Seminarblock F: DNA Replikation und Reparatur

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1 Seminarblock F: DNA Replikation und Reparatur 1.) Erläutern Sie die Strukturen von DNA und RNA und nennen Sie die Unterschiede zwischen DNA und RNA. DNA: Die DNA in Zellen existiert nicht als einzelner Polynukleotidstrang, sondern besteht aus zwei Polynukleotidmolekülen, die sich nach bestimmten Gesetzmäßigkeiten aneinander lagern. Einzelstränge gibt es nur kurzfristig und über kurze Abschnitte während der Replikation oder der Transkription. Ausnahmen sind wieder einmal einige Viren, deren Genom aus einzelsträngiger DNA besteht. Bei Analysen der Basenzusammensetzungen der DNA aus verschiedenen Organismen ergab sich folgende als Chargaff Regel bekannte Tatsache: Die Anzahl der Adenine ist gleich der Anzahl der Thymine (A = T) und die Anzahl der Guanine ist gleich der Anzahl der Cytosine (G = C). Oder anders formuliert: Die Summe der Purine (A + G) entspricht der Summe der Pyrimidine (T + C). Dies gilt für alle untersuchten Organismen, während der GC Gehalt sehr davon abhängt, aus welcher Quelle die DNA stammt. Die Basen, die sich in den beiden Einzelsträngen gegenüberliegen und miteinander Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden, nennt man komplementäre Basen. Es sind: Adenin und Thymin (zwei Wasserstoffbrücken) Guanin und Cytosin (drei Wasserstoffbrücken) Aufgrund der festen Basenpaarung ergibt sich die Basensequenz des einen DNA Stranges aus der des anderen: die DNA Einzelstränge sind komplementär. Die Basenpaarung spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Replikation und der Transkription. Die Einzelstränge sind antiparallel angeordnet, d.h. das 5' Ende des einen Strangs liegt dem 3' Ende des anderen gegenüber und umgekehrt. Die Einzelstränge liegen nicht einfach in einer Ebene, sondern verdrillen sich schraubenartig zu einer Doppelhelix, wobei die hydrophoben Basen innen, die Zuckerringe und die negativ geladenen Phosphodiesterbrücken als Rückgrat hingegen außen liegen. DNA Doppelhelices können verschiedene Konformationen einnehmen, von denen die B Konformation die Häufigste und Wichtigste ist. In dieser Konformation dreht die DNA Doppelhelix nach rechts und hat einen Duchmesser von etwa 2 nm. Der Abstand zwischen zwei benachbarten Basen beträgt 0,34 nm, der Drehungswinkel der benachbarten Basenpaare 36 Grad. Das ergibt pro Umdrehung 10 Basenpaare und eine Hubhöhe von 3,4 nm. Die planaren Basen liegen horizontal übereinander und können durch diese Stapelung ( stacking energy ) die Konformation der Doppelhelix zusätzlich stabilisieren. Annähernd sieht die DNA wie eine verdrillte Strickleiter mit den Basen als Sprossen aus. Die vertikalen Abstände zwischen den beiden Einzelsträngen der DNA sind nicht gleich groß, so dass eine kleine und eine große Furche entstehen. RNA: Im Gegensatz zur DNA liegt die RNA in der Regel als einzelsträngiges Polynukleotid vor. Allerdings sind intramolekulare Basenpaarungen möglich und kommen bei einigen RNA Typen in hohem Maße vor. Bereiche intramolekularer Basenpaarungen bilden eine Doppelhelix in A Konformation. Diese weist geringe Unterschiede zur üblichen B Konformation der DNA Doppelhelix auf. Die Ausbildung ausgeprägter Sekundärstrukturen ist möglich. Durch zusätzliche Modifikationen der Basen, z. B. Methylierungen, wird die Variationsbreite der chemischen und physikalischen Eigenschaften der RNA Moleküle weiter erhöht, so dass sich komplexe dreidimensionale Strukturen analog zu den Tertiärstrukturen der Proteine entwickeln können.

2 2.) Definieren Sie die Phasen des eukaryontischen Zellzyklus. Der Zellzyklus wird in vier Phasen eingeteilt: G1 Phase S Phase G2 Phase Mitose (M Phase) G1, S und G2 Phase werden auch als Interphase zusammengefasst. Manche Zellen treten im Anschluss an die Mitose in die G0 Phase (Ruhezustand) ein. Auslöser für den Eintritt in die G0 Phase ist das Erreichen eines bestimmten Differenzierungsgrades, eine niedrige Konzentration von Wachstumsfaktoren oder eine hohe Populationsdichte. In der G0 Phase findet keine Neubildung von Zellen mehr statt, die Zellen haben jedoch einen akiven Stoffwechsel. Dieser Zustand kann sehr lange anhalten oder auch dauerhaft sein. Manche dieser Zellen können auf bestimmte Wachstumssignale hin wieder in die G1 Phase eintreten. In der G1 Phase wächst die Zelle und synthetisiert die Proteine, die für die Verdopplung des Genoms in der nächsten Phase erforderlich sind, z. B. die Bausteine der Mikrotubuli der Mitose(= Kernteilungs)spindel, a und ß Tubulin. Dies dauert im Mittel zwischen 3 und 12 Stunden. In der nachfolgenden S Phase (S = Synthese) wird die DNA repliziert. Es wird also eine komplette Kopie des Genoms hergestellt. Jedes Chromosom besteht nun aus zwei Schwesterchromatiden, die am Kinetochor zusammenhängen. Das Zentriol, der Ausgangspunkt der Mitosespindel, teilt sich. Diese Phase dauert etwa 8 12 Stunden. Die G2 Phase dient der Vorbereitung der Mitose. Es werden verstärkt RNA Moleküle und zellteilungsspezifische Proteine synthetisiert. Außerdem werden die neu synthetisierten DNA Stränge auf Fehlpaarungen kontrolliert und gegebenenfalls repariert. Die mittlere Dauer der G2 Phase beträgt 1,5 3 Stunden. Die Mitose ist die eigentliche Zellteilung. Sie wird aufgeteilt in Prophase Metaphase Anaphase Telophase In der Prophase kondensiert sich das Chromatin, so dass die Chromosomen sichtbar werden. Der Spindelapparat beginnt sich ausgehend von den Zentriolen her auszubilden, die sich an den entgegengesetzten Polen der Zelle befinden. Der Nukleolus ist nicht mehr erkennbar und die Kernmembran beginnt sich aufzulösen. In der Metaphase heften sich die Mikrotubuli der Mitosespindel an die Kinetochoren der Chromosomen an. Die Chromosomen richten sich an der Äquatorialebene aus. Die Kernmembran hat sich komplett aufgelöst. In der Anaphase teilen sich die Zwei Chromatiden Chromosomen in Ein Chromatid Chromosomen, die wiederum durch den Spindelapparat zu den entgegengesetzten Polen der Zelle transportiert werden. Es gelangt also jeweils eine Kopie des Genoms in eine der Zellhälften. In der Telophase entwickeln sich neue Kernmembranen um die Chromosomen in den beiden Zellhälften. Die Chromosomen dekondensieren und die Nukleoli bilden sich neu. Der Spindelapparat löst sich auf. Die Zelle wird nun durch eine Zytoplasmamembran in zwei Tochterzellen geteilt (Zytokinese). Die Mitose dauert etwa 0,5 1 Stunde. 3.) Wie viele dttp Moleküle werden für die vollständige Replikation des humanen Genoms und des E. coli Genoms benötigt? Wie viele Moleküle Pyrophosphat werden freigesetzt?

