Sicherheit von Knochentransplantaten: Peressigsäure-Ethanol-Sterilisation
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- Victor Hase
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1 Sicherheit von Knochentransplantaten: Peressigsäure-Ethanol-Sterilisation Axel Pruß Universitäts-Gewebebank Institut für Transfusionsmedizin Charité Universitätsmedizin Berlin Charitéplatz 1, Berlin
2 Historie Peressigsäure (PES, Katalase-resistent, zerstört S-S, SH-Gruppen) Erstbeschreibung als Desinf.-Mittel 1902 (Freer und Novy) Grundlegende Arbeiten von Sprößig und Mücke weisen 1963 ff. die bakterizide, viruzide und sporizide Wirkung der PES nach, 1972 als Wofasteril in Wolfen (Sachsen-Anhalt) produziert Desinfektionsmittel in breiter Anwendung in ehemaliger DDR (u.a. Hautdesinfektion bei Blutspendern mit 0,2% PES) 1985 Einführung in das Tissue Banking durch Starke und von Versen (Wirkkonzentration 1%, keine Validierung)
3 Studien ( ) BfArM-Auflage (1996): Ermittlung der viralen Inaktivierungspotenz der Peressigsäure/Ethanol-Methode (Charité, DIZG) Modellentwicklung: drei umhüllten und drei nicht umhüllten Viren in humanen Knochenspongiosa-Transplantaten Untersuchungen umfassten die Ermittlung von Inaktivierungskinetiken und die Inaktivierung im Knochenmodell Folgestudie mit Bakterien, Pilzen und Sporen Projekt: Charité-Gewebebank, Robert-Koch-Institut (Viren), Charité-Mikrobiologie (Bakterien/Pilze/Sporen), DIZG
4 Material und Methoden Gewebespender Multiorganspender der DSO-Region Nord-Ost seronegativ für anti-hiv-1/2/go, anti-hcv, HBsAg, anti-hbcore, Treponema pallidum keine relevante Infektion oder Malignität in der Anamnese mikrobiologische Untersuchungen schlossen eine bakterielle Kontamination des Knochens aus
5 Material und Methoden Peressigsäure/Ethanol-Sterilisation (PES) Methode der Gewebebanken in Berlin (Charité, Deutsches Institut für Zell- und Gewebeersatz ggmbh) entfettete Transplantate (Chloroform/Methanol, 2 Stunden, Chloroformentfernung: Methanolspülungen im US-Bad) Peressigsäure 2%, Ethanol, reinst 96%, Aqua ad in. (2:1:1), Agitation, 200 mbar, 4 Stunden, RT Routine: validierte Entfernung der Peressigsäure mit Soerensen- Pufferspülungen (in-prozess-kontrolle: < 5 ppm PES, Freigabekriterium < 1 ppm PES, Reflectoquant-Methode)
6 Peressigsäure/Ethanol-Sterilisation Exsikkator auf Schüttler Unterdruckeinheit
7 Material und Methoden Spongiosawürfel, Viruspenetration und -nachweis entfettete Würfel aus Epiphysen, 15x15x15 mm 15 ml Virussuspension und Spongiosa im Unterdruck in Röhrchen, Virus-Penetration mittels Farbbeads validiert kontaminierter Spongiosawürfel in 50 ml Falcontube plus 15 ml PES oder Medium (innerhalb/außerhalb Exsikkator), 200 mbar, RT, 4h Virusnachweis in Überstand (Ü1-3) und Homogenat (W1-3) Ü/W auf Zielzellen, Kultur, CPE, TCID 50 /ml (log10)-berechnung
8 Spongiosawürfel-Modell für die Virusinaktivierung mit Peressigsäure/Ethanol Spongiosawürfel 15 x 15 x 15 mm
