Fundamentals of Biochemistry

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1 Fundamentals of Biochemistry Third Edition Donald Voet Judith G. Voet Charlotte W. Pratt Chapter 25 DNA Replication, Repair, and Recombination Copyright 2008 by John Wiley & Sons, Inc. Lernziele: 1. Verstehen, dass einige DNA Schäden von einem einzigen Enzym repariert werden können. 2. Verstehen, dass beschädigte Basen durch 'base excision repair' und 'nukleotid excision repair' entfernt und ersetzt werden können. 3. Verstehen, dass Replikationsfehler durch 'mismatch repair' korrigiert werden können. 4. Verstehen, dass einige Reparaturmechanismen fehleranfällig sind. 1

2 5. DNA Reparatur A. Einige Schäden können direkt behoben werden Pyrimidin Dimere DNA Photolyase gibt es im Menschen nicht N5,N10 methenyltetrahydrofolat absrobiert UV und transferiert die Energie auf FADH-, welches ein Elektron zum Pyrimidin Dimer bring und es dabei spaltet. Damit das Enzym seine Wirkung haben kann muss das Dimer nach aussen flippen, was relativ gut geht da das Dimer konformationsstörungen in der DNA verursacht und die Basenpaarung von Pyrimidin Dimeren nicht sehr stark ist. B. Base excision repair (BER) benötigt eine Glycosylase DNA Glycosylase entfernen die defekten Basen. Spalten glykosidische Bindung der veränderten Base -> deoxyribose bleibt übrig. -> apurine oder apyrimidine Stelle = abasische Stelle. = AP sites. können auch durch spontane Hydrolyse von glykosidischen Bindungen entstehen. Desoxyribose dann durch eine AP Endonuclease auf einer Seite gespalten-> Deoxyribose und benachbarte Reste werden entfernt durch eine Exonuklease. -> die Lücke wird dann aufgefüllt und verknüpft durch DNA Polymerase und DNA Ligase. Die Enzyme für Basen-Excisions-Reparatur enthalten eine glycosylase (erkennt 8-oxoguanin) und eine Uracil-DNA Glycosylase (UDG) welche Uracil Reste entfernt. (Uracil Reste entstehen durch Cytosine Desaminierung) -> Grund warum DNA normalerweise Thymidin Reste und keine Uracil Reste enthält) Figure

3 RöntgenStruktur eines Komplexes von Uracil-DNA Glycosylase und 10bp DNA mit U-G Basenpaar Wie sieht dieses Enzym Uracil Reste? Scannen der DNA durch binden -> wenn Uracil Rest -> DNA wird einfacher gebogen und Uracil kann einfach ausgeflippt werden. Uracil Rest AP site Figure Arg 272 des Enzyms interkaliert und füllt Platz aus -> AP sites dürfen nicht frei sein da sie cytotoxisch sind. Warum sind AP-sites cytotoxisch? 1) binden irreversibel topoisomerase I 2) die Ribose am AP-site hat keine glykosidische Bindung, d.h. Ring öffnet sich reversibel in seine lineare Form -> freie Aldehydgruppe -> kann sich cross-linken zu anderen zellulären Komponenten. -> AP-sites müssen von UDG enzym bedekt bleiben -> anschliessend wird UDG von AP endonuclease verdrängt aber schützt die Zelle immer noch vor den cytotoxischen effekten von AP-sites. 3

4 C. Nucleotide excision reparatur (NER) entfernt ein Segment eines DNA Stranges Pyrimidin Dimere werden durch nukleotid excision Reparatur (NER) korrigiert. Helix distortionen bilden die Angerpunkte für diese Reparatur (nicht spezifische Nukleotiderkennung) NER ist der Hauptmechanismus gegen 2 wichtige Karzinogene: UV licht und Tabakrauch. In e. coli ist NER ein ATP abhängiger Prozess in dem UvrA, UvrB und UvrC proteine involviert sind. Dieses System spaltet den beschädigten DNA Strang and der 7 bzw. 3-4 Stelle welche das Dimer flankieren. Ein 11 oder 12nr langes Stück wird entfernt durch binden von UvrD. Auffüllen mit Pol I und DNA ligase. Figure Cockayne Syndrome (CS): 3 genes defective as in XP but also 2 additional genes CSA and CSB transcription arrest at nucleotide dimer -> RNA Pol stops CSA and CSB remove RNA Pol and give way for DNA repair. In cockayne syndrome DNA cannot be reapired -> cells undergo apoptosis. -> death of transcriptionally active cells -> developmental symptoms of Cockayne syndrome 4

