Virale Vektoren Moderne Methoden der Immunologie Abteilung Virologie Institut für Medizinische Mikrobiologie & Hygiene Peter Stäheli
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1 Virale Vektoren Moderne Methoden der Immunologie Abteilung Virologie Institut für Medizinische Mikrobiologie & Hygiene Peter Stäheli
2 Virale Vektor-Systeme Wo und wann gebraucht?! Gentherapie! Vakzinierung! Exp. Ansätze Erwünschte Eigenschaften von Vektoren für Gentherapie:! Langzeit-Expression ohne Zellzerstörung! keine Immunantwort gegen Vektor oder Fremdgen-Produkt! spezifische Infektion bestimmter Zelltypen Erwünschte Eigenschaften von Vektoren für Vakzinierung:! Gute Immunantwort gegen Fremdgen-Produkt! Fulminante Kurzzeitexpression des Fremdgens mit Zytolyse! Zelltyp-Selektivität unwichtig
3 Virale Vektor-Systeme Virus Genom Spezifität Integration Titer (IE/ml) Kapazität Retroviren C-Typ Viren Lentiviren 7 kb ssrna 9 kb ssrna proliferierende Zellen +ruhendezellen ja kb Adenovirus 36 kb, dsdna viele Zelltypen nein kb Adeno-Assoziiertes Virus (AAV) 6 kb, ssdna viele Zelltypen ja (v.a. Chr. 19q) 10 8 <5 kb Herpes Simplex Virus (HSV) 150 kb, dsdna Nervenzellen nein >20 kb Pockenviren Canary pox Virus Vaccinia, MVA 200 kb, dsdna viele Zelltypen nein 10 7 >20 kb Einzelstrang RNA Viren 6-20 kb, ssrna (+ od. - Strang) viele Zelltypen nein ca. 5 kb
4 Erkrankungen die neue Impfstrategien erfordern! HIV-induzierte Immunschwäche (AIDS)! HCV-induzierte Lebererkrankung! Papillomvirus-induzierte Warzen und Tumore! Influenza! Dengue-Fieber! Ebola- & Marburg-Virus-induzierte Hämorrhagische Fieber
5 Verfügbare virale Vektoren für Vakzinierung! Adenoviren! Vaccinia-Virus und modified Vaccinia Ankara (MVA)! Gelbfiebervirus-Impfstamm! Masernvirus-Impfstamm Potenzielle Probleme: Immunität der Impflinge gegen Vektor Masernimpfstamm ist gefährlich für Immunschwache! Aviäre Pockenviren! VSV (Rindervirus, apathogen für Mensch)! Togavirus-basierende Replikone! Aviäre Paramyxoviren (Newcastle Disease Virus)
6 Adenovirus Fiberprotein (IV) Pentonbasis-Protein (III) terminales Protein (TP) Core-Proteine dsdna Genom (30-45 kb) (quasizirkulär, Pfannenstiel)!# Verpackungs- Signal : Invertiert Terminale Repeats MLTU: major late transcription unit MLTU!" E1 E3 E2 E4
7 Replikations-defiziente Adenoviren ClaI!E3!" ClaI Fremdgen MLTU Kotransfektion der Verpackungs-Zelllinie Homologe Rekombination E1-exprimierende 293 Verpackungs- Zelllinie E1a E1b Zellkern Zytoplasma Replikations-defizientes Adenovirus " da fast alle Virusproteine noch vorhanden, starke Immunantwort gegen Vektor!"!E3 Fremdgen MLTU
8 Gutless" replikations-defiziente Adenovirus Helfer-Virus!" $ amp R ori amp R ori Reporter!E1! "$ Ausgeweideter "gutless" Adenovirus-Vektor Fremdgen loxp!e3 Infektion Transfektion E1a Cre E1b Zellkern Zytoplasma!" %!E1! "$ Fremdgen loxp!e3 verpackt nicht verpackt
9 Traditionelle Vaccinia-Vektoren Vaccinia-Virus 1796 Edward Jenner infiziert 8-jährigen Jungen mit Kuhpocken und überimpft dann 2x echte Pocken: Kuhpocken vermittelten Schutz!! Impfvirus: Vacciniavirus (vacca = Kuh) Edward Jenner ( ) Komplikationen bei Pockenimpfung: ~50 pro 1 Million Erstimpfungen
