Aufnahme, Abbau und Bindung von ApoE(3/3)- versus ApoE(4/4)-Liposomen in hippokampalen Zellen

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1 Aus dem Institut für Molekulare Zellbiologie des Zentrums für Experimentelle Medizin des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf Universität Hamburg Direktorin: Prof. Dr. rer. physiol. Dr. h.c. Ulrike Beisiegel Aufnahme, Abbau und Bindung von ApoE(3/3)- versus ApoE(4/4)-Liposomen in hippokampalen Zellen Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von Kathrin Röder aus Hamburg Hamburg 2004

2 Angenommen vom Fachbereich Medizin der Universität Hamburg am Veröffentlicht mit Genehmigung des Fachbereichs Medizin der Universität Hamburg. Prüfungsausschuss, die Vorsitzende: Prüfungsausschuss, 2. Gutachter: Prüfungsausschuss, 3. Gutachter: Prof. Dr. U. Beisiegel Prof. Dr. U. Seedorf PD Dr. W. Hampe

3 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Aufbau des zentralen Nervensystems Grundstrukturen des ZNS Neuronale Zellen Glia-Zellen Aufbau des Hippokampus Lipoproteinstoffwechsel im Plasma Metabolismus der exogenen Lipide Metabolismus der endogenen Lipide Rezeptoren im Lipoproteinstoffwechsel die LDL-Rezeptor-Familie Apolipoproteine im Plasma Lipoproteinstoffwechsel im ZNS Liquor cerebrospinalis Lipoproteine und Apolipoproteine im ZNS Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie im ZNS Apolipoprotein E Genlokus, Synthese und Struktur des Apolipoprotein E Isoformen des ApoE Rolle des ApoE im Lipoproteinstoffwechsel im ZNS Alzheimersche Erkrankung Ziel der Arbeit Material und Methoden Zellkultur Primärkultur muriner hippokampaler Zellen Zellkultur der HT 22- Zelllinie Isolierung und Analyse der Liganden Lyophilisation von ApoE(3/3) und ApoE(4/4) Isolierung von ApoE(3/3)- bzw. ApoE(4/4)-Liposomen 33 I

4 Inhaltsverzeichnis I-Markierung der ApoE(3/3)- bzw. ApoE(4/4)-Liposomen Isolierung der Chylomikronen-Remnants Proteinbestimmung nach Lowry SDS-Polyacrylamidelektrophorese Analyse der Rezeptoren der verwendeten Zelllinien SDS-Polyacrylamidelektrophorese Westernblot und Immundetektion Radioaktive Zellassays Bindungs-, Aufnahme- und Abbauexperimente mit primären murinen hippokampalen Zellen Aufnahmeversuche mit primären murinen hippokampalen Zellen Aufnahmeversuche mit HT 22-Zellen Bestimmung des Zellproteins nach Bradford Immunfluoreszenz Indirekte Immunfluoreszenz Aufnahmeexperimente mit den Zelllinien mittels Immunfluoreszenz Geräteliste Ergebnisse Charakterisierung der Rezeptoren der hippokampalen Zelllinien und der Liganden Charakterisierung der Rezeptoren der hippokampalen Zelllinien Charakterisierung der 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen bzw. 125 I-ApoE(4/4)-Liposomen Charakterisierung der Chylomikronen-Remnants Aufnahmeassays mit hippokampalen Zellen mit 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen bzw. 125 I-ApoE(4/4)-Liposomen als Liganden Aufnahme der 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen in HT 22-Zellen bei kalter Unterdrückung mit CR versus RAP 53 II

5 Inhaltsverzeichnis Aufnahme der 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen in primären hippokampalen Zellen bei kalter Unterdrückung mit ApoE-Liposomen versus LDL versus CR versus RAP Aufnahme der 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen in primären hippokampalen Zellen am 2. Tag versus 5. Tag in Kultur Vergleich der Aufnahme der 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen in primären hippokampalen Zellen versus HT 22-Zellen Aufnahme der 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen bei einstündiger versus vierstündiger Inkubation Aufnahme, Abbau und Bindung von 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen bzw. 125 I-ApoE(4/4)-Liposomen in primären hippokampalen Zellen Aufnahme von 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen versus 125 I-ApoE(4/4)-Liposomen am 1. versus 2. versus 5. Tag in Kultur Aufnahmeexperimente mit ApoE(3/3)-Liposomen versus ApoE(4/4)- Liposomen als Liganden in der indirekten Immunfluoreszenz Diskussion HT 22-Zellen und hippokampale Primärkultur ApoE(3/3)- und ApoE(4/4)-Liposomen als Liganden in Aufnahmeexperimenten Aufnahme von 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen in hippokampalen Zellen Aufnahme, Abbau und Bindung von 125 I-ApoE(3/3)-Liposomen versus I-ApoE(4/4)-Liposomen in primären hippokampalen Zellen Aufnahme von ApoE(3/3)-Liposomen versus ApoE(4/4)-Liposomen in der Immunfluoreszenz Betrachtung der Ergebnisse vor dem biochemischen und medizinischen Hintergrund Zusammenfassung Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 103 III

6 Inhaltsverzeichnis 8. Danksagung Lebenslauf Eidesstattliche Versicherung 107 IV

7 Einleitung 1.Einleitung 1.1 Der Aufbau des zentralen Nervensystems Grundstrukturen des ZNS Das ZNS setzt sich aus dem Rückenmark und dem Gehirn zusammen. Zum Schutz wird das Gehirn vom knöchernen Schädel und das Rückenmark von den Wirbeln der Wirbelsäule umgeben. Innerhalb dieser knöchernen Kapseln ist das ZNS von drei bindegewebigen Hirn- bzw. Rückenmarkhäuten, den Meningen, umhüllt, bestehend aus Dura mater, Arachnoidea mater und Pia mater. Im subarachnoidalen Raum, in den Ventrikeln des Gehirns und im Zentralkanal umspült der Liquor das ZNS (siehe 1.3.1). Im folgenden werden die Grundstrukturen des Gehirns, soweit für diese Arbeit von Interesse, aufgeführt. Systematisch wird das Gehirn in Telencephalon (Endhirn), Diencephalon (Zwischenhirn) und Truncus encephali (Hirnstamm) unterteilt. Der Hirnstamm beinhaltet das Mesencephalon (Mittelhirn), das Metencephalon (Nachhirn) mit Pons (Brücke) und Cerebellum (Kleinhirn) und die Medulla oblongata (verlängertes Rückenmark). Näher soll das Telencephalon, der größte Abschnitt des menschlichen Gehirns (>80 % des Gehirngewichtes), beschrieben werden. Funktionell kann das Endhirn Informationen verarbeiten, speichern und komplexe Vorgänge steuern, einschließlich der emotionalen Einflüsse. Hier werden auch Ereignisse bewußt gemacht, Pläne entwickelt und Handlungsabläufe haben hier ihren Ursprung. Das Endhirn besteht aus 2 Hemisphären, die durch eine tiefe Längsfurche (Fissura longitudinalis cerebri) voneinander getrennt sind, jedoch durch zahlreiche Nervenfaserbündel miteinander verbunden werden. Die größte dieser verknüpfenden Kommissuren stellt der Balken (Corpus callosum) dar. Jede Hemisphäre wird von einer nervenzellreichen Rinde (Cortex cerebralis) bedeckt und weist in der Tiefe subkortikale Kerne auf. Die Großhirnrinde (Cortex cerebri) läßt 6 Lappen unterscheiden: Lobus frontalis, Lobus parietalis, Lobus occipitalis, Lobus temporalis, Lobus insularis und Lobus limbicus. Ein weiterer Teil der Rinde ist der in der Tiefe liegende Hippocampus (siehe 1.1.4). Die funktionellen und strukturellen Spezialisationen der einzelnen Lobi des Cortex sind entsprechenden Lehrbüchern zu entnehmen und sollen hier nicht weiter ausgeführt werden. Entsprechend der anderen Abschnitte des ZNS weist auch das Endhirn eine innere Gliederung in graue nervenzellreiche (Substantia grisea) und weiße nervenfaserreiche 1