5 Xeroderma Pigmentosum (XP) im Menschen entfernen 16 proteine etwa 30 nt lange Stücke. Wenn defekt -> XP Haut UV sensitiv -> Hautkrebs, Augenschäden D. Mismatch Reparatur korrigiert Replikationsfehler Mismatch -> spezieller Reparatur Mechanismus = Mismatch Repair (MMR) entstehen durch slipping der DNA Polymerase Defekt in MMR -> hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome (Lynch Syndrome) In E. coli -> MMR via MutS, MutL and MutH Erkennen des neuen Stranges anhand von nicht Methylierung In Menschen -> neuer Stragn nicht über Methylierungsmuster erkannt wahrscheinlich via nicht geschlossene Nicks. Figure

6 E. Einige DNA Reparaturmechanismen führen Fehler ein UV-induzierte Thymin dimere können von DNA polymerase η überbrückt werden. Es werden automatisch 2 A eingefügt. Dieses Enzym hat allerdings keine proofreading aktivität und macht etwa alle 30 nt einen Fehler. Solche Polymerasen sind relativ häufig da sie die für die normale DNA Replikationmaschinerie unzugänglichen DNA Abschnitte replizieren können. Mutation in DNA polymerase η kann zu XP führen. Doppelstrangbrüche können über Endverbindungen repariert werden Ionisiereden Strahlung und freie Radikale -> Doppelstrangbrüche (DSB). 2 Möglichkeiten für Reparatur: -Reparatur über Rekombination (siehe später) -nichthomologes End-joining (NHEJ) Bei NHEJ -> Protein Ku bindet DNA nicht sequenzspezifisch -> hält enden zusammen -> trimming -> generiert Mutationen aber ein nicht reparierter DSB wäre schlimmer. In E. Coli SOS response system als letzte Antwort auf Mutationen -> meiste Zellen sterben, aber ein kleiner Prozentsatz überlebt. Figure Rekombination Gene sind nicht unveränderlich. Wenn sich homologe Chromosomen nebeneineander ausrichten könne die Einzelstränge ausgetauscht werden in einem sogenannten crossing-over. Fremde DNA kann sich auch auf diese Weise in DNA Strang reinrekombinieren. DNA Stücke können sich in DNA Strang bewegen = Transposons. In Figur ist ein Crossing-over gezeigt. Die Nichtschwesterchormatide können dort wo sie sich überkreuzen rekombinineren. Figure

7 Branch migration Homologe Rekombination braucht mehrere Protein Komplexe Homologe Rekombination and Orten wo hohe Sequenzhomologie zwischen den DNA Strängen herrscht. Site-specific Rekombination and 2 kurzen, spezifischen Sequenzen. Holliday Modell der homologen Rekombination Figure Röntgenstruktur einer Holiday-Junction Figure

8 RecA veranlasst Rekombination in E. coli RecA Protein polymerisiert auf ssdna oder dsdna. Bildet ein Polymer -> rechtshändige Helix mit ca 6.2 RecA monomeren pro Umdrehung. Pro monomer ca 3 Nukleotide -> 18 Nukleotide pro RecA polymer turn. RecA vermittelt DNA Strangaustausch zwischen ssdna und dsdna Figure Modell von RecA vermittelter Rekombination Initittionskomplex dsdna bindet-> 3 Strang Komplex ATP vermittelter Strangaustausch Figure