3 4.) Was unterscheidet die Replikation von der Transkription? In welchen Zellzyklusphasen finden diese Vorgänge statt? Replikation: Duale Reihe Seite Transkription: Duale Reihe Seite ) An welcher Stelle der DNA beginnt die DNA Replikation? Nenne Sie die ersten Ereignisse der Initation bevor die Replikationsgabel ausgebildet wird. Die Replikation beginnt bei Eu und Prokaryonten an einem durch die DNA Sequenz definierten Startpunkt, dem Origin of Replication (ori). Hier werden die beiden DNA Stränge voneinander getrennt, wodurch eine so genannte Replikationsgabel entsteht. An den beiden Zinken der Gabel, den Einzelsträngen, beginnt die Replikation, in deren Verlauf sich die Replikationsgabel vom ori wegbewegt. Je nachdem, ob sich von einem ori eine Replikationsgabel oder zwei Replikationsgabeln wegbewegen, erfolgt die Replikation uni oder bidirektional. Die uni direktionale Replikation ist ein Sonderfall bei Prokaryonten (z.b. bei Rolling Circle Replikation). Bei Eukaryonten und im Regelfall bei Prokaryonten findet die Replikation bidirektional statt. Dabei bewegen sich die beiden Replikationsgabeln in entgegengesetzter Richtung. Sie erreichen bei einem eukaryontischen linearen DNA Molekül den Rand des Moleküls, beim prokaryontischen zirkulären DNA Molekül treffen sie sich. Ein DNA Abschnitt, der von einem ori aus repliziert wird, heißt Replikon. Das prokaryontische Chromosom besitzt nur einen ori, eukaryontische Chromosomen dagegen weisen mehrere oris, d.h. mehrere Replikons auf. Die Replikation des Genoms einer menschlichen Zelle erfordert ca Replikons. Die Existenz zahlreicher Replikons verkürzt die Dauer der Replikation: Gäbe es nur einen ori pro Chromosom, würde eine bidirektionale Replikation bei einer duchschnittlichen Chromosomenlänge von 1,4 x 10 8 bp und einer Synthesegeschwindigkeit von ca. 50 Nukleotiden pro Sekunde 16 Tage dauern. Tatsächlich dauert die S -Phase 8 12 Stunden. Der Ablauf der Replikation kann man in folgende Phasen einteilen: Erkennung des ori (Prokaryonten) bzw. der oris (Eukaryonten) Trennung der DNA Stränge Synthese der Primer Synthese der DNA Tochterstränge. Hierbei entstehen an einem der beiden Elternstränge DNA Fragmente, sog. Okazaki Fragmente Die Primer werden entfernt und die Lücken zwischen den Okazaki Fragmenten aufgefüllt Verknüpfung (Ligation der Einzelstrangbrüche) der Okazaki Fragmenten An den Enden eukaryontischer, d.h. linearer Chromosomen entsteht am 5' Ende jedes neu synthetisierten Tochterstranges durch Entfernen des Primers ein Problem: Für die DNA Polymerasen steht kein freies 3' OH Ende mehr zur Verfügung, so dass die vom Primer hinterlassene Lücke nicht gefüllt, das Chromosomen Ende also nicht repliziert werden kann. Ereignisse der Initation bevor die Replikationsgabel ausgebildet wird: Diese Vorgänge sind im Folgenden für Prokaryonten beschrieben. Das Initationsprotein DnaA bindet an die DNA Sequenz des ori. Dann wird die Doppelhelix durch