8 Einleitung Substanz (Substantia alba) auf. Die graue Substanz besteht aus Perikarya, Neuropil, dem zwischen den Nervenzellen gelegenen Netzwerk aus Fortsätzen verschiedener Art (Neuriten, Dendriten und Gliafortsätzen), und Kapillaren. In der weißen Substanz verlaufen die Nervenfasern, die von den Perikarya ausgehen, meist in Tractus gebündelt. Im Telencephalon wird die graue Substanz von den Endhirnkernen (im wesentlichen Nucleus caudatus, Putamen, Globus pallidus, Claustrum und Corpus amygdaloideum) und der Großhirnrinde (Cortex cerebralis) inklusive des Hippokampus gebildet. Die weiße Substanz, unter der Rinde und um die Kerne gelegen, besteht aus der Summe der markhaltigen und markarmen Nervenfasern, die der Verbindung der Rinde und der Endhirnkerne dienen Neuronale Zellen Die Nervenzellen (Neurone) erfüllen die spezifischen Aufgaben des Nervengewebes: die Erregungsbildung, -verarbeitung und -leitung innerhalb des ZNS und an die Peripherie. Morphologisch sind die Neurone durch das Perikaryon, den Zellkörper (Soma) mit Zellkern und umgebendem Zytoplasma, und die Neuriten (Fortsätze), die sich in das Axon und die Dendriten unterteilen, gekennzeichnet. Die Dendriten sind in der Regel baumartig verzweigt und dienen der afferenten (zum Perikaryon hin) Leitung der Signale, die sie über ihre Synapsen (Kontaktstellen zwischen Axon und folgenden Strukturen, z.b. Dendriten) aus der Umgebung, von Sinnesepithelzellen oder von anderen Nervenzellen empfangen. Jedes Neuron besitzt nur ein Axon, das der efferenten (vom Perikaryon weg) Weiterleitung von Signalen oft über längere Strecken zu anderen Zellen (z.b. andere Nervenzellen, Muskelzellen, Drüsenzellen) dient. Es ist am distalen Ende verzweigt und überträgt sein Signal über mehrere Synapsen an die Zielzellen. Das Perikaryon hat einerseits rezeptive Funktionen, ist anderseits aber auch das Stoffwechselzentrum des Neurons. Es verfügt über alle erforderlichen Organellen, insbesondere zur Proteinsynthese. Perikarya enthalten ein differenziertes rauhes endoplasmatisches Retikulum (rer), das sich mit freien Ribosomen zu sogenannten basophilen Nissl-Schollen zusammenlagert. Auch die Strukturen des Golgi-Apparates, des trans- Golgi-Netzwerkes sowie Mitochondrien und Lysosomen lassen sich im Zellkörper finden. Neurofilamente (ø 10 nm) und Aktinfilamente (ø 8 nm) bilden innerhalb des Perikaryons Bündel oder fassen z.b. rer und Ribosomen in Gruppen zusammen. Außerdem wirken Neurotubuli (neuronale Mikrotubuli) (ø 24 nm) bei intrazellulären Transportvorgängen sowie bei Exo- und Endozytose mit. 2

9 Einleitung Die verzweigten Dendriten enthalten im Anfangsteil alle für das Perikaryon typischen Organellen einschließlich Nissl-Schollen und Golgi-Apparat. Mit der Entfernung vom Zellleib, fortschreitender Verzweigung und dadurch abnehmendem Durchmesser verschwinden die meisten Organellen jedoch, nur Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) sind auch noch in dünneren Dendriten vorhanden. Aktinfilamente, Neurofilamente und Neurotubuli sind hingegen auch noch in den feinsten Verästelungen zu finden, beeinflussen die Form der Dendriten und stehen im Zusammenhang mit Transportvorgängen. Das einzelne Axon beginnt an einem Ursprungskegel (Axonhügel des Perikaryons) und verläuft mit gleichbleibendem Durchmesser umgeben von einer Gliascheide zu seiner Zielzelle. Im Plasma des Axons (Axoplasma) sind in der Regel weder rer und Ribosomen noch Golgi-Bestandteile zu finden, es sind jedoch glattes ER und Mitochondrien sowie ein charakteristisch stark ausgeprägtes Zytoskelett enthalten. Die parallel verlaufenden Bündel von Neurotubuli und Neurofilamenten dienen der Aufrechterhaltung der Architektur des Axons sowie den axoplasmatischen Transportvorgängen. Der axoplasmatische Transport findet entlang der Neurotubuli und Neurofilamente bidirektional statt, anterograd (vom Perikaryon zum Axonende) und retrograd (vom Axonende zum Perikaryon), und ist sowohl bei Migrationsvorgängen als auch bei Wachstumsprozessen von entscheidender Bedeutung. Die Filamente des Zytoskeletts werden durch Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAP) stabilisiert, wobei eine lokale Spezifität auftritt. MAP-2 wird ausschließlich in die Dendriten transportiert, während τ (Tau), ein anderes MAP, nur in Axonen zu finden ist. Beide MAP kommen nur in Neuronen vor, so daß sie als Markerproteine fungieren. Die Rezeptor-vermittelte Endozytose vieler Moleküle wie z.b. der Lipoproteine ist an einigen nicht-neuronalen Zellen erforscht worden und mittlerweile recht gut charakterisiert. Die spezielle Morphologie der Neuronen führt bei der Aufnahme von Molekülen zu einigen Besonderheiten, so daß im folgenden zunächst der Ablauf der Endozytose im allgemeinen beschrieben werden soll, um dann die neuronalen Besonderheiten zu erwähnen. Die Liganden binden spezifisch an ihre Rezeptoren und werden über Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen. Liganden und Rezeptoren werden durch verschiedene endosomale Kompartimente transportiert, an die Oberfläche der Zelle zurückgeleitet (recycelt) oder transzytiert. In sogenannten frühen und sortierenden Endosomen werden 3

