BEITRAGE ZUR CHOLESTERINBESTIMMUNG IM BLUT. II. Uber die Kombination der kolorimetrischen mit der Digitoninmethode. VON. Nagasaki.

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1 The Journal of Biochemistry, Vol. XVIII, No. 2. BEITRAGE ZUR CHOLESTERINBESTIMMUNG IM BLUT. II. Uber die Kombination der kolorimetrischen mit der Digitoninmethode. VON KENZO KUSUI. (Aus der meclizinischen Universitatsklinik Nagasaki.) von Prof. Dr. S. Tsunoo, (Eingegangen am 21. Juni 1933) Die kolorimetrische Cholesterinbestimmuno, wird im allgemei nen als nicht so zuverlassig wie die Digitoninmethode betrachtet. Aber Dam (1928) schloss aus seinen Untersuchungsergebnissen, dass eine genauere Methode zur Bestimmung des Totalcholesterins, wenn die Esterfraktion klein ist, darin besteht, das freie Chole sterin erst mit Digitonin auszufallen und die Ester danach im Filtrat kolorimetrisch zu bestimmen. Nun versuclite ich auch zur Bestimmung des freien Cholesterins und seiner Ester im Blut und Blutserum die kolorimetrische mit der Digitoninmethode zu kom binieren. Zuerst bestimmte ich das freie Cholesterin nach dem gravi metrischen Verfahren von Muhlbock und Kaufmann (1931). Also wurden 10,0ccm Oxalatblut oder Blutserum in 250ccm Alkohol-Athergemisch(3:1) tropfenweise hineingegeben und einige Stunden lang stehen gelassen. Dann filtrierte man den Eiweiss niederschlag unter sorgfaltigem Nachwaschen mit Alkohol-Ather gemisch (3:1) ab. Der Alkohol-Atherextrakt wurde zur Trockne verdampft und der getrocknete Ruckstand mit Ather erschopfend extrahiert. Der Atherextrakt wurde wieder zur Trockne ver dampft. Der Ruckstand wurde mit Alkohol ausgelaugt. Diese alkoholische Losung wurde zur Ausfallung des freien Cholesterins mit 1%iger alkoholischer Digitoninlosung versetzt und uber Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wurde abgesaugt und zur gravimetrischen Bestimmung des freien Cholesterins gebraucht. 237

2 238 K. Kusui: Das Filtrat des Digitonincholesterids wurde bis zur Trockne eingedampft und nach Fex's Angabe (1920) mit Ather extrahiert, indem es uber Nacht mit 70ccm Ather stehen gelassen, filtriert, einige Minuten bei 100 Ž getrocknet, aufs neue mit 70ccm Ather ausgezogen, wiederum uber Nacht stehen gelassen und schliesslich nochmals filtriert wurde. Die vereinigten Atherextrakte wurden bis zur Trockne eingedampft, und der Ruckstand wurde zweimal mit je 10,0ccm Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte wurden zusammengebracht und auf 25,0ccm aufgefullt. 5,0ccm dieses Extraktes wurden in einen graduierten, mit Glasstopfen versehenen Zylinder von 10,0ccm ubergefuhrt, mit 2,0ccm Essig saureanhydrid und 0,1ccm konz. Schwefelsaure versetzt und gut durchgemischt. Nach 15 Minuten langem Stehen bei 35 Ž im Dunkeln wurde die Losung in das Kolorimeter gefullt und gegen die Standardcholesterinlosung, die 1,0mg wasserfreien Cholesterins in 5,0ccm Chloroform enthielt und weiter mit denselben Reagen zien versetzt wurde, verglichen. Wahrend der ganzen Prozedur wurden die zu untersuchende Probe und die Standardl6sung, was Belichtung und Erwarmen betrifft, vollkommen gleich behandelt. Um zu sehen, ob die von mir angegebene Kombinationsmethode zur Bestimmung des Cholesterins im Blut wirklich zuverlassige Werte ergibt, bestimmte ich freies und Estercholesterin im Blut ausser mit ineiner eignen Kombinationsmethode auch mit der gravimetrischen von Muhlbock und Kaufmann an demselben Material und verglich. beide Werte. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt. Aus dieser Tabelle ersieht man, dass die nach dem Kom binationverfahren gefundenen Werte mit den gravimetrisch ermittelten ziemlich gut ubereinstimmen. Weiter versuchte ich diese Kombinationsmethode zu ver einfachen. Das definitive Verfahren ist kurz zusammengefasst wie folgt: 1. Extraktion: 2,5ccm Oxalatblut oder Blutserum werden in 60ccm einer Mischung von 3 Teilen Alkohol und 1 Teil Ather tropfenweise eingebracht, einige Stunden stehen gelassen und dann unter grundlichem Nachwaschen mit Alkoholather(3:1) filtriert.