4 die ATP abhängige Helikase DnaB entwunden. Anschließend trennt das Enzym die DNA Stränge, indem es an einem Strang entlangwandert und dabei den Komplementärstrang verdrängt. So entsteht auch eine Replikationsgabel. 6.) Was ist eine Replikationsgabel und was geschieht dort als erstes? Die Replikation beginnt bei Eu und Prokaryonten an einem durch die DNA Sequenz definierten Startpunkt, dem Origin of Replication (ori). Hier werden die beiden DNA Stränge voneinander getrennt, wodurch eine so genannte Replikationsgabel entsteht. An den beiden Zinken der Gabel, den Einzelsträngen, beginnt die Replikation, in deren Verlauf sich die Replikationsgabel vom ori wegbewegt. Je nachdem, ob sich von einem ori eine Replikationsgabel oder zwei Replikationsgabeln wegbewegen, erfolgt die Replikation uni oder bidirektional. Die unidirektionale Replikation ist ein Sonderfall bei Prokaryonten (z.b. bei Rolling Circle Replikation). Bei Eukaryonten und im Regelfall bei Prokaryonten findet die Replikation bidirektional statt. Dabei bewegen sich die beiden Replikationsgabeln in entgegengesetzter Richtung. Sie erreichen bei einem eukaryontischen linearen DNA Molekül den Rand des Moleküls, beim prokaryontischen zirkulären DNA Molekül treffen sie sich. Ein DNA Abschnitt, der von einem ori aus repliziert wird, heißt Replikon. Das prokaryontische Chromosom besitzt nur einen ori, eukaryontische Chromosomen dagegen weisen mehrere oris, d.h. mehrere Replikons auf. Die Replikation des Genoms einer menschlichen Zelle erfordert ca Replikons. Die Existenz zahlreicher Replikons verkürzt die Dauer der Replikation: Gäbe es nur einen ori pro Chromosom, würde eine bidirektionale Replikation bei einer duchschnittlichen Chromosomenlänge von 1,4 x 10 8 bp und einer Synthesegeschwindigkeit von ca. 50 Nukleotiden pro Sekunde 16 Tage dauern. Tatsächlich dauert die S -Phase 8 12 Stunden. 7.) Welche Funktion haben Topoisomerasen und in welche Klassen werden sie eingeteilt? Um sich zu entwinden, rotiert der vor der Replikationsgabel liegende Abschnitt der Doppelhelix. Die notwendige Umdrehungsgeschwindigkeit hängt von der Syntheserate ab. Da die DNA Syntheserate bei Eukaryonten 50, bei Prokaryonten 500 Nukleotide pro Sekunde beträgt, rotiert die Doppelhelix bei Eukaryonten mit 5, bei Prokaryonten sogar mit 50 Umdrehungen. Wenn das gesamte Chromosom rotieren müsste, wäre der Eneriebedarf erheblich und es käme zu bedeutenden Torsionsspannungen. Dies verhindern bei Pro und Eukaryonten spezifische Enzyme, die Topoisomerasen, indem sie superspiralisierte DNA entspiralisieren oder die räumliche Struktur der superspiralisierten DNA verändern. Toposiomerasen sind bei allen Vorgängen wichtig, bei denen es zur Verdrillungen der DNA kommen kann. Dazu zählen Replikation, Transkription, Rekombination (Austausch gentischen Materials zwischen zwei DNA Molekülen) und Chromatinumordnungen. Die Topoisomerasen werden in zwei Gruppen eingeteilt: Typ I Topoisomerasen (Topoisomerase I) entspiralisieren superspiralisierte DNA. Da dieser Vorgang thermodynamisch günstig verläuft, muss kein ATP aufgewendet werden. Typ I Topoisomerasen spalten einen DNA Einzelstrang, indem die OH Gruppe eines Tyrosinrestes des Enzyms eine Phosphatgruppe des DNA Rückgrates nukleophil angreift. Dadurch entsteht am DNA Strang eine 3' OH Gruppe, am Enzym ein Phosphotyrosylrest, und das Enzym wird kovalent an den DNA Strang gebunden. Dieser DNA Strang kann nun um den zweiten Strang rotieren, wobei Torsionsspannungen abgebaut werden. Abschließend greift die 3' OH Gruppe der DNA den Phosphotyrosylrest des Enzyms an. Der Strangbruch wird wieder geschlossen, und das Enzym wird freigesetzt. Typ II Topoisomerasen (Topoisomerase II) verändern die räumliche Struktur der DNA Doppelhelix. Dazu spalten sie unter ATP Verbrauch vorübergehend beide DNA -Stränge. Durch die entstandene Lücke wird ein anderer Abschnitt der Doppelhelix hindurchgefädelt. 8.) Warum sind Topoisomerasen geeignete Zielstrukturen für die Krebstherapie? Gibt es

5 weitere Therapie relevante Zielstrukturen bei der DNA Replikation? Topoismerase I: Diese wird gehemmt durch Camptothecin, Topotecan und Irinotecan. Diese Zytostatika stabilisieren die DNA gebundenen Form der menschlichen Topoisomerase Typ I. Topoisomerase II: Hemmstoffe der Topoisomerase II führen in Krebszellen zu DNA Strangbrüchen und leiten die Apoptose sein, sind aber daher nicht direkt zytotoxisch. Die Replikation kann entweder durch Zytostatika oder Antibiotika gehemmt werden. Diese Medikamente sind ausschlaggebend: Substanzklasse: Gyrasehemmer Substanz: Ciprofloxacin, Nalidixinsäure, Novobiocin Wirkungsmechanismus: Hemmung der bakteriellen Topoisomerase Typ II (= Gyrase) Einsatzgebiet: Antibiotikum Substanzklasse: Topoisomerase Typ I - Hemmer Substanz: Camptothecin, Topotecan, Irinotecan Wirkungsmechanismus: stabilisieren die DNA gebundenen Form der menschlichen Topoisomerase Typ I Einsatzgebiet: Zytostatikum Substanzklasse: Nukleosidanaloga Substanz: Cytosinarabinosid Wirkungsmechanismus: Hemmung der DNA - Polymerase Einsatzgebiet: Zytostatikum Substanzklasse: Nukleinsäure quervernetzende Substanzen Substanz: Mitomycin C Wirkungsmechanismus: kovalente Bindung an DNA, DNA Strangtrennung wird verhindert, führt zu Strangbrüchen Einsatzgebiet: Zytostatikum Substanzklasse: Nukleinsäure bindende Substanzen Substanz: Actinomycin D Wirkungsmechanismus: interkalieren in GC reiche Abschnitte der DNA Einsatzgebiet: Zytostatikum 9.) Beschreiben Sie den Ablauf der Replikation mit den für diesen Vorgang notwendigen Enzymen für den Leitstrang und für den Folgestrang. Definieren Sie die Unterschiede. DNA Polymerasen synthetisieren jeweils einen zum Elternstrang komplementären DNA Tochterstrang, indem sie dntps an das freie 3' OH Ende der Primer anhängen. Die beiden Elternstränge sind antiparallel angeordnet: Der eine Strang weist eine 3' 5' Orientierung auf, der andere eine 5' 3' Orientierung. Am 3' 5' Elternstrang entspricht die DNA Syntheserichtung der Wanderungsrichtung der Replikationsgabel, so dass er an einem Stück repliziert werden kann. Der kontinuierlich wachsende Tochterstrang wird als Leitstrang bezeichnet. Am 5' 3' Elternstrang dagegen ist die DNA Syntheserichtung der Wanderungsrichtung der Replikationsgabel entgegengesetzt. Der zugehörige Tochterstrang, der sog. Folgestrang, wird diskontinuierlich in kurzen Stücken synthetisiert, welche Okazaki Fragmente genannt werden. Die Länge dieser Fragmente hängt vom Zelltyp ab und beträgt bei Eukaryonten einige hundert Nukleotide, bei Prokaryonten bis zu zweitausend Nukleotide.