10 Einleitung die Liganden und Rezeptoren entkoppelt und sortiert. Moleküle, die recycelt werden sollen, werden in Recycling-Kompartimenten an die Zelloberfläche geleitet, während Liganden, die abgebaut werden sollen, in sogenannten multivesicular bodies (MVB) und späten Endosomen zu den Lysosomen transportiert werden. In nicht-neuronalen Zellen finden diese Vorgänge in der Regel nahe um den Zellkern statt. In vitro wurde die Endozytose von neuronalen Zellen an Primärkulturen untersucht (Zusammenfassung siehe Parton et al., 1992). Die endozytotische Aktivität ist an den Oberflächen der verschiedenen morphologischen Kompartimente der Neuronen unterschiedlich. Entlang des Axons konnte mit Ausnahme der präsynaptischen Endigungen keine Endozytose festgestellt werden. Die Versorgung des Neurons mit Nährstoffen wird durch die hohe endozytotische Aktivität der gesamten somatodendritischen Oberfläche sichergestellt. Von Dendriten endozytotisch internalisierte Marker lassen sich in einem endosomalen Netzwerk nachweisen, das bis in die distalen Dendriten reicht. Hier scheint die Entkopplung der Liganden von den Rezeptoren und die Sortierung und Weiterleitung in Recycling-Kompartimente oder in MVB-ähnliche Kompartimente stattzufinden. Die frühen endosomalen Kompartimente in den Synapsen ähneln denen der Dendriten und scheinen an der Bildung der synaptischen Vesikel beteiligt zu sein. Die späten Endosomen und die Lysosomen der Neuronen sind zentral im Soma und in den proximalen Anteilen der Dendriten lokalisiert, so daß die aufgenommen Liganden von den peripheren frühen Endosomen zum Umsatz und Abbau retrograd entlang des Axons und der Dendriten zum Perikaryon transportiert werden müssen. Der schnelle retrograde Transport erfolgt, wahrscheinlich durch MVB-ähnliche Strukturen vermittelt, entlang der Mikrotubuli Glia-Zellen Ungefähr die Hälfte des Gesamtvolumens des zentralen Nervensystems besteht aus nichterregbaren Zellen. Den bei weitem größten Teil bilden die Gliazellen, in der Gesamtheit auch als Neuroglia bezeichnet, im geringen Anteil sind z.b. auch Gefäßzellen vorhanden. Gliazellen sind viel kleiner und zahlreicher als Neuronen. Das Verhältnis Nervenzelle zu Gliazelle wird auf 1 zu 10 geschätzt. Alle Gliazellen behalten zeitlebens ihre Teilungsfähigkeit. Im ZNS lassen sich folgende Gliazellen unterscheiden: Astrozyten und Oligodendrozyten (gemeinsam als Makroglia bezeichnet), Mikroglia und Ependymzellen. Die Makroglia und die Ependymzellen sind wie die Neuronen ektodermaler Herkunft, während die Mikroglia aus dem Mesoderm stammt und erst später ins ZNS einwandert. 4

11 Einleitung Astrozyten sind die größten Zellen der Neuroglia und besitzen zahlreiche Fortsätze. Charakteristisch sind die verbreiterten Enden der Fortsätze, die als Gefäßfüße die Kapillaroberflächen bedecken, aber auch auf der Oberfläche von Gehirn und Rückenmark mit ihren Füßen die Membrana limitans gliae superficialis bilden, die die Pia mater von den Nervenzellen trennt. Zu unterscheiden sind protoplasmatische Astrozyten, die in der grauen Substanz vorkommen und viele kurze, stark verzweigte Fortsätze haben, und fibrillenreiche Faserastrozyten, die in der weißen Substanz auftreten und wenige lange Fortsätze aufweisen. Astrozyten stehen im Stoffaustausch mit Neuronen, sorgen so für die Versorgung der Nervenzellen und halten durch Aufnahme von Ionen und Neurotransmittern das Milieu des Extrazellularraumes konstant. Als Antigen-präsentierende und Interleukin 1-sezernierende Zellen wird den Astrozyten auch eine immunologische Bedeutung zugeschrieben. Außerdem dienen Astrozyten während der Neurogenese als Leitstrukturen, die die Nervenzellen an ihren Bestimmungsort führen. Verbunden wird diese Aufgabe mit der Produktion von Substanzen, die das Nervenzellwachstum fördern und so nicht nur während der Neurogenese, sondern auch bei Regeneration von verletzten Nervenbahnen von Bedeutung sind. Oligodendrozyten kommen sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz vor. Sie bilden die Markscheiden im ZNS und verlaufen deshalb in der weißen Substanz parallel zu den markhaltigen Fasern. Von besonderer Bedeutung ist die Sekretion von Hemmstoffen, die eine wichtige Rolle in der Neurogenese und bei Regenerationsprozessen spielen dürften. Mikroglia sind sehr bewegliche Zellen, die in der grauen und der weißen Substanz zu finden sind. Sie können phagozytieren und dienen bei immunologischen Prozessen als Antigen-präsentierende Zellen. Ependymzellen begrenzen die Hohlräume von Gehirn und Rückenmark. Sie bilden eine wichtige, großenteils durchlässige Schranke zwischen innerem Liquorraum des ZNS und Nervengewebe. Als besondere Form bilden die Ependymzellen die Plexus choroidei Aufbau des Hippokampus Der Hippokampus (lat. Seepferdchen, wegen seines S-förmigen Querschnittes) ist ein phylogenetisch altes Gebiet des Cortex (Archaeokortex). Zu großen Teilen wurde er während der Entwicklung des ZNS in die Tiefe des Großhirns verlagert. Funktionell ist der Hippokampus mit dem Lobus limbicus, dem limbischen System, verbunden und ist so an der Entstehung und Empfindung von Gefühlen beteiligt. Außerdem spielt das limbische 5

12 Einleitung System eine besondere Bedeutung beim Speichern von Informationen und Zugriff auf das Gedächtnis. Der Hippokampus ist dem Balken eng benachbart und bildet eine Vorwölbung im Boden des Seitenventrikels. Auf einem Transversalschnitt durch den Hippokampus sind drei Abschnitte in S-förmiger Anordung zu finden: Regio entorhinalis, Subiculum und Gyrus dentatus, die zusammen das Ammonshorn bilden. Histologisch setzt sich der Hippokampus aus einer relativ homogenen Population von bis zu 90% pyramidalen Zellen mit gut beschriebener Morphologie (siehe 1.1.2) und ungefähr 10% Gliazellen (Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia, siehe 1.1.3) zusammen. 1.2 Lipoproteinstoffwechsel im Plasma Um die physiologischen Abläufe des Organismus der Säugetiere aufrechtzuerhalten, ist eine permante Versorgung jeder Zelle des Körpers mit Lipiden essentiell. Als Hauptvertreter der Lipide sind insbesondere Triglyzeride, Cholesterin und Phospholipide an vielen komplexen physiologischen Vorgängen im Organismus beteiligt. Triglyzeride dienen als energieliefernder Brennstoff, aus Cholesterin werden Steroide und Gallensäuren synthetisiert und gemeinsam mit Phospholipiden Zellmembranen aufgebaut. Da die Lipide nicht in hydrophilen Transportmedien (z.b. Blut und Liquor) des menschlichen Organismus löslich sind, kann der Transport nur durch Lipoproteinen als amphiphile Transportform sichergestellt werden. Lipoproteine sind komplexe hochmolekulare Partikel, die sich in unterschiedlichen Anteilen aus Cholesterin und seinen Estern, Triglyzeriden, Phospholipiden und speziellen Proteinen, den Apolipoproteinen, zusammensetzen. Die apolaren Lipide, Triglyzeride und Cholesterinester bilden den hydrophoben Kern der sphärischen Komplexe. Die umgebende Hülle ist vor allem aus Phospholipiden, freiem Cholesterin und Apolipoproteinen aufgebaut. Diese amphiphilen Bestandteile der Hülle sind mit ihrem apolaren Anteil zum Kern ausgerichtet, während die polaren Anteile auf der Oberfläche der Komplexe die Löslichkeit im hydrophilen Milieu vermitteln. Die assoziierten Apolipoproteine können als Bestandteil der Hülle nicht nur als Strukturproteine dienen, sie spielen auch eine große Rolle im Metabolismus der Lipoproteine. Sie werden als spezifische Liganden von den Oberflächenrezeptoren der Zielzellen gebunden und sind so an der Bindung und Aufnahme der Lipoproteine beteiligt. Die Bedeutung der Apolipoproteine wird durch ihre Modulation der Aktivität der Enzyme, die am Lipoproteinmetabolismus beteiligt sind, noch erweitert. 6