3 Beitrage zur Cholesterinbestimmung im Blut.-II. 239 TABELLE I Das Filtrat wird zur Trockne gebracht und der Rfickstand mit Ather erschopfend estrahiert. 2. Bestimmmg des freien Cholesterins: Der Atherextrakt wird wieder zur Trockne verdampft, und der Ruckstand mit 5ccm Alkohol ausgelaugt. Der Alkoholestrakt wird mit 2ccm heisser 1%oiger alkoholischer Digitoninlosung versetzt und zur voll standigen Ausfallung des Cholesterindigitonids uber Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wird in einen kleinen Goochtiegel von bekanntem Leergewicht (etwa 5g) abgesaugt und 2mal mit je 1ccm Alkohol, dann 2mal mit je 1ccm Ather nachgewaschen. Der Tiegel mit Niederschlag wird bei Ž bis zur Gewichts konstanz getrocknet und dann gewogen. Die Berechnung des - Cholesterins aus dem Niederschlage geschieht nach Angabe von Windaus durch Alultiplikation mit 0,25. Wenn man die erhaltenen Werte fur das Digitonincholesterid mit 10 multipliziert, so erhalt man die Werte Mr das freie Cholesterin in 100,0ccm Blut oder Blutserum. 3. Bestimmung des Estercholesterins: Das Filtrat des Digitonincholesterids wird zur Trockne eingedampft, und die Chole sterinester werden nach Fex's Angabe auf oben erwahnte Weise zweimal mit je 20ccm Ather extrahiert. Nachdem der Extrakt bis

4 240 K. Kusui: zu einem kleinen Volumen eingedampft worden ist, wird er quan titativ in einen Messkolben von 25,0ccm gebracht und mit Ather aufgefullt. 5,0ccm Atherextrakt werden in einem Becherchen von 30ccm getrocknet. Der Ruckstand wird in 3ccm Chloroform gelost. Diese Chloroformlosung wird dann in einen 10ccm fassenden, graduierten, mit Glasstopfen versehenen Zylinder uber gefuhrt, mit Chloroform auf 5,0ccm aufgefullt, indem man mit dem hinzuzusetzenden Chloroform das Becherchen nachwascht, weiter mit 2,0ccm Essigsaureanhydrid und 0,1ccm konz. Schwefel saure versetzt und durchmischt. Naclidem die Losung 15 Minuten lang bei 35 Ž im Dunkeln stehen gelassen worden ist, wird sie in dem Autenriet hschen Apparat (F. Hellige & Co. Freiburg i. B. Cholesterin 18719) kolorimetriseh bestimmt. Um mein Kombinationsverfahren auf seine Zuverlassigkeit zu prufen, verglich ich die Resultate, die mit diesem Verfahren gewonnen wurden, mit denen, die meine eigene gravimetrische Methode an demselben Material ergab (vergleiche I. Mitt.). Dabei wurden einerseits Gesamt und freies Cholesterin nach meinem gravimetrischen Verfahren bestimmt, auch das Estercholesterin berechnet. Andererseits wurde das Filtrat des Digitonids vom freien Cholesterin zu meiner oben beschriebenen kolorimetrischen Bestimmung benutzt. Die Resultate sind in Tabelle II zusammengestellt. Aus diesen Versuchen ergibt sich, dass das Cholesterin und seine Ester mit nur 2,5ccm Blut nach meinem Kombinations verfahren zuverlassig bestimmt werden konnen. ZUSAMMENFASSUNG. Hier wurde eine neue Bestimmungsmethode des Cholesterins und seiner Ester im Blut oder Blutserum vorgeschlagen. Sie besteht aus der Kombination der Gravimetrie und der Kolorimetrie, von denen die erstere zur Bestimmung des freien Cholesterins und die letztere zur Ermittlung des Estercholesterins angewendet wird. Mit dieser Methode sind 2,5ccm Blut oder Blutserum hin reichend, um das Cholesterin und seine Ester quantitativ zu erfassen.

5 Beitrage zur Cholesterinbestimmung im Blut.-II. 241 TABELLE II. LITERATUR. Dam, H. (1928): Biochem. Z., 194, 188. Fex, J. (1920): Biochem. Z., 104, 82.M uhlbock, O. und Kaufmann, C. (1931): Biochem. Z., 233, 222.

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