-4 1e-5 1e-6 1e-7 1e-8 sul1 tet(w) 1e WTP in WTP out upstream downstream o Mischung erklärt Abundanz der Resistenzgene flussabwärts nicht ausreichend: Relative Abundanz steigt ebenfalls: Selektion auch im Vorfluter?

9 Auswirkungen auf die Gewässer Belastung des Sediments im Genfersee Sufonamidresistenz (abs) Quecksilber (Hg) Sufonamidresistenz (rel) Czekalski et al. 2014, ISME J o Abwassereinleitung erhöht die Häufigkeit von Resistenzen im Vorfluter

10 Zusammenfassung: Antibiotika - Resistenzen in Schweizer ARAs und Oberflächengewässern o Elimination von Bakterien / Resistenzen in konventionellen ARA > 90% o Resistenzlast in geklärtem Abwasser dennoch deutlich über natürlichem Hintergrund o Multiresistente Bakterien: harmlose Kommensalen aber auch potentielle Krankheiterreger sind Resistenzträger o Abwasser erhöht die Häufigkeit von Resistenzen im Vorfluter in Wasser und Sediment Was bringen die neuen Technologien zur Mikroschadstoffelimination?

11 Zusätzliche Reinigungsstufen «Strategie MicroPoll» I Ozonung II Pulveraktivkohlel (PAK) Verfahrenstechnik zur Entfernung von Mikroverunreinigungen 11

12 Desinfektion und Resistenzelimination mit Ozon Zerstörung der DNA Zerstörung der Zellwand O 3 O 3 Einzelstrangbrüche Schädigung der Basen (Mutationen) Doppelstrangbruch Austritt von freier DNA aus der Zelle 12

13 Zusätzliche Reinigungsstufen: Ozonung Arbeitshypothesen: o Ozonung eliminiert verbleibende (multiresistente) Bakterien aus gereinigtem Abwasser und zerstört die DNA (mit den Resistenzgenen) o Während der biologischen Nachbehandlung kommt es zu einer erneuten Besiedelung mit Bakterien, aber mit reduzierter Resistenz VKB CFU/mL NKB Prozess und Kinetik? (Modellsystem) O 3 -Reaktor (QT) Sandfilter (SF) Ablauf ARA Czekalski et al. 2016, ES&T 13

14 Ozonungsexperimente: O 3 O 3 O 3 Dosisabhängig: Batchversuche, Kontaktzeit = E. coli + Puffer (kein DOC) mgo 3 L -1 E. coli + steriler Abfluss Nachklärbecken (SE) go 3 g DOC -1 Abfluss NK (Bakterien, Flocken) go 3 g DOC -1 Kinetik: Quench-flow 0.2 mgo 3 L go 3 g DOC go 3 g DOC s 0-2 s 0-2 s Ozonexposition: CCCC = OO 3 δδδδ WWTP 14

15 Quantification of ozone-induced damage in bacteria 1. Viability (Culturability) O 3 O3 4. Intracellular Gene disruption (quantitative PCR) Red Fluorescence intact sul1 16S rrna Green Fluorescence [go 3 g -1 DOC] Viability (Membrane integrity (ICC)) 3. DNA damage (Total cell counts TCC) 15

16 E. coli in sterilisiertem geklärtem Abwasser DOC = 4.27 mg L -1 Dosisabhängig contact time = WWTP O 3 Log(N/N 0 ) Kultivierbarkeit Membranintegrität DNA-Stabilität (TCC) 16S rrna (qpcr) sul1 (qpcr) [mg O 3 L -1 ] N 0 = Zellen ml -1 [g O 3 g DOC -1 ] sul1 16S rrna 16

17 E. coli in sterilisiertem Abwasser (Nachklärung) 2.2 mgo 3 L -1 / 0.45 go 3 g DOC -1 Kinetik Log(N/N 0 ) ICC sul1 16S rrna? Viability (Culturability) Viability (Membrane Integrity ICC) sul1 (qpcr) 16S rrna (qpcr) DNA stability (TCC) CT [mg s L -1 ] CT lag k Ozone exposure [mg s L -1 ] for inactivation of [mg s L -1 ] [L mg -1 s -1 ] 2-log 4-log Culturability n.d. 32 (±2.1) Membrane integrity 0.22 (± 0.08) 12 (±1.6) sul (±0.49) 2 (±0.4) S 1.43 (±1.05) 1 (±0.6)

18 Natürliche Abwasserbakterien (Nachklärung) DOC = 5.0 mg L -1 O Presence 10 µm filtered, of flocs, contact time time = = 0-1 contact time = Log(N) Log (N/N 0 ) [g O [mg O 3 L -1 3 g DOC -1 ] ] 2 1 Kultivierbarkeit Sulfamethoxazol/Trimetoprim/Tetracyclin Norfloxacin/Ceftatzidim [g O [mg O 3 L -1 3 g DOC -1 ] ] Membranintegrität DNA Stabilität (TCC) 16S rrna (qpcr), N 0 = sul1 (qpcr), N 0 = Nadine Czekalski 18

19 Ozonung WWTP Neugut 0.55 go 3 g DOC -1, mins, n=3 1.E+8 1.E+6 Total S/T/T N/C OR 1 CFU [ml -1 ] 1.E+4 1.E+2 S E OR 2 S F 1.E+0 SE OR1 OR2 SF 1.E+8 TCC ICC 1.E+8 16S_457 bp sul1_827 bp events [ml -1 ] 1.E+7 1.E+6 1.E+5 gene copies [ml -1 ] 1.E+6 1.E+4 1.E+2 1.E+4 SE OR1 OR2 SF 1.E+0 SE OR1 OR2 SF 19

20 Zusammenfassung: Wirkung der Ozonung auf Antibiotikaresistenz im Abwasser o Elimination der Antibiotika (Spurenschadstoffe) leistet einen positiven Beitrag o Ozonung wie in der untersuchten Anlage zur Spurenstoffelimination angewandt: o Tötet resistente Keime weitgehend ab o Eliminiert die DNA / Resistenzgene nicht o Erlaubt überleben einiger Keime in Partikeln / Flocken o Ermittelte kinetische Parameter bieten Möglichkeit zur gezielten Verbesserung der Entkeimung und DNA-Inaktivierung o Wiederaufwuchs von resistenten Bakterien in der biologischen Nachbehandlung o Verbesserungen sollten erforscht und entwickelt werden 20

21 Danke!! Literatur: Nadine Czekalski Urs v. Gunten Karin Beck Karolin Schweichler Marjan Veljkovic José Santos S. Imminger F. Hammes E. Salhi H.R. Sigrist J. Fleiner C. McArdell H. Singer C. Stamm ARAs (Neugut) 21