13 Einleitung Die Lipoproteine werden mit Hilfe von Dichtegradientenzentrifugation in Dichtefraktionen aufgetrennt, auf diese Fraktionen bezieht sich auch ihre gängige Nomenklatur (Kostner & Maerz, 2001; Havel et al., 1955). Zu den weiteren Charakteristika der verschiedenen Lipoproteinklassen zählen ihre unterschiedliche Größe, Zusammensetzung sowohl im Lipid- als auch im Apolipoproteinanteil, elektrophoretische Mobilität und unterschiedlichen Syntheseorte. In Tab. 1 sind die wichtigsten Eigenschaften der Lipoproteine zusammengefaßt. Chylomikronen (CM) sind die größten Lipoproteine mit der geringsten Dichte und dem höchsten Lipidanteil, Chylomikronen-Remnants (CR) sind Abbauprodukte der CM. VLDL ( very low density lipoproteins ) transportieren Lipide aus der Leber, IDL ( intermediär density lipoproteins ) und LDL ( low density lipoproteins ) entstehen aus VLDL durch Lipoproteinlipase-katalysierte Lipolyse und Austausch mit anderen Lipoproteinen. HDL ( high density lipoproteins ) transportiert als kleinstes und dichtestes Partikel Cholesterin aus der Peripherie in die Leber. Chylomikronen VLDL IDL LDL HDL Dichte [g/ml] <0,96 0,96-1,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,063-1,210 Durchmesser [nm] Molekulargewicht [kd] x x x x ,8x10 2 Syntheseort Darm Leber aus VLDL aus IDL Leber Elektrophor. Mobilität keine Prä-ß Prä-ß / ß ß α Zusammensetzung [% der Masse]: Triglyzeride Cholesterin/-ester Phospholipide Proteine Apolipoproteine (Apo) ApoA-I,-II,-IV ApoA-I,-II ApoB 48 ApoB 100 ApoB 100 ApoB 100 ApoC-I,-II,-III ApoE ApoC-I,-II,-III ApoE ApoC-III ApoE ApoC-I,-II,-III ApoE Tabelle 1: Charakteristika der Lipoproteine im Plasma Die dargestellten Daten sind der Literatur entnommen (Kostner & Maerz, 2001; Kane et al., 1996; Gotto et al., 1986; Havel et al., 1955;). Die Nomenklatur wurde im vorhergehenden Text erläutert. Die elektrophoretische Mobilität bezieht sich auf die Auftrennung in einem nativen Agarosegel Metabolismus der exogenen Lipide Die Stoffwechselwege der exogenen Lipide beschreiben die Aufnahme und den Transport der durch Nahrung zugeführten Lipide. Die Nahrungslipide erreichen den Dünndarm bereits teilweise durch ortsständige Lipasen in Mund und Magen hydrolisiert. Im Duodenum werden die entstandenen Lipidtröpfchen durch Gallensäure emulgiert. Die 7

14 Einleitung pankreatische Lipase spaltet die Fette weiter, so daß freie Fettsäuren und 2- Monoacylglyzeride entstehen, die sich in Mizellen zusammenlagern. Im Jejunum werden die freien Fettsäuren und die Monoacylglyzeride entlang eines Diffusionsgradienten von den Enterozyten aufgenommen und sofort zu Triglyzeriden reverestert. Die Gallensäuren werden getrennt von den Mizellen rezeptorvermittelt resorbiert und in der Leber recycelt. In den Mukosazellen des Dünndarm erfolgt anschließend die Biosynthese der Chylomikronen. Im Golgi-Apparat der Zellen werden die reveresterten Triacylglyzerine mit Cholesterin, Phospholipiden und den Apolipoproteinen ApoA-I, -II, -IV und ApoB 48 assoziiert, die so synthetisierten Chylomikronen werden exozytotisch an den extrazellulären Raum abgegeben. Über die intestinalen Lymphwege und den Ductus thoracicus gelangen die Chylomikronen in den Blutkreislauf (Hussain et al., 1996). Im Blutplasma verändert sich die Zusammensetzung der Chylomikronen, sie nehmen von intravaskulärem HDL die Apolipoproteine ApoC-I, -II und III auf. ApoC-II dient als essentieller Kofaktor (Breckenridge et al., 1978) der endothelständigen Lipoprotein-Lipase (LpL), mit der die Chylomikronen während ihrer intravaskulären Passage in Kontakt kommen. LpL spaltet die Triglyzeride im Kern der Chylomikronen (Eisenberg et al., 1992). Hierbei entstehen freie Fettsäuren, die zum Weitertransport größtenteils an Albumin gebunden werden und Muskelzellen als Energielieferant dienen, im Fettgewebe gespeichert oder von Zellen als Membranbausteine verwertet werden (Olivecrona et al.,1993). Das Enzym LpL löst sich von den Heparansulfat Proteoglykanen (HSPG), an die es auf der Oberfäche der Endothelzellen gebunden ist, und verbleibt an die Partikel assoziiert (Felts et al., 1975; Krapp et al., 1996; Lutz et al., 2001). Die Zusammensetzung der Chylomikronen verändert sich durch den Kontakt mit den anderen Lipoproteinen weiter. Aus den Chylomikronen entstehen durch Austausch von Lipiden und Apolipoproteinen mit anderen Lipoproteinen kleinere und dichtere Chylomikronen- Remnants (CR). Während dieser Umwandlung nehmen die Chylomikronen neben den ApoCs auch ApoE von den HDL auf. ApoCs haben eine inhibitorische Wirkung auf die zelluläre Aufnahme der CR und werden wieder abgespalten, während ApoE an den CR verbleibt. ApoE vermittelt mit Unterstützung der partikelassoziierten LpL die Bindung der CR an die Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie (Beisiegel et al., 1989) und ermöglicht so die Rezeptor-vermittelte Endozytose der CR in die Leberzellen. 8