9 Material und Methoden Viren Humanes Immundefizienz-Virus Typ 2 (HIV-2) umhüllt, retroviridae, Molt 4 clone 8 cells Pseudorabies-Virus (PsR) umhüllt, herpesviridae, mink lung cells Bovines Virus Diarrhoe-Virus (BVDV) umhüllt, flaviviridae, calf lung cells Hepatitis A-Virus (HAV) nicht umhüllt, picornaviridae, embryonal rhesus monkey kidney Poliovirus Typ 1 (PV-1) nicht umhüllt, picornaviridae, human amnion cells Porcines Parvovirus (PPV) nicht umhüllt, parvoviridae, fetal porcine testis cells
10 Material und Methoden Versuchsserien (Titer) A: Ausgangsvirus Ü1: Überstand aus kont. Würfel + PES, neutralisiert mit Natriumthiosulfat Ü1/PES: Überstand aus kont. Würfel + PES, nicht neutralisiert mit Natriumthiosulfat Ü2: Überstand aus kont. Würfel + Medium, innerhalb des Exsikkators Ü3: Überstand aus kont. Würfel + Medium, außerhalb des Exsikkators W1: Überstand aus dem Homogonat (PES) W2: Überstand aus dem Homogonat (Medium, innnerhalb Exsikkator) W3: Überstand aus dem Homogonat (Medium, außerhalb Exsikkator) PES: Toxizitätsprüfung der PES auf die Zellen
11 Pseudorabies-Virus - Knochenmodell PsR-Virusinaktivierung durch PES 8 R i = 4,06 7 Virustiter log 10 TCID 50 /ml Ü1 Ü2 Ü3 Ü1PES W1 W2 W3 A PES Versuchsvariante
12 Pseudorabies-Virus - Kinetik PsR-Virusinaktivierung durch PES Virustiter log 10TCID 50/ml R i = 4,48 PsRV + Medium PsRV + PES Zeit (min.)
13 Bovines Virus Diarrhoe Virus - Knochenmodell BVDV- Virusinaktivierung durch PES 7 6 R i = 4,14 Virustiter log 10 TCID 50 /ml Ü1 Ü2 Ü3 Ü1PES W1 W2 W3 A PES Versuchsvariante
14 Bovines Virus Diarrhoe Virus - Kinetik BVDV-Virusinaktivierung durch PES Virustiter log 10TCID 50/ml R i = 4,48 BVDV + Medium BVDV + PES Zeit (min.)
15 Humanes Immundefizienz-Virus - Knochenmodell HIV-2 -Virusinaktivierung durch PES R = n/a Virustiter log 10 TCID 50 /ml Ü1 Ü2 Ü3 Ü1PES W1 W2 W3 A PES Versuchsvariante extrem hohe Toxizität der PES gegen Zielzellen, Neutralisation in Ü ohne Effekt, W1 ( 0,69), Ü1 ( 3,55) und Kinetik unter Beachtung niedriger A-Titer als Grundlage der Bewertung (Gutachten RKI, Prof. Pauli)
16 Humanes Immundefizienz-Virus - Kinetik HIV-2-Virusinaktivierung durch PES R i = 2,54 Virustiter log 10TCID 50/ml Detection limit HIV + Medium HIV + PES Zeit (min.)
17 Poliovirus - Knochenmodell Polio-Virusinaktivierung durch PES 8 7 R i = 6,27 Virustiter log 10 TCID 50 /ml Ü1 Ü2 Ü3 Ü1PES W1 W2 W3 A PES Versuchsvariante
18 Poliovirus - Kinetik Polio-Virusinaktivierung durch PES Virustiter log 10TCID 50/ml R i = 5,86 Polio + Medium Polio + PES Zeit (min.)
19 Porcines Parvovirus - Knochenmodell Parvo-Virusinaktivierung durch PES 7 R i = 4,21 6 Virustiter log 10 TCID 50 /ml Ü1 Ü2 Ü3 Ü1PES W1 W2 W3 A PES Versuchsvariante
20 Porcines Parvovirus - Kinetik Parvo-Virusinaktivierung durch PES Virustiter log 10TCID 50/ml R i = 4,30 Parvo + Medium Parvo + PES Zeit (min.)