6 Bei Prokaryonten erfolgt die DNA Synthese bis hierher ausschließlich durch die DNA Polymerase III. Bei Eukaryonten beginnt die DNA Polymerase α mit der DNA Synthese (nachdem die Untereinheit mit der Primase Funktion den Primer synthetisiert hat). Weist der Tochterstrang ca. 20 Nukleotide auf, verdrängt der Proteinreplikationsfaktor C (RFC) zusammen mit dem Kernantigen proliferierender Zellen (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) die DNA Polymerase α und bindet anschließend die DNA Polymerase δ, die die DNA Synthese fortsetzt. Die Synthesegeschwindigkeit ist im Vergleich zu der der Prokaryonten etwa um den Faktor 10 geringer; wahrscheinlich wird die Bewegung der DNA Polymerasen durch die Nukleosomen behindert. Zwischen den Okazaki Fragmenten klaffen noch Lücken. Diese werden gefüllt und anschließend die Primer entfernt (auch der Primer am Leitstrang). Beide Aufgaben erledigt ein Enzym, das neben seiner DNA Polymerase Aktivität 5' 3' Exonuklease Aktivität besitzt. Dies ist bei Prokaryonten die DNA Polymerase I (bei Eukaryonten ist diese Polymerase noch unbekannt). Anschießend füllt diese Polymerase die Primer Lücken auf. Die einzelnen Okazaki Fragmente sind dann allerdings noch nicht kovalent miteinander verbunden. Bei Eukaryonten werden die Primer durch eine Ribonuklease H abgebaut. Leitstrang: die Biosynthese am Leit oder auch Führungsstrang kann kontinuierlich verlaufen, da sich die DNA Polymerase III in 3' 5' Richtung genau auf die sich öffnende Replikationsgabel zu bewegt die Ableserichtung des Leitstranges entspricht also der Bewegungsrichtung der Replikationsgabel die DNA Polymerase III synthetisiert den neuen DNA Strang ausgehend vom RNA Primer (Startstelle für Replikation) in 5' 3' Richtung Folgestrang: die Biosynthese am Folge oder auch Verzögerunsstrang ist etwas komplizierter und kann nicht kontinuierlich erfolgen die Replikationsgabel bewegt sich am Folgestrang in 5' 3' Richtung daraus ergibt sich jedoch ein Problem, da die DNA Polymerasen nicht in 3' 5' Richtung synthetisieren können also synthetisiert die DNA Polymerase III vom RNA Primer ausgehend immer nur kurze DNA Abschnitte in 5' 3' Richtung (Okazaki Fragmente) nach dem Einbau von Nukleotiden bricht die Synthese des Fragments ab und ein weiteres Fragment wird an einem neuen RNA Primer begonnen nun müssen noch die RNA Primer aus dem neu synthetisierten DNA Strang entfernt werden das erfolgt durch die DNA Polymerase I, die außerdem die entstandenen Lücken durch DNA Nukleotide ersetzt die DNA Ligase verbindet die einzelnen Okazaki Fragmente miteinander dafür ist die Hydrolyse von ATP notwendig 10.) In welche Richtung wird der neu synthetisierte DNA Strang ausschließlich synthetisiert und warum? Im Rahmen der DNA Replikation synthetisieren DNA Polymerasen den Tochterstrang, indem sie die Basenfolge des Elternstrangs ablesen und Nukleotide, die hierzu komplementäre Basen enthalten, miteinander verknüpfen. Die DNA Polymerasen bewegen sich auf dem Elternstrang während des Ablesens in 3' 5' Richtung. Sie lesen den Elternstrang folglich so, wie man ein Buch liest: erst Seite 3, dann Seite 5. Diese Leserichtung gilt für alle Polymerasen. Da Eltern und Tochterstrang wächst der neue Strang in 5' 3' Richtung: Polymerasen synthetisieren Nukleinsäuren also in 5' 3' Richtung.

7 Also: DNA Polymerasen lesen den Elternstrang in 3' 5' Richtung und synthetisieren den Tochterstrang in 5' 3' Richtung. 11.) Definieren Sie die verschiedenen DNA Polymerasen aus E. coli und aus humanen Zellen. Welche Funkionen können ihnen zugeordnet werden? DNA Polymerasen synthetisieren jeweils einen zum Elternstrang komplementären DNA Tochterstrang, indem sie dntps an das freie 3' OH Ende der Primer anhängen. Die beiden Elternstränge sind antiparallel angeordnet: Der eine Strang weist eine 3' 5' Orientierung auf, der andere eine 5' 3' Orientierung. Am 3' 5' Elternstrang entspricht die DNA Syntheserichtung der Wanderungsrichtung der Replikationsgabel, so dass er an einem Stück repliziert werden kann. Der kontinuierlich wachsende Tochterstrang wird als Leitstrang bezeichnet. Am 5' 3' Elternstrang dagegen ist die DNA Syntheserichtung der Wanderungsrichtung der Replikationsgabel entgegengesetzt. Der zugehörige Tochterstrang, der sog. Folgestrang, wird diskontinuierlich in kurzen Stücken synthetisiert, welche Okazaki Fragmente genannt werden. Die Länge dieser Fragmente hängt vom Zelltyp ab und beträgt bei Eukaryonten einige hundert Nukleotide, bei Prokaryonten bis zu zweitausend Nukleotide. Bei Prokaryonten erfolgt die DNA Synthese bis hierher ausschließlich durch die DNA Polymerase III. Bei Eukaryonten beginnt die DNA Polymerase α mit der DNA Synthese (nachdem die Untereinheit mit der Primase Funktion den Primer synthetisiert hat). Weist der Tochterstrang ca. 20 Nukleotide auf, verdrängt der Proteinreplikationsfaktor C (RFC) zusammen mit dem Kernantigen proliferierender Zellen (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) die DNA Polymerase α und bindet anschließend die DNA Polymerase δ, die die DNA Synthese fortsetzt. Die Synthesegeschwindigkeit ist im Vergleich zu der der Prokaryonten etwa um den Faktor 10 geringer; wahrscheinlich wird die Bewegung der DNA Polymerasen durch die Nukleosomen behindert. Zwischen den Okazaki Fragmenten klaffen noch Lücken. Diese werden gefüllt und anschließend die Primer entfernt (auch der Primer am Leitstrang). Beide Aufgaben erledigt ein Enzym, das neben seiner DNA Polymerase Aktivität 5' 3' Exonuklease Aktivität besitzt. Dies ist bei Prokaryonten die DNA Polymerase I (bei Eukaryonten ist diese Polymerase noch unbekannt). Anschießend füllt diese Polymerase die Primer Lücken auf. Die einzelnen Okazaki Fragmente sind dann allerdings noch nicht kovalent miteinander verbunden. Bei Eukaryonten werden die Primer durch eine Ribonuklease H abgebaut. DNA Polymerasen E. coli: Bezeichnung Aufbau Biochemische Funktion Funktion in der Zelle DNA-Polymerase I 1 Untereinheit 928 Aminosäuren 103 Kilodalton (kda) DNA-Polymerase 3' - 5' -Exonuclease 5'-3'-Exonuclease Entfernung von RNA-Primer; Reparatur von DNA - Schäden DNA-Polymerase II 88 kda DNA-Polymerase Reparatur DNA-Polymerase III 10 Untereinheiten (ca. 900 kda) DNA-Polymersae Replikations - Polymerase