15 Einleitung Metabolismus der endogenen Lipoproteine In der Leber werden die Lipide, die mit den Chylomikronen-Remnants aufgenommen werden, zur endogenen Synthese von VLDL verwendet. Ähnlich der Synthese der Chylomikronen in den Mukosazellen werden die VLDL in den Hepatozyten produziert. Endogen synthetisierte Triglyzeride, Phospholipide und Cholesterin werden mit Apolipoproteinen assoziiert, die prozentuale Zusammensetzung ist Tabelle 1 zu entnehmen. VLDL besitzen charakteristischerweise ApoB 100 und ApoE auf der Oberfläche ihrer Hülle, ApoCs nehmen sie wie die Chylomikronen von HDL auf. Die Zusammensetzung der VLDL ändert sich während der intravaskulären Passage ebenfalls entsprechend der Umwandlung der Chylomikronen in ihre Remnants. LpL katalysiert die Hydrolyse der Triglyzeride, Phospholipide und Cholesterin werden an HDL abgegeben. Das Cholesterin wird in den HDL katalysiert durch Lezithin-Cholesterinacyltransferase (LCAT) verestert und die Cholesterinester mit Hilfe des Cholesterin-Ester-Transfer-Protein (CETP) auf die VLDL übertragen. Es entstehen IDL, die sich durch weitere Hydrolyse, katalysiert durch LpL und die hepatische Lipase (HL), zu cholesterinreichen LDL umwandeln (Griffin & Packard, 1994). VLDL, IDL und LDL können in allen Zwischenstufen durch Bindung von Apolipoproteinen an Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie endozytotisch aufgenommen werden. VLDL und seine Remnants sichern so die Versorgung der verschiedenen Gewebe des Körpers in Hungerzuständen. Für die Bindung von VLDL und IDL an die Rezeptoren dient vor allem ApoB 100 aber auch ApoE als Ligand, LDL enthält nur noch ApoB 100 als Apolipoprotein. Nach der Endozytose der Partikel werden die Remnants lysosomal abgebaut und dadurch insbesondere Cholesterin für die Membran- und Hormonsynthese bereitgestellt (Kovanen et al., 1979). Um eine möglichst konstante Cholesterinkonzentration zu gewährleisten, unterliegt sowohl die Aufnahme von cholesterinhaltigen Partikeln als auch die de-novo-synthese von Cholesterin in Leberzellen und anderen cholesterinverarbeitenden Geweben komplexen Regulationsmechanismen, die unter anderem über Rückkopplungsmechanismen eine up- bzw. down-regulation der Rezeptoren bewirken. Da menschliche Zellen Cholesterin nicht abbauen können, kann Cholesterin nur durch die von Hepatozyten produzierten Gallensäuren aus dem Körper eliminiert werden. Zu hohe Cholesterinkonzentrationen im extrahepatischen peripheren Gewebe führen zu einem Rücktransport des Cholesterins in die Leber. Für den reversen Cholesterintransport synthetisiert die Leber diskoidale, lipidarme HDL, deren Apolipoproteinanteil sich vor allem aus ApoA-I und A-II und ApoE zusammensetzt. HDL 9

16 Einleitung kann in der Peripherie freies Cholesterin absorbieren und mit Hilfe von LCAT verestern. Cholesterinreiches HDL wird entweder Rezeptor-vermittelt von der Leber aufgenommen oder durch Interaktion mit den anderen Lipoproteinen weiter verändert, indem es Cholesterinester transferiert und Triglyzeride aufnimmt. Triglyzeridreiche HDL werden durch Hydrolyse mit Hilfe von HL recycelt und können erneut in den reversen Transport von Cholesterin eintreten Rezeptoren des Lipoproteinstoffwechsels Sowohl im exogenen als auch im endogenen Metabolismus der Lipoproteine spielen die Rezeptoren der Zellen eine entscheidende Rolle. Durch Expression von Rezeptoren stellen die Gewebe ihre Versorgung mit den für sie notwendigen Lipiden und Proteinen sicher. Die Endozytose der Lipoproteine wird durch Wechselwirkungen zwischen Apolipoproteinen und Rezeptoren vermittelt. Die verschiedenen Gewebe können durch die entsprechenden Rezeptoren auf ihrer Oberfläche die für sie verwertbaren Lipoproteine aus dem Plasma selektieren und aufnehmen. Von großer Bedeutung im Lipoproteinstoffwechsel erwiesen sich die Rezeptoren der LDL- Rezeptor-Gen-Familie. Der Name der Familie lehnt sich an den von Goldstein und Brown identifizierten und charakterisierten LDL-Rezeptor (LDL-R) an (Goldstein & Brown, 1985). Bis heute umfaßt die LDL-Rezeptor-Familie 6 Mitglieder, von denen der LDL-R am besten bezüglich Funktion, Struktur und Regulation charakterisiert ist. Gemeinsam mit LDL-R bilden das LDL-R related protein (LRP) (Herz et al.,1988), der VLDL-Rezeptor (Takahashi et al.,1992), der ApoE-Rezeptor 2 (ApoER2), in der Literatur auch unter LR 7/8B zu finden, (Kim et al., 1996), das Megalin (auch als GP 330 bezeichnet) (Novak et al., 1996) und der LR11 (Sorla) (Yamazaki et al., 1996) die LDL-Rezeptor-Gen-Familie. Die Mitglieder zeichnet eine starke strukturelle Homologie zum LDL-R aus, sie sind alle aus jeweils fünf Strukturdomänen aufgebaut, weisen jedoch Unterschiede in Größe und Zusammensetzung sowie in Gewebeverteilung und Ligandenspezifität auf. Aminoterminal sind die Rezeptoren extrazellulär durch eine hochkonservierte, cysteinreiche complement-type-domain gekennzeichnet, die der Ligandenbindung (ApoB 100, ApoE) dient. An diese Domäne schließt sich eine weitere cysteinreiche Sequenz an, in der sich Motive wiederholen, die eine starke Ähnlichkeit zum epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) aufweisen, so daß die Domäne auch als EGF-type-domain bezeichnet wird. Diese Region veranlaßt intrazellulär durch eine ph-abhängige Konformationsveränderung eine Dissoziation des gebundenen Liganden vom Rezeptor (Davis et al., 1987). Es folgt die 10

17 Einleitung dritte, ca. 60 Aminosäuren umfassende Domäne, die sich durch viele o-glykosidisch gebundene Zuckerreste auszeichnet. Als vierte Domäne ist der transmembrane Anteil des Rezeptors anzuführen, der mit Aminosäuren (AS) in die Membran eingefügt ist. Die kurze C-terminale cytoplasmatische Domäne bildet mit ca. 50 AS die letzte Domäne. Sie ist mit ihrer `NPXY -Sequenz an der intrazellulären Verpackung der Rezeptoren in coated pits und dem Recycling des Rezeptors beteiligt (Chen, et al., 1990). Den Rezeptoren der LDL-Rezeptor-Familie sind weiterhin die Ca 2+ -abhängige Bindung ihrer Liganden und die Rezeptor-vermittelte Endozytose dieser Liganden gemeinsam. Außerdem binden alle Rezeptoren dieser Gruppe ApoE, LpL und das Rezeptor-assoziierte Protein (RAP). Trotz dieser Gemeinsamkeiten erfüllen die einzelnen Rezeptoren aufgrund ihrer Expression in unterschiedlichen Geweben und ihrer verschiedenen Spezifität für bestimmte Liganden spezifische Aufgaben. Im folgenden werden die einzelnen Vertreter der LDL-Rezeptor-Familie kurz vorgestellt. Der LDL-R als Namensgeber der Familie ist ausführlichst erforscht worden. Er wird ubiquitär exprimiert und nimmt eine bedeutende Rolle im Cholesterinstoffwechsel ein. Da der LDL-R ApoB und ApoE-enthaltende Lipoproteine bindet, wird er in der Literatur auch häufig als ApoB/E- Rezeptor bezeichnet. Es ist bekannt, daß Mutationen im Bereich dieses Rezeptors zur familiären Hypercholesterinämie führen, deren Krankheitsbild aufgrund von verminderter Aufnahme von LDL mit einem massiv erhöhten Cholesterinspiegel und frühzeitiger Bildung von arteriosklerotischen Plaques (und ihren organischen Folgen einhergeht) (Goldstein & Brown, 1985; Hobbs et al., 1992). Die Bedeutung des LDL-R im Stoffwechsel der triglyzeridreichen Partikeln gilt es noch genauer zu untersuchen, es ist jedoch anzunehmen, daß die zelluläre Cholesterinhomöostase und die Regulation des Plasmacholesterinspiegels die Hauptfunktionen des LDL-R darstellen. Patientenstudien zeigten, daß der Chylomikronenmetabolismus bei homozygotem LDL- Rezeptordefekt im Gegensatz zum Cholesterinstoffwechsel ungestört abläuft (Rubinsztein et al.,1990) und auch einige Tiermodelle weisen keinen Einfluß von LDL-R-Defekten auf ihren Triglyzeridstoffwechsel nach (Kita et al.,1981; Ishibashi et al., 1994, 1996). Das LRP ( LDL-related protein ) wird in Hepatozyten (Herz et al., 1988), Neuronen (Wolf et el., 1992), in Trophoblasten (Jensen et al., 1988), in Makrophagen (Watanabe et al., 1994) sowie in Fibroblasten, Muskelzellen, Astrozyten und Ependymzellen (Zheng et al., 1994) synthetisiert. LRP erwies sich als wichtig für die Aufnahme von ApoE-haltigen Remnant-Lipoproteinen, es bindet ApoE (Beisiegel et al., 1989), ß-VLDL (Kowal et al., 1989), LpL (Beisiegel et al., 1991; Chapell et al., 1994, Krapp et al., 1995) sowie HL (Ji et 11