10 Ungefährliche Vaccinia-Vektoren: MVA MVA = Modifiziertes Vaccinia Virus Ankara möglicher Einsatz als Vorimpfstoff für Pockenimpfung! reduziert Nebenwirkungen von Standard-Vacciniavirus! scheint Wirksamkeit der Standardimpfung nicht zu reduzieren MVA! Patienten-Isolat, serielle Passage in Hühner-Embryofiboblasten (~300x)! Repliziert gut in Hühnerzellen, aber schlecht in Säugerzellen! Virusgenom weist große Deletionen auf! Ende 70-iger Jahre in Deutschland in Gebrauch (~ Geimpfte)! Als Vorimpfung gegen Vaccinia-Impfung wieder im Gespräch
11 Herstellung rekombinanter Vaccinia-Viren Virusgenom = ~190 kb lineare ds DNA Genetische Manipulation mit Standardtechnik nicht möglich Genetische Manipulation durch In vivo-rekombination Infektion + VV-Promotor Transfektion VV-Promotor Selektion für TK-neg. mit BrdU Selektion für &-Gal positiv TK-Gen &-Gal Fremdgen... TK-Gen Targeting Plasmid TK = Thymidine-Kinase
12 Vesikuläres Stomatitis Virus (VSV) Eigenschaften! Vertreter der Rhabdoviridae! Mehrere Serotypen bekannt! Endemisch in Amerika, Indien, Iran! Infiziert Säugetiere (z.b. Rinder) und Insekten (z.b. Stechmücken)! Selten pathogen für Menschen (milde Grippe)! Hohe Prävalenz für anti-vsv Antikörper bei Menschen die in endemischen Gebieten! Nicht-segmentiertes (-)) Strang RNA-Genom! Genomgröße 12 kb! Repliziert im Zytoplasma Nukleoprotein N Phosphoprotein P Glykoprotein G Polymerase L 3' N P M G L 5' Matrixprotein M
13 Herstellung von rekombinantem VSV T7 Promotor Anti-genomische (+) Strang crna Ribozym VV-T7-Pol pt7-n Transfektion Infektion pt7-p pt7-l + 3' N P M G Fremdgen L 5'
14 HIV-Vakzine basierend auf rekombinantem VSV extrazellulär [TM] zytoplasmatisch HIV gp160 gp120 gp41 HIV gp160-g VSV-G Zytoplasmatischer Teil 3' N P M G HIV gp160-g L 5' Rose et al, 2001 Cell 106:539
15 Semliki Forest Virus (SFV) Eigenschaften:! Vertreter der Togaviridae! Endemisch in Afrika und Süd-Ostasien! Übertragung durch Stechmücken! Natürlicher Wirt: Pferde! Selten pathogen für Menschen! Genom ist (+) RNA (~12 kb)! Replikation im Zytoplasma! Infiziert viele Zelltypen
16 Semliki Forest Virus Replikon System! Replikase Gene Strukturgene! SFV Replikon Replikase Gene Fremdgen
17 SFV Replikation Replikase / Transkriptase nsp3 nsp1 nsp4 nsp2 Proteolytische Spaltung Strukturproteine nsp1 nsp2 nsp3 nsp4 E3 E2 Translation C P62 6K E1 nsp1 nsp2 nsp3 nsp4 C P62 6K E1! Replikase Gene Strukturgene Proteolytische Spaltung C P62 6K E1 Replikation Translation C P62 6K E1 3 5
18 Semliki Forest Virus Replikon System! Replikase Gene Strukturgene! SFV Replikon Replikase Gene Fremdgen Verpackungs-Konstrukte * * C p62 * 6K E1 * Protease-Schnittstelle mutiert 2A p62 6K E1 2A Protease von MKSV C
19 Verpackung des SFV-Replikons und Transduktion von Zielzellen! Replikase Gene Fremdgen Replikon C p62 ** * 6K E1 Verpackungs-Konstrukt Transfektion Amplifikation von Replikons- und Verpackungs-Konstrukt Zellkern Zellkern Virale Transduktion! ** Virus-Aktivierung durch Chymotrypsin 3! Amplifikation des Replikons 5 Vektor-produzierende Zelle Zielzelle! nicht-gespaltenes Spike-Protein Replikase Gene Fremdgen
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