8 DNA Polymerasen Human: DNA- Polymerase katalytische Untereinheit andere Untereinheiten 3'-5'- Exonuclease Hauptfunktion α 180 Kilodalton (kda) 86 kda 58 kda 48 kda nein Komplex mit Primase, Synthese kurzer DNA-Stücke β 40 kda keine nein Reparatur von DNA γ 125 kda 50 kda ja mitochondriale DNA - Replikation δ 125 kda 53 kda ja Replikation, Reparatur ε 200 kda mehrere ja Replikation, Reparatur 12.) Vergleichen Sie die im Zellkern ablaufende DNA Replikation mit einer in vitro ablaufenden PCR Reaktion. Welche Gemeinsamkeiten und Unterschiede gibt es Hinblick auf beteiligte Faktoren, Mechanismen und Produkte? Replikation: Duale Reihe Seite PCR: Duale Reihe Seite ) Wie wurde der erste experimentelle Nachweis einer semikonservativen Replikation erbracht? Die Biologen Matthew Meselson und Franklin Stahl entwickelten 1985 einen Versuch, mit dem sich nachweisen lässt, dass die Replikation der DNA semikonservativ ist. Dies bedeutet, dass das Erbgut der Tochterzelle nach der Zellteilung zur Hälfte aus Erbinformationen der Mutter und zur Hälfte neu synthetisiert wird. Neben der semikonservativen Replikation wurden vorher auch Hypothesen von der konservativen und der dispersen Replikation diskutiert: Konservative Replikation: es wird lediglich eine Kopie der der Mutter DNA erzeugt eines der Tochter Moleküle ist dann identisch mit der Mutter DNA das zweite Tochter Molekül ist dann neu gebildet worden Disperse Replikation: auch hier ist in jeder Tochter DNA die Hälfte der Mutter DNA die andere Hälfte wird durch neue Nukleotide ersetzt Experimentdurchführung: die Forscher züchteten Bakterien auf einem Nährboden, welcher ein Stickstoffisotop der Masse

9 15u enthielt anschließend wurden Bakterien dieses Stammes auf ein Nährmedium mit einem Stickstoffisotop der Masse 14u gegebenenfalls Auswertung: es wurden Bakterien der F1 Generation entnommen ihr Erbgut wurde einer Dichtegradientenzentrifugation unterstellt es stellte sich heraus, dass die Sedimentationsebene der Bakterien DNA zwischen den Referenzebenen von DNA, die nur 14u bzw. 15u enthielt, lag konservative Theorie konnte somit ausgeschlossen werden, da sonst 2 Sedimentationsebenen auf Höhe der Referenzebenen hätten entstehen müssen um zu entscheiden, ob nun die semikonservative oder die disperse Theorie stimmte, wurde der Vorgang mit Individuen der F2 Generation wiederholt es stellte sich heraus, das das Bakteriengut zur Hälfte in der Ebene der F1 Generation und zur Hälfte in der 14u Referenzebene sedimentierte semikonservative Theorie stimmte, da sich bei einer dispersen Replikation das gesamte Sediment zwischen F1 Ebene und der 14u Ebene hätte ablagern müssen 14.) Wie können Sie die DNA Synthese experimentell in Zellen nachweisen und wie von der RNA Synthese unterscheiden? Unterschiede der beiden Synthesearten: die DNA verwendet bei der Synthese DNA Polymerasen, die RNA verwendet die RNA Polymerasen die DNA enthält Desoxyribonukleotide, die RNA enthält die Ribonukleotide in der DNA wird Thymidin eingebaut und in der RNA stattdessen Uridin die DNA benötigt einen Primer zu Beginn der Replikation, die RNA benötigt keinen Primer, jedoch einen Promotor, über den via Transkriptionsfaktoren gebunden wird

10 Experimentelle Unterscheidung: Überprüfung des Einbaus radioaktiver Nukleotide (Nachweis RNA/ DNA: Einbau von Thymin bzw. Uracil) Vergleich von Replikation und Transkription: DNA Replikation: benötigt eine Helikase, Topoisomerase, SSB -> eine Replkationsgabel entsteht Polymerase α (besitzt Primase und DNA Polymerase Aktivität) Polymerase δ (DNA Polymerase) Polymerasen ß und e (DNA Polymerasen) benötigt eine DNA Ligase Cofaktoren der DNA Polymerasen sind datp, dttp, dctp und Mg 2+ Besonderheiten sind die DNA Verdopplung und die Qualitätssicherung Transkription: benötigt eine Helikase, Topoisomerase, SSB -> eine Transkriptionsblase entsteht keine Primase RNA Polymerase (I,II, III) keine Reparaturenzyme vorhandenen keine Ligase vorhanden Cofaktoren der DNA Polymerasen sind ATP, UTP, GTP, CTP und Mg 2+ Besonderheiten sind Regulation über Promotor und Enhancer und die Verdopplung eines bestimmten DNA Bereiches 15.) Wie kann man erklären, dass die Verdopplungszeit eines Bakteriums kürzer ist als die erwartete Zeit einer DNA Replikation? 16.) Die Fehlerquote der Replikation ist sehr klein: Welche Enzyme der Replikation helfen, Fehler bei der Replikation zu vermeiden und wie? 17.) Welche Strahlenwirkungen können zu DNA Beschädigungen/ Mutationen führen und wie wirken diese? Energiereiche elektromagnetische Strahlen (UV, Röntgen und gamma Strahlung) und Teilchenstrahlung (alpha, beta, Protonen und Neutronenstrahlung) lösen Elektronen aus dem Molekülverband, wobei Kationen entstehen, die chemische Folgereaktionen auslösen. UV Strahlung wird von den Nukleinsäuren absorbiert (DNA hat ein Absorptionsmaximum bei 260 nm) und führt zur Dimerisierung benachbarter Pyrimidinreste. In einem Strang benachbarte Thyminreste können kovalent verknüpft werden und bilden ein Cyclobutan Addukt. Die