18 Einleitung a., 1994; Shafi et al., 1994). Außer den Liganden des Lipoproteinstoffwechsels bindet LRP auch noch einige Proteasen des Gerinnungssystems, auch in Komplexen (Bu et al., 1992) insbesondere α 2 Makroglobulin (Kirstensen et al., 1990), so daß LRP auch unter dem Namen α 2 M-R/LRP bekannt geworden ist. LRP ist essentiell für die embryonale Entwicklung und scheint bei der Entstehung der Alzheimer Erkrankung von Bedeutung zu sein. Der VLDL-R ist im Fettgewebe, Gehirn, Muskelzellen der Herz- und Skelettmuskulatur und in Endothelzellen zu finden. Ähnlich LRP bindet er eine Vielzahl an Liganden, im Bereich der Lipoproteine VLDL und IDL (Takahashi et al., 1992), CR (Niemeier et al.,1996) und LpL (Argraves et al., 1995), außerdem Proteasen (Argraves et al., 1995) und Thrombospondin (Mikhailenko et al., 1997). Strukturell ähnelt der VLDL-R dem LDL-R stark, er besitzt aber eine Ligandenbindungsdomäne mehr als der LDL-R. Funktionell bindet VLDL-R im Gegensatz zu LDL-R nur ApoE- und nicht ApoB 100 -haltige Lipoproteine und besitzt ein eingegrenztes Expressionsmuster. VLDL-R wird eine Bedeutung bei der Versorgung des Fettgewebes mit Speicherfett (Frykman et al., 1995) und der Muskulatur mit Energielieferanten zugeschrieben. Ebenso wurde eine Bedeutung in der Entwicklung des Kleinhirns und des cerebralen Kortex beschrieben (Trommsdorff et al., 1999). ApoER2 (LR 7/8B) (Kim et al., 1996) weist insbesondere eine Expression im Gehirn, aber auch in geringen Anteilen in der Plazenta, den Ovarien, Testes und Blutplättchen auf. Die Rolle des ApoER2 ist zur Zeit noch weitgehend ungeklärt, angenommen wird aufgrund der vorwiegenden Lokalisation im Gehirn eine Beteiligung an Wachstums- und Organisationsprozessen im ZNS. Auch die Rolle des LR 11 als jüngstes Mitglied der Familie ist noch nicht geklärt. Wie ApoER2 ist auch LR 11 vor allem im Gehirn zu finden, geringe Expression wurde aber auch in der Leber und der Nebenniere detektiert (Yamazaki et al., 1997). Seinen Namen erhielt der LR 11 aufgrund seiner 11 Ligandenbindungsdomänen, an die eine Bindung von Apo E bereits nachgewiesen werden konnte (Yamazaki et al., 1996). LR 11 weist interessanter Weise eine starke Homologie zum Rezeptor für das Neuropeptid head activator der Hydra (Hampe et al., 1999) auf. Megalin (GP330) wird in adsorptiven Epithelzellen synthetisiert und ist so unter anderem im Gehirn, in Lunge und Niere zu finden. Dieser Vertreter der LDL-Rezeptor-Familie scheint eine große Bedeutung für die Entwicklung der Gewebe, in denen er exprimiert wird, zu haben. Zunächst wurde Megalin als auslösendes Antigen der Heymanns 12

19 Einleitung Autoimmun-Nephropathie bekannt. Mittels Klonierung konnte Megalin aufgrund seiner strukturellen Homologie zu dem LDL-R als Mitglied der LDL-R-Familie charakterisiert werden. Das Ligandenspektrum des Megalins ähnelt dem des LRP. Die Vertreter der LDL-Rezeptor-Familie sind nicht die einzigen Lipoproteinrezeptoren des Körpers. Zu erwähnen sind vor allem die Scavenger-Rezeptoren, die die Endozytose von oxidierten und acetylierten LDL durch Makrophagen vermitteln (Krieger & Herz, 1994). Bihain et al. beschrieben den Lipolyse stimulierten Rezeptor (LSR) auf Hepatozyten, dessen Rolle im Lipoproteinstoffwechsel jedoch noch weitgehend ungeklärt ist (Bihain et al., 1992; Yen et al., 1994). Weitere Lipoproteinbindungsproteine stellen die Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) dar. Die HSPG sind an der Oberfläche der Zellen lokalisiert und können mit ApoE (Ji et al., 1993) und LpL (Eisenberg et al., 1992) interagieren und so die Aufnahme von Lipoproteinen vermitteln. Kurz soll noch der Rezeptor Cubilin erwähnt werden, der in der Niere mit Megalin assoziiert ist und wahrscheinlich nur in dieser Verbindung mit dem Liganden endozytotisch aufgenommen werden kann. Liganden des Cubilins sind vor allem ApoA-I-haltige HDL Apolipoproteine im Plasma Die Apolipoproteine in der Peripherie lassen sich nach strukturellen Gesichtspunkten in drei Gruppen unterteilen. ApoA-I - IV, ApoC-I - III und ApoE weisen amphipathische α- Helices aus 22 Aminosäuren auf, die der Bindung an die Lipide dienen. Die zweite Gruppe umfaßt ApoB 100 und ApoB 48, die zusätzlich zu den α-helices ß-Faltblatt-Strukturen besitzen. Die letzte Gruppe wird von ApoD, ApoH und ApoJ gebildet, die weder α-helices noch ß-Faltblätter aufweisen, sondern stark glykosilierte Proteine darstellen. Als klassische Apolipoproteine werden ApoA, ApoB und ApoC bezeichnet, die nur in der Leber und im Dünndarm synthetisiert werden. ApoE zählt strukturell zwar zu den klassischen Apolipoproteinen, Syntheseorte und Funktionen ähneln jedoch eher der Gruppe der Apolipoproteine D, J und H. Tabelle 2 gibt einen Überblick über weitere Einzelheiten der Apolipoproteine im Plasma. 13