21 Hepatitis A-Virus - Knochenmodell Hepatitis A-Virusinaktivierung durch PES 7 R i = 3,22 6 Virustiter log 10 TCID 50 /ml Ü1 Ü2 Ü3 Ü1PES W1 W2 W3 A PES Versuchsvariante Restinfektiosität -> zusätzliche Validierung der Entfettung: > 7,0 log 10 TCID 50 /ml
22 Hepatitis A-Virus - Kinetik Hepatitis A-Virusinaktivierung durch PES Virustiter log 10TCID 50/ml R i = 3,70 HAV + Medium HAV + PES Zeit (min.)
23 Zusammenfassung - Virusversuche 8 Virusinaktivierung durch PES 7 Virustiter log 10 TCID 50 /ml PsR Poliovirus Parvovirus Hepatitis A BVDV HIV-2 Viren Ausgangsvirustiter Log10 TCID50 Titer nach Behandlung mit PES (Log10 TCID50) Toxizität
24 Folgestudie (Bakterien, Pilze, Sporen) Folgestudie am Institut für Mikrobiologie und Hygiene der Charité mit dem gleichen Modell (Spongiosawürfel, 2h, 4h, Homogenat) Mikroorganismen Staphylococcus aureus (ATCC 6538) Enterococcus faecium (ATCC 6057) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Bacillus subtilis (ATCC 6633) Sporen von Bacillus subtilis (ATCC 6633) Clostridium sporogenes (ATCC 19404) Mycobacterium terrae (Charité in-house) Candida albicans (ATCC 2091) Sporen von Aspergillus niger (ATCC 16404) Ergebnis: Titerreduktion von 6 bis 8 log 10 cfu/ml bei allen Mikroorganismen, Aspergillus-Sporen > 5 log 10 cfu/ml, keine Restinfektiosität)
25 Zulassungen gemäß 21, 105 AMG
26 Herstellungserlaubnis gemäß 13 AMG
27 Publikationen
28 Publikationen Allogenic vs. autologous cancellous bone in lumbar segmental spondylodesis a randomized prospective study Michael Putzier*; Patrick Strube*, Julia Funk*, Christian Gross*, Hans-Joachim Mönig+, Carsten Perka*, Axel Pruss Submitted to Eur Spine J
29 Zusammenfassung Das Routinesterilisationsverfahren der Charité und des DIZG (1% Peressigsäure, Ethanol 96% und Aqua ad in. (2:1:1), 4h, 200 mbar, Agitation) wurde in Anlehnung an bestehende Richtlinien (DVV, BfArM/PEI, CPMP) an 3 behüllten und 3 nicht-behüllten Viren sowie an geeigneten Bakterien, Sporen und Pilzen im Knochenspongiosamodell geprüft. Es zeigte eine ausreichende viruzide Wirksamkeit gegen PsR, Polio, Parvo, BVDV und HIV-2 (>4 log 10 TCID 50 /ml und keine Restinfektiosität) sowie eine begrenzte viruzide Wirkung gegen HAV. Die zusätzliche Validierung des Entfettungsschrittes mit HAVkontaminierten Spongiosawürfeln zeigte eine Reduktion um >7 log 10 TCID 50 /ml.
30 Zusammenfassung In einer Folgestudie wurden klinisch relevanten Bakterien, Pilze und Sporen im selben Spongiosamodell geprüft. Alle eingesetzten Mikroorganismen wurden um >5 log 10 cfu/ml unter die Nachweisgrenze inaktiviert. PES-sterilisierte Knochentransplantate sind mikrobiologisch sicher und klinisch wirksam. In den bisher dokumentierten ca Knochentransplantationen wurde keine Übertragung viraler bzw. bakterieller Erreger bzw. PES-bedingte toxische Effekte berichtet.
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