11 entstandenen Thymindimere passen sterisch nicht in die Doppelhelix und behindern die Genexpression und Replikation. Radioaktive Strahlung schädigt die DNA direkt, indem sie Einzel und Doppelstrangbrüche hervorruft indirekt, indem sie die Bildung freier Sauerstoffradikale induziert, die DNA Schäden auslösen 18.) Welche chemischen Einflüsse können zu DNA Beschädigungen/ Mutationen führen und wie wirken diese? Folgende chemische Mutationen sind mutagen: Desaminierung Alkylierung Einbau von Basenanaloga Interkalierung Oxidation Desaminierung: Wird durch Nitrit oder salpetrige Säure begünstigt. Alkylierung: Methyl oder Ethylgruppenübertragungen, die z.b. durch Dimethylsulfat, Dimethylphosphat, Dimethylnitrosamin oder Stickstoff Lost Derivate verursacht werden, führen zu einer Veränderung der Basenpaarung in den resultierenden Produkten. 6 O Methylguanin paar beispielsweise nicht mit Cytosin, sondern mit Thymin. Dies führt in der folgenden Replikation zu einer Substitution, ein GC Paar wird durch ein AT Paar ersetzt. Einbau von Basenanaloga: Werden Basenanaloga in die DNA eingebaut, so steigt die Wahrscheinlichkeit von Replikationsfehlern. Beim 5 Bromuracil ist die Methylgruppe des Thymins durch ein Bromatom ersetzt. Das Gleichgewicht der Keto Enol Tautomerie wird zu Gunsten der Enolform verschoben, die eine dritte H Brücke ausbildet und somit statt mit Adenin mit Guanin paart. Dies führt dann in folgenden Replikationen zu Basensubstitutionen. Interkalierung: Zu den interkalierenden Substanzen zählen z.b. Acridinfarbstoffe, die große planare Ringsysteme besitzen. Diese Strukturen können sich zwischen zwei benachbarte Basen in die DNA drängen und verlängern so das Molekül. Bei der Replikation kommt es dann zu einer Insertion einer Base. Dadurch entstehen Leserasterverschiebungen. Oxidation: Reaktive Sauerstoffspezies (reactive Oxygen Species, ROS), die entweder endogen durch Nebenreaktionen der Atmungskette oder durch radioaktive Strahlung entstehen, können neben anderen Makromolekülen (Lipide, Proteine) auch die DNA angreifen. Ein mögliches Produkt ist 8 Oxo Guanin, das eine Basenpaarung mit Adenin eingehen kann. 19.) Warum ist es sinnvoll, dass Thymin und nicht Uracil Bestandteil der DNA ist? DNA und RNA haben unterschiedliche Basen und das hat seinen Sinn. Das Thymin ist sehr wichtig für das DNA-Reparatursystem. Wäre auch in der DNA Uracil, könnte das Reparatursystem nicht erkennen, ob das Uracil die ursprüngliche Base ist, oder ob es sich um das Produkt eines desaminierten Cytosins also um einen Fehler handelt, der korrigiert werden muss.

12 20.) Erläutern Sie die Ketol Enol Tautomerie der DNA und wie kann sie zur Entstehung von Mutationen beitragen? Basen liegen in einem Gleichgewicht zwischen Keto und Enolform (Keto Enol Tautomerie) bzw. Amino und Imino Form vor. Der Anteil der Keto bzw. Iminoform liegt bei 10-4 bis Diese Tautomere können unübliche Basenpaarungen bilden (z.b. T G oder A C Paarung) und sind damit Ursache von Replikationsfehlern. Adenin bildet in der Iminoform mit Cytosin anstatt mit Thymin ein korrespondierendes Basenpaar. Durch diese atypische AC Basenpaarung wird bei der folgenden Replikation eine AT und eine GC Basenpaarung in den Tochtersträngen entstehen. Tautomere Formen können also Substitutionen verursachen (Punktmutation). 21.) Was ist der Unterschied zwischen Punktmutationen und Rasterschub Mutationen? Welche Auswirkungen haben diese Mutationen?

13 Punktmutation: Eine Genmutation ist eine Änderung der Struktur eines einzelnen Gens. Prinzipiell unterscheidet sie sich nicht von einer Chromosomenmutation, es ist lediglich ein kleineres Segment der DNA betroffen. Betrifft die Mutation einzelne Basen eines Gens, so spricht man von einer Punktmutation. Formen: Substitution: Austausch einer Base. Dies ist die häufigste Form der Genmutation; wird ein Pyrimidin gegen ein Pyimidin oder ein Purin gegen ein Purin ausgetauscht, so nennt man dies Transition, diese Form des Austausches kommt am Häufigsten vor; beim Austausch eines Pyrimidins gegen ein Purin oder umgekehrt spricht man von Transversion. Insertion: Einfügen einer oder mehrerer Basen Deletion: Verlust einer oder mehrerer Basen Auswirkungen von Substitutionen: Da die Anzahl der Basen gleich bleibt, hat eine Substitution keinerlei Auswirkung auf das Leseraster. Der Einfluss von Mutationen auf den Phänotyp kann sehr unterschiedlich sein und hängt davon ab, wo diese Mutation aufgetreten ist. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes Muss sich der Phänotyp nicht zwangsläufig ändern. In vielen Fällen, in denen die dritte Position eines Codons betroffen ist, hat die Mutation keinen Effekt auf die Aminosäuresequenz eines Proteins, da oft die ersten beiden Positionen eines Codons entscheiden, welche Aminosäure kodiert wird und deshalb die gleiche Aminosäure wie vorher eingebaut wird (stille = neutrale = synonyme Mutation, silent mutation). Wird eine Aminosäure verändert (Missense Mutation), so hängt der Effekt auf die Funktion des betroffenen Proteins u.a. davon ab, ob sich die Eigenschaften dieser Aminosäure sehr von denen der ursprünglichen Aminosäure unterscheidet. Der Austausch einer aliphatischen Aminosäure gegen eine andere aliphatische Aminosäure hat wahrscheinlich geringere Wirkungen als der Austausch einer hydrophoben Aminosäure gegen eine geladene hydrophile Aminosäure. Darüber hinaus ist die Position der Aminosäure im Protein auschlaggebend. Eine Änderung im aktiven Zentrum eines Enzyms könnte das Enzym inaktivieren, die Mutation Mutation einer Phosphorylierungsstelle könnte die Regulation verändern. Die Einfügung eines Prolins in eine alpha Helix würde die helikale Struktur und damit die gesamte dreidimensionale Struktur des Proteins stören, während viele Mutationen für die Funktion eines Proteins eher von untergeodneter Bedeutung sind. Wird ein Codon in ein Stoppcodon umgewandelt, so spricht man von einer Nonsense Mutation. Das Leseraster bricht ab und es kann nur noch ein unvollständiges Protein produziert werden, da die Translation an dieser Stelle gestoppt wird. Es ist auch möglich, dass durch Mutation des ursprünglichen Stoppcodons die Polypeptidkette verlängert wird. Rasterschubmutation: Auswirkungen von Deletionen und Insertionen: Bei diesen Mutationen kommt es im Gegensatz zu den Substitutionen immer zu Änderungen der Aminosäuresequenz des zugehörigen Proteins. Wird eine einzelne Base inseriert oder deletiert, führt dies zu einer Leserasterverschiebung (Rasterschubmutation, frame shift mutation). Es entstehen völlig neue Tripletts, wodurch sich der Informationsgehalt des gesamten Gens bzw. des Anteils, der sich an die Deletion oder Insertion anschließt, grundlegend verändert. Als Folge kommt es überproportional oft zur Entstehung von Stoppcodons und zum Abbruch der Translation. Es wird ein völlig falsches Protein bzw. Enzym synthetisiert, das keinerlei Aktivität besitzt und auch keine immunologische Ähnlichkeit mit dem normalen Protein bzw. Enzym aufweist. Nicht ganz so stark sind die Auswirkungen beim Einfügen oder Entfernen einer Anzahl von Basen, die einem ganzzahligen Vielfachen von drei entspricht. Hier wird die Polypeptidkette verlängert oder verkürzt, ohne dass es zu einer Verschiebung des Leserasters kommt.