20 Einleitung Apolipoprotein Molekulargewicht 1 [kda] Assoziation mit Syntheseort Funktion A-I 28,3 HDL Leber, Darm Strukturprotein, aktiviert LCAT 2,Ligand für SR-BI 3 vermittelt Cholesterin-Efflux 4 A-II 17,7 HDL Leber, Darm Strukturprotein, aktiviert HL 5 A-IV 46 CM, HDL lipidarm Leber, Darm B VLDL, LDL Leber B CM Darm C-I - III 6-9 CM, VLDL Leber, Darm D 33 HDL, VHDL E 34 CM, VLDL, HDL H 54 CM, VLDL lipidarm J 70 HDL, VHDL Leber, Darm, Nebenniere, Niere, Gehirn Leber, Makrophagen, Gehirn Leber, Darm, Plazenta, Gehirn Leber, Makrophagen, Herz, Lunge, Gehirn aktiviert LCAT 6, vermittelt Cholesterin-Efflux 7, beeinflußt TG-Stoffwechsel 8, Sättigungssignal? 9 Strukturprotein, Sekretion von VLDL, Ligand für LDL-R Strukturprotein, Sekretion von CM modulieren die LpL-Aktivität 10, inhibieren die Aufnahme von TRL 11 reverser Chol-Transport? Interaktion mit diversen lipophilen Molekülen 12 Bindung an Lp-Rezeptoren 13, reverser Chol-Transport 13, immunregulator. Eigenschaften 14 Moduliert den TG- Stoffwechsel? 15 Anti- Phospholipid-Syndrom 16, Bindung an Megalin 17 Multifunktionell, Rolle bei div, degenerativen Erkrankungen?, Schutzfunktion an Gewebegrenzen 18, Bindung an Megalin 19 Tabelle 2: Apolipoproteine und ihre Eigenschaften im Plasma Der Tabelle sind Molekulargewicht der Apolipoproteine, die Lipoproteinklassen, mit denen sie assoziiert sind, und die Hauptsyntheseorte und funktionen zu entnehmen. CM, VLDL, LDL, HDL wurden im Text erläutert, TRL: triglyzeridreiche Lipoproteine, VHDL: very high density lipoproteins ; lipidarm: gefunden bei einer Dichte > 1,21 g/ml; 1 (Kostner & Maerz, 1996); 2 (Sorci-Thomas et al., 1993); 3 (Acton et al., 1996); 4 (Fielding & Fielding, 2001); 5 (Mowri et al., 1992); 6 (Steinmetz& Utermann, 1985, Jonas, 1998); 7 (Fournier et al. 2000), 8 (Hockey et al., 2001); 9 (Tso et al., 1999); 10 siehe Referenzen in (Patsch & Gotto Jr., 1996); 11 (Jong et al., 1996); 12 (Navarro et al., 1998); 13 (Davignon et al., 1999); 14 (Pepe et al., 1986); 15 (Gambino et al., 1999); 16 (Lutters et al., 2002); 17 (Moestrup et al., 1998); 18 (Jenne & Tschopp, 1992); 19 (Kounnas et al., 1995) 1.3 Lipoproteinstoffwechsel im ZNS Der Lipoproteinstoffwechsel des ZNS ist nach wie vor in vielen Bereichen ungeklärt. Es ist noch nicht gelungen, die im Liquor vorkommenden Lipoproteine bezüglich Funktion und Wirkungsweise unter physiologischen oder auch pathologischen Bedingungen eindeutig zu charakterisieren, ebenso wie die konkrete Beschreibung und Klassifizierung der Lipoproteine im ZNS schwerfällt. 14

21 Einleitung Im folgenden werden zunächst der Liquor cerebrospinalis und seine Eigenschaften als Transportmedium der Metabolite des ZNS beschrieben, bevor die heutigen Erkenntnisse im Bereich des Lipoproteinstoffwechsels des ZNS zusammengefaßt werden Liquor cerebrospinalis Die Strukturen des zentralen Nervensystems, das Gehirn und das Rückenmark, werden von einer klaren, farblosen, protein- und zellarmen Flüssigkeit umspült, dem Liquor cerebrospinalis ( cerebrospinal fluid (CSF), Gehirnwasser ). Der Liquor befindet sich im äußeren Liquorraum, der sich zwischen Arachnoidea mater und Pia mater befindet, und im inneren Liquorraum, der die Ventrikel im Gehirn und den Zentralkanal im Rückenmark zusammenfaßt. Durch Kommunikation des inneren mit dem äußerem Liquorraum besteht eine Liquorzirkulation. Gebildet wird der Liquor von den Plexus choroidei der Ventrikel und vom Ventrikelependym und gelangt durch die Aperatura mediana und die Aperaturae laterales in den äußeren Liquorraum. Dort wird der Liquor zum größten Teil von den Granulationes arachnoidales (Arachnoidalzotten) resorbiert, ein Teil verläßt das ZNS auch durch die perineuralen lymphatischen Abgänge der Spinalnerven. Die Liquorräume eines Erwachsenen fassen zusammen ca. 140 ml, bis zu 30 ml davon befinden sich in den Ventrikeln. Pro Tag werden etwa 500 ml Liquor gebildet werden, so daß durch Neubildung und Rückresorption der Liquor mindestens 3mal am Tag ausgetauscht wird. Der Liquor schützt einerseits als eine Art Wasserkissen das zentrale Nervensystem vor Erschütterungen und Traumen, ist aber andererseits am Stoffwechsel aller Strukturen des ZNS in sofern beteiligt, als daß er mit der interstitiellen Flüssigkeit (ISF) über die Ependym- und Piazellen in Kontakt und Austausch steht. Das ZNS bildet ein eigenes, gegenüber dem Blutstrom abgeschlossenes Kompartiment, in dem die ISF den Transport von Nährstoffen und Produkten des Zellmetabolismus im Extrazellularraum ermöglicht. Die Zusammensetzung des Liquors läßt durch den beschriebenen Austausch mit der ISF auf die Stoffwechselaktivität des ZNS rückschließen. Drei verschiedene Barrieren stellen die Abgeschlossenheit des ZNS gegenüber dem Blutstrom sicher: Die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Blut-Liquor-Schranke (BLS) und die Liquor-Blut-Schranke (LBS). Die BLS wird im Bereich der Plexus choroidei durch spezialisierte Ependymzellen, die BHS an den Hirnkapillaren durch Endothelzellen und die LBS in den Arachnoidalzotten durch das sogenannte Neuroepithel gebildet. Die flächenmäßig größte und bedeutendste Barriere entsteht durch die BHS an den zahlreichen Hirnkapillaren, der Begriff Blut-Hirn- 15

22 Einleitung Schranke wird allerdings auch häufig als Zusammenfassung aller drei Barrieren im ZNS verwendet. Der Bildung des Liquors erfolgt in den Plexus choroidei mit Hilfe von aktiven Ionentransportern, das Wasser folgt dem osmotischen Gradienten entsprechend passiv. So werden unter anderem Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium, aber auch Aminosäuren und Glucose in den Liquor transportiert. Wie schon erwähnt ist der Liquor im Vergleich zum Plasma sehr proteinarm (Liquor 0,2-0,4 mg/ml; Plasma mg/ml). Außer sehr großen Proteinen sind alle Proteine des Plasmas im Liquor vertreten, so daß postuliert wird, daß die Proteine durch sehr wenige, zeitweilige Lecks im choroidalen Ependym an der BLS in den Liquor übertreten. Der Konzentrationsunterschied der Proteine zwischen dem Liquor- und Blutkompartiment wird auf eine sehr geringe Anzahl dieser Lecks unter physiologischen Bedingungen zurückgeführt, krankheitsbedingt kann eine erhöhte Durchlässigkeit der BLS zu einem vermehrten Einstrom von Plasmaproteinen in den Liquor führen. Zusätzlich zu der passiven Diffusion wird der Proteingehalt im Liquor durch aktive Transportvorgänge und durch Neusynthese der Proteine im ZNS beeinflußt. Die selbständige Synthese von Fettsäuren, Cholesterin, Phospholipiden und Sphingomyelinen macht das ZNS außerdem relativ unabhängig von dem Lipideinstrom aus dem Plasma. Aufgrund der hohen Syntheserate von Cholesterin stellen Cholesterin und seine Ester mit 33% den größten Anteil der Lipide im Gehirn dar, gefolgt von Lecithin und anderen Phospolipiden mit 30% Lipoproteine und Apolipoproteine im ZNS Der Nachweis von Lipoproteinen im Liquor gelang bereits 1961 (Swahn et al., 1961). Erst einige Zeit später wurden die Apolipoproteine ApoA-I, C-II, C-III und E im Liquor detektiert (Roheim et al., 1979), mittlerweile konnten bis auf ApoB alle Apolipoproteine im Liquor nachgewiesen werden, wobei der Nachweis von ApoC-I - III noch nicht eindeutig gelungen ist. Die Konzentrationen der Apolipoproteine im Liquor im Vergleich zum Plasma sowie die Molekulargewichte sind der Tabelle 3 zu entnehmen. Die Konzentration der Apolipoproteine im Liquor wird nicht wie bei den anderen Proteinen nur von ihrer Konzentration im Plasma und ihrem Molekularradius bestimmt, da die Apolipoproteine mit unterschiedlich großen Vertretern der heterogenen Gruppe der Lipoproteine assoziiert sind. Im Liquor sind die Konzentrationen von ApoE, D, J und A-I 16