9 Modell für RecA vermittelten Strangaustausch Figure RecBCD initiiert Rekombination durch Generieren von Einzelstrang-DNA RecBCD Protein hat Helicase und Nuklease Aktivität. Bindet an freies Duplex Ende (kommt normalerweis in E. Coli nicht vor, nur wenn Rekombination) Exonuklease Aktivität -> mehr am 3' -> kürzere Segmente -> bis zur Chi sequenz -> 5' schnittrate wird erhöht -> 3' bleibt als ssdna an welche RecA bindet -> Einzelstrang wird stabilisiert und kann für Rekombination eingesetzt werden. Figure Chi Sequenzen -> erhöhte Rekombinationsrate. 9

10 RuvABC vermittelt Branch Migration und Auflösen der Holliday junction Röntegnestruktur eines RivA-Holliday junction Komplexes Figure RuvAB Holliday-junction Komplex Figure 25-43a 10

11 RuvB RuvA RuvB Figure 25-43b Auflösen des Komplexes über Nuklease RuvC B. DNA kann durch Rekombination repariert werden In haploiden Organismen wie Bakterien ist homologe Rekombination selten (in transformationen). In mehrzelligen Organismen Gene shuffling nur während Meiose. Warum haben dann Organismen ausgeklügelte Systeme für homologe Rekombination? Defekte Replikationsgabeln mindestens 1 mal pro Bakteriengeneration. 10 x per eukaryontischem Zellzyklus. -> solche DNA Schäden über homologe Replikation repariert. d.h. homologe Rekombination ist primär da um Fehler zu korrigieren. RuvA und RuvB sind teil der SOS response in Bakterien. Figure

12 Reparatur durch Rekombination rekonstituiert Doppelstrangbrüche DSBs können durch nonhomologes end-joining (NHEJ) repariert werden was aber zu Mutationen führt. Homologes end-joining führt keine Mutationen ein setzt aber voraus, dass ein homologer DNA Strang vorhanden ist. Der Prozess findet über Holliday junctions statt. Reparatur durch Rekombination scheint wichtig zu sein im Menschen. Defekte in BRCA1 und BRCA2 welche beide mit Rad51 interagieren sind korrelieren mit erhöhtem Krebsrisiko (breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, pancreatic cancer). Figure C. Transposition rearragiert Segmente von DNA Barbara McClintock beobachtete, dass die unterschieliche Farbpigmentierung im Mais durch bewegliche genetische Elemente im Maisgenom entstehen. War gegen die Theorie dass Gene in einer fixierten Reihenfolge sind -> 20 Jahre unbeachtet bis auch in E. coli mobile genetische Elemente gefunden wurden. Transposons bewegen Gene zwischen beliebigen Stellen im Genom in Prokaryonten wie in Eukaryonten. beeinflussen phenotypische Expression und evolutionäre Entwicklung brauchen keine Homologie zwischen Donor und Akzeptor Stelle in der DNA. 1. Simple Transposons insertion elements max bp codiert für Transposase. Zielsequenz repetiert -> Einbau geschieht an überhängenden Ende der Ziel DNA Figure

13 Modell für Transposon Insertion Figure Komplexere Transposons haben auch Gene die keine Rolle in der Transposition haben Tn3 Transposon ist 4957 bp lang mit 38 nt repeats Rekombination geschiet an AT reichen Stellen beim Internal resolution site. Page

14 3. Zusammengesetzte Transposons können in der zentralen Region eine beliebige Sequenz haben und transponieren. Figure Der Transpositionsmechanismus involviert Replikation Der Rekombinationsprozess wird durch eine transposon codierte Resolvase katalysiert (nicht RecA). konnte isoliert werden Figure

15 Transposition ist verantwortlich für genetische Rearrangements Transposons fördern Inversionen, Deletionen und Rearrangements der DNA des Wirtes. Tranposons sind die genetischen Werkzeuge der Natur. -> z.b. neue Proteine zusammensetzen aus transonierten Elementen, Transfer von genetischer Information zwischen nicht verwandten Spezies. kann weiter transponieren Figure