14 22.) Beschreiben Sie die Basen Exzisionsreparatur und die Nukleotid Exzisionsreparatur. Basen Exzisionsreparatur: Die Basen Exzisionsreparatur ist für modifzierte Basen (desaminierte oder oxidierte Basen) geeignet. Sie umfasst folgende Schritte: Erkennung der beschädigten Base Ausschneiden dieser Base unter Bildung einer abasischen Stelle Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen der abasischen Stelle Einfügung eines neuen Nukleotids Schließung des verbleibenden Einzelstrangbruches durch eine DNA Ligase Die ersten beiden Schritte erfolgen durch spezifische DNA Glykosylasen. Es sind neun menschliche DNA Glykosylasen bekannt, die unterschiedlich modifizierte Basen erkennen können. Die Uracil DNA Glykosylase z.b. erkennt Uracil, das durch Desamnierung aus Cytidin entstanden ist und kein natürlicher Bestandteil der DNA ist. Das Enzym spaltet die glykosidische Bindung zwischen Uracil und der Desoxyribose, wodurch eine abasische Stelle (AP Stelle, AP = apurin, apyrimidin) entsteht. Die AP Endonuklease hydrolysiert dann die 5' gelegene Phosphorsäure Esterbindung, wodurch ein Einzelstrangbruch der DNA entsteht. Die weitere Reparatur verläuft in zwei Varianten: Beim Short Patch Repair fügt die DNA Polymerase β ein passendes Nukleotid ein und spaltet gleichzeitig die 3' gelegene Phosphorsäure Esterbindung der AP Stelle durch ihre AP Lyase Aktivität. Beim Long Patch Repair fügen die DNA Polymerase δ und ε unter Mitwirkung der Proteine PCNA und RFC 2 6 Nukleotide unter Verdrängung der vorhandenen Basen an. Das kurze überhängende Oligonukleotid wird durch die Endonuklease FEN1 abgetrennt. Der letzte Schritt der Reparatur ist die Schließung des Einzelstrangbruches durch eine DNA Ligase. Nukleotid Exzisionsreparatur: Treten größere Basenveränderungen wie Pyrimidindimerisierungen oder sperrige Basenaddukte auf, die zu starken Verzerrungen der Doppelhelixstuktur führen, können diese Schäden durch die Nukleotid Exzisionsreparatur behoben werden. Beim Menschen sind etwa 30 Polypeptide an dieser Reparatur beteiligt. Die Nukleotidreparatur umfasst folgende Schritte: Ein Multiproteinkomplex, in dem auch der Transkriptionsfaktor TFIIH enthalten ist, lokalisiert die Schädigung Durch die Helikaseaktivität von TFIIH wird ein Bereich von etwa 25 Basenpaaren entwunden Zwei Endonukleasen schneiden ein Nukleotide langes Oligonukleotid, das den Defekt enthält, heraus Die Reparatursynthese erfolgt durch die DNA Polymerasen δ und ε zusammen mit PCNA und RFC Durch eine DNA Ligase wird der verbleibende Einzelstrangbruch kovalent geschlossen Man kennt beim Menschen zwei Varianten der Nukleotid Exzisionsreparatur, die globale Genomreparatur (GGR) und die transkriptionsgekoppelte Reparatur. Sie unterscheiden sich vor allem durch den Mechanismus der Ekennung des Defekts. Die GGR ist für die Reparatur nichttranskribierter DNA zuständig, während die TCR transkribierte DNA rapariert. Die Erkennung des Schadens erfolgt bei der TCR vermutlich durch eine blockierte RNA Polymerase. 23.) Beschreiben Sie die Funktion der Photo Lyase und definieren Sie die