23 Einleitung ungefähr gleich, während im Plasma ApoA-I und II und ApoB 100 deutlich höher konzentriert sind als die anderen Apolipoproteine (siehe Tabelle 3). Molekulargewicht [kda] A-I A-II A-IV B 100 B 48 C-I-III D E J H Plasma < [mg/dl] * Liquor [mg/dl] 0,45 1 0,05 1 nicht bestimmt nicht bestimmt 0,1-0,3-0,24 4 nicht 0,5 3 0,6 3 bestimmt Tabelle 3: Molekulargewichte und Konzentrationen von Apolipoproteinen im Plasma und im Liquor Der Tabelle sind die Molekulargewichte der wichtigsten Apolipoproteine sowie ihre Konzentrationen im Plasma und im Blut zu entnehmen. * (Kostner & Maerz, 1996); 1 (LaDu et al., 1998); 2 (Osman et al., 1995); 3 (Holmquist et al., 1996; Terrisse et al., 1998); 4 (Choi-Miura et al., 1992) Die Synthese der Apolipoproteine E, D und J im ZNS konnte inzwischen nachgewiesen werden (Danik et al., 1993, Elshourbagy et al., 1985; Smith et al., 1990), so daß sich auch die Verschiebung der Mengenverhältnisse der Apolipoproteine im Liquor gegenüber dem Plasma erklären lassen. LaDu erforschte in vitro die Sekretion der synthetisierten Apolipoproteine von Astrozyten (LaDu et al., 1998). Die Apolipoproteine A-I und A-II werden nicht lokal synthetisiert, sondern über die BHS in Form von kleinen HDL 3 - ähnlichen Partikeln in den Liquor aufgenommen (de Vries et al., 1995). ApoE-haltiges HDL scheint diesen Weg nicht passieren zu können, da entdeckt wurde, daß die ApoE- Isoform eines Lebertransplantats nur im Plasma, nicht jedoch im Liquor detektiert werden kann (Linton et al., 1991). Zur Zeit ist es noch nicht gelungen eine eindeutige Charakterisierung und Klassifikation der Apolipoproteine im ZNS zu erarbeiten, die Ergebnisse bisheriger Untersuchungen sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Die Daten aus Tabelle 4 lassen den Rückschluß zu, daß ApoE und ApoA-I, die beiden Hauptapolipoproteine im Liquor, sowohl gemeinsam auf einem Lipoprotein (Borghini et al., 1993, Koch et al., 2001) als auch in getrennten Partikeln (Koudinov et al., 1996; Koch et al., 2001) zu finden sind. Es wurde die Hypothese aufgesetzt, daß die größeren ApoEhaltigen, im ZNS synthetisierten Lipoproteine mit den kleineren ApoA-I-haltigen, aus dem Plasma stammenden Partikeln interagieren, wodurch die mittelgroßen ApoE- und ApoA-Ihaltigen Lipoproteine entstehen. Zusätzlich wurde noch eine vierte Gruppe von 17

24 Einleitung Lipoproteine, die weder ApoE noch ApoA-I enthält, im ZNS detektiert (Borghini et al. 1993, Koch et al., 2001). Die Ergebnisse aus Tabelle 4 stimmen darin überein, daß ApoA-I und ApoJ mit fast allen Lipoproteinklassen im Liquor assoziiert sind, während ApoD zum Teil in allen Gruppen (Borghini, Koch), zum Teil nur in bestimmten Dichtebereichen (Koudinov) gefunden werden konnte. Auftrennung Referenz nach I Pitas Dichte Protein Partikel ApoE-Fraktion ApoA-I-Fraktion Dichte [g/ml] 1,09-1,15 1,09-1,15 Größe [nm] E A-I Untersuchte Apolipoproteine Borghini Größe Protein CSF-LpE CSF-LpA-I 3.Population A-I, A-IV, D, E, J A-I, A-IV, D, E, J A-IV, D, J Koudinov Dichte CSF-VLDL/LDL CSF-HDL 2 CSF-HDL 3 CSF-VHDL 1,006-1,063 1,063-1,125 1,125-1,210 1,210-1,250 - A-IV, E A-I, A-II, A-IV, C-II, D, E, J A-I, A-II, A-IV, C-II, D, E, J A-I, A-II, A-IV, J Guyton Dichte Größe HDL 1 1,006-1, E Rebeck Dichte - >1,21 - E-A-Heterodimer LaDu Dichte Größe - 1,08-1, AQ-I, A-II, E, J Montine Dichte - <1,21 - A-I, E-A-II-Heterodimer Koch Dichte Größe Protein CSF-LpE CSF-LpEA CSF-LpA scsf-lp 1,03-1,07 1,07-1,12 1,08-1,11 >1, <6 A-IV, D, E A-I, A-II, A-IV, D, E, H A-I, A-II, A-IV, D A-IV, D, H, J Tabelle 4: Publizierte Daten zur Charakterisierung der Lipoproteine im Liquor Zur Zeit besteht noch keine einheitliche Nomenklatur, so daß die Bezeichnung der Lipoproteine aus den jeweiligen Referenzen übernommen wurde. I Der Tabelle sind die Eigenschaften zu entnehmen, aufgrund derer die Auftrennung der Partikel erfolgte. Es wurden die Methoden der Salzgradientenzentrifugation ( Dichte ), der Gelfiltration ( Größe ) und der Affinitätschromatographie ( Protein ) verwendet. 1 (Pitas et al., 1987); 2 (Borghini et al., 1993); 3 (Koudinov et al., 1996); 4 (Guyton et al., 1998); 5 (Rebeck et al., 1998); 6 (LaDu et al., 1998); 7 (Montine et al., 1998); 8 (Koch et al., 2001) Die Funktion der Lipoproteine im ZNS ist zur Zeit noch weitgehend ungeklärt. Bisher konnte gezeigt werden, daß ApoE-haltige Lipoproteine als Liganden von LRP das Auswachsen von Neuriten fördern (Fagan et al., 1996). Desweiteren wurde eine Funktion der Lipoproteine im ZNS bei der Verteilung von Lipiden nach Verletzung von Nerven beschrieben (Boyles et al., 1990; Poirier et al., 1993). Außerdem konnte Rebeck et al. in 18