15 Rekombinationsreparatur. Photoreaktivierung: DNA Photolyasen (photoreaktivierende Enzyme) sind in der Lage, die durch UV Strahlung verursachte Bildung von Thymindimeren (Thymin Cyclobutan Dimer) in zwei einzelne Thymine zu spalten. Das Enzym wird durch Absorption eines Photons aktiviert, wenn es sich an die gestörte DNA Region bindet. Durch die Absorption des Photons wird dann ein angeregter Zustand erzeugt, der zur Spaltung des Dimers in die ursprünglichen Basen führt. Dieses Reparatursystem ist in Bakterien und in niederen Eukaryonten vorhanden, nicht jedoch in Säugern. Rekombinationsreparatur: Dieser Vorgang ist sehr schwierig. Die DNA wird hier einfach repliziert und es entstehen zwei DNA Kopien, wobei der eine nicht geschädigt, also vollständig ist, und einer mit einer Lücke, an der Stelle, an der sich die DNA befand. Diese Lücke wird einfach mit der entsprechenden Sequenz des 2. vollständigen Stranges ersetzt, da er ja durch die Replikation wieder der ursprünglichen, eigentlichen DNA Sequenz, die geschädigt war, entspricht (komplementäre Basenpaare!). Die nun im zweiten replizierten Strang erhaltene Lücke wird durch DNA Polymerase und Ligase durch Exzisonsreperatur geschlossen. 24.) Beschreiben Sie, wie man einfach testen kann, ob eine Substanz mutagen wirkt? (Stichwort: Ames - Test) Aus Chemgapedia.de: Dieses Verfahren, das nach seinem Erfinder Bruce Ames benannt wurde, stellt einen Test auf (chemische) mutagene Substanzen dar. Da Mutationen zu Krebserkrankungen führen können, kann der Ames-Test verwendet werden, karzinogene Stoffe zu identifizieren. Im Test benutzt man spezielle Stämme des Bakteriums Salmonella typhimurium, die sich durch folgende Eigenschaften auszeichnen: sie sind Histidin-Mangelmutanten, können also ohne Histidingabe nicht überleben ihre Zellhülle ist extrem durchlässig ihr Exzisionsreparatursystem wurde inaktiviert Diese Bakterien werden auf einem Kulturmedium ohne Histidin ausplattiert und die zu untersuchende Substanz wird zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von zwei Tagen bei 37 C wird der Test ausgewertet. Nur diejenigen Bakterien konnten zu Kolonien heranwachsen, die in der Lage waren, ihren Histidinmangel durch eine Mutation aufzuheben. Als Vergleich dient eine Kontrollkultur, die ohne Zugabe der Testsubstanz unter angesetzt wurde (Bestimmung der Spontan- Mutationsrate). Da viele Stoffe erst durch ihren Abbau zu Kanzerogenen werden, gibt man der Testsubstanz oft etwas Rattenleberextrakt zu, um das Verhalten im Stoffwechsel zu simulieren. Der Ames Test eignet sich als Schnelltest. Als Standardverfahren zur Untersuchung auf Karzinogenität werden Versuchstiere mit hohen Dosen der Substanz behandelt und anschließend auf Tumore untersucht. Aus Wikipedia.de: Es werden Bakterien, die durch Mutation z.b. Punktmutation in einem Gen nicht mehr in der Lage sind, eine bestimmte Aminosäure zu synthetisieren (sogenannte Mangelmutanten), auf einen diese Aminosäure nicht enthaltenden Nährboden (Agar) aufgebracht. Da diese Bakterien zur Fortexistenz auf diese Aminosäure angewiesen sind, würden sie absterben bzw. könnten sich nicht auf diesem Mangelmedium vermehren. Die Aminosäure (z.b. Histidin) ist für die Synthese von Proteinen und

16 somit für Zellteilung vonnöten. Nun setzt man die Bakterien dem potentiellen Mutagen aus, indem man beispielsweise ein damit getränktes Filterpapier auf den Nährboden auflegt. Bilden sich nach dem anschließenden Bebrüten sogenannte Bakterien-Kolonien, so sind einzelne Bakterien gewachsen und haben die Fähigkeit zur Synthese der entsprechenden Aminosäure zurückerlangt. Es handelt sich hierbei um sogenannte Revertanten, bei denen die zur Auxotrophie führende Punktmutation in einem Gen rückgängig gemacht wurde - sie wurden wieder prototroph. Man geht davon aus, dass diese Rückmutation sehr wahrscheinlich der Wirkung des zugegebenen Agens zuzuschreiben ist und es sich somit um ein Mutagen handelt, welches eine Punktmutation in einem Gen bewirkt. In der Regel tritt eine solche Rückmutation auch spontan von selbst auf, jedoch in viel geringerem Maßstab, das heißt wesentlich seltener als bei Anwesenheit eines mutagenen Agens. Meist setzt man im Ames-Test Bakterienstämme von Escherichia coli (Tryptophan Auxotrophie) oder Salmonella typhimurium (Histidin Auxotrophie) ein. Salmonella typhimurium zeichnet sich neben seiner Histidin-Bedürftigkeit noch durch zwei weitere Eigenschaften aus, die für den Ames Test von Vorteil sind: Zum Einen besitzt es einen Defekt im DNA-Reparatursystem, sodass die entstandene Mutation nicht behoben werden kann; es gibt sozusagen keine Dunkelziffer. Zudem besitzt dieses Bakterium verkürzte Lipopolysaccharide, wodurch die Membran durchlässiger ist und potentielle Mutagene nicht schon dort ganz oder teilweise abgehalten werden. Beide Eigenschaften führen zu einer Erhöhung der Aussagekraft des Ames Tests. Denkbar sind auch Versuche mit biologischen Mutagenen (Viren). Üblicherweise wird dieser Test jedoch mit Chemikalien angewandt. Der Test ist von der OECD anerkannt und wird beispielsweise in der Pharmaforschung zur Mutagenitätsprüfung potentieller Arzneistoffe gebraucht. Das Verfahren ist schnell (Dauer etwa eine Woche), billig und einfach. Mehr als 3500 Substanzen (Stand 2006) wurden damit geprüft; weiterhin ist der Test gut geeignet, um unbekannte Gemische zu untersuchen. Die Übertragbarkeit der Ergebnisse des Ames Tests auf den Menschen oder andere Organismen als die verwendeten Bakterienstämme ist aber nicht ohne Weiteres gegeben. So erfährt das zu überprüfende Agens insbesondere in der Leber höherer Organismen häufig Modifikationen, die ihm erst die mutagenen Eigenschaften verleihen. Solche Substanzen würden als falsch-negativ den Ames Test bestehen. Auch der umgekehrte Fall ist möglich, bei dem das Agens in der Leber inaktiviert wird und seine mutagenen Eigenschaften verliert. Um dem Rechnung zu tragen, wird in der Praxis das Agens zuvor mit einem Leberextrakt (S9 mix) vermischt. Die in dem Extrakt enthaltenen Enzyme simulieren die in der Leber stattfindende Metabolisierung (Phase 1 Reaktion). 25.) Welche molekularen Ursachen hat das Krankheitsbild von Xeroderma pigmentosum? Bei Xeroderma pigmentosum können aufgrund des Defektes durch Sonnenbestrahlung (UVB!) entstandene DNA Schäden in Hautzellen nicht beseitigt werden. Deshalb treten auf lichtexponierter Haut Pigmentverschiebungen und Tumoren auf. Da es keine kausale Therapie gibt, müssen die Patienten Sonnenlicht meiden ( Mondscheinkinder ). Molekulare Ursachen: Diese Erkrankung ist eine autosomal rezessiv vererbte Krankheit, die darauf beruht, dass durch eine fehlerhafte Endonuklease Pyrimidindimere nicht mehr beseitigt werden können Die Defekte finden sich bei dieser Erkrankung in der GGR, nicht in der TCR (man kennt beim Menschen zwei Varianten der Nukleotid Exzisionsreparatur, die globale Genomreparatur (GGR) und die transkriptionsgekoppelte Reparatur. Sie unterscheiden sich vor allem durch den Mechanismus der Ekennung des Defekts. Die GGR ist für die Reparatur nichttranskribierter DNA zuständig, während die TCR transkribierte DNA rapariert. Die Erkennung des Schadens erfolgt bei der TCR vermutlich durch eine blockierte RNA Polymerase)