SHIGATOXIN-SPEZIFISCHE IMMUNGLOBULINE UND AUSSCHEIDUNG VON SHIGATOXIN-BILDENDEN ESCHERICHIÄ COLI BEI KÄLBERN

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1 Aus dem Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: PD Dr. med. vet. C. Menge SHIGATOXIN-SPEZIFISCHE IMMUNGLOBULINE UND AUSSCHEIDUNG VON SHIGATOXIN-BILDENDEN ESCHERICHIÄ COLI BEI KÄLBERN INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von Julia Fröhlich Tierärztin aus Suhl Gießen 2009

2 I Inhalt I Inhalt I II Abkürzungsverzeichnis VI III Einleitung 1 IV Literaturübersicht 2 1 Definition und Wirtsspektrum Shigatoxin-bildender Escherichia coli (STEC) 2 2 Virulenzfaktaren der STEC Shigatoxine (Stx) Intimin und Typ III Sekretionssystem Enterohämolysin 9 3 STEC-Infektionen beim Rind Prävalenz von STEC Symptomatik boviner STEC-Infektionen Epidemiologie der STEC in der Rinderpopulation Erstinfektion und STEC-Ausscheidung in verschiedenen Lebensabschnitten Intermittierende Ausscheidung von STEC und Supershedder" Dauer der STEC-Ausscheidung Serotypen-spezifische STEC-Ausscheidung 20 4 STEC-spezifische Immunität beim Rind Humorale Immunität O-Antigene Stx Weitere STEC-Antigene Protektivität einer humoralen STEC-Immunität Zelluläre Immunität und ihre mögliche Bedeutung 35 5 Antigen-unspezifische Immunmodulation durch STEC-Faktoren Lymphostatin Stx 38 V Material und Methoden 40

3 1 Probengewinnung Betriebsdaten Entnahmezeitpunkte und Probenplan Muttertiere Kälber Weitere Tiere Probenentnahme Blutproben zur Serumgewinnung Kolostrum Milch Kot Probenaufbereitung Gewinnung von Serum aus Blutproben Verarbeitung von Kolostrum- und Milchproben 43 2 Zellkulturmethoden Zelllinien Gewinnung und Kultivierung von primären, bovinen Kolonkryptenzellen 45 3 Nachweis von Stx-spezifischen Antikörpern in Serum-, Kolostrum- und Milchproben Verozelltest Prinzip des Neutralisationstestes Prinzip des Zytotoxizitätstestes Auswertung Berechnung der verozytotoxischen/inhibitorischen Dosis 50 % Berechnung der verozytotoxischen Dosis 50 % Berechnung der inhibitorischen Dosis 50 % Nachweisgrenze sowie Definition von Titerabfall und Titeranstieg ELISA Durchführung des Stx-ELISA Herstellung von E. co//-ultraschall-lysaten Überprüfung und Einstellung der Ultraschall-Lysate Durchführung des kompetitiven ELISA Western Blot und Immunofärbung Tricine-SDS-PAGE Überprüfung des verwendeten Stxl Semi-Dry Western Blot Immunofärbung Einstellung der Primär- und Sekundärantikörper-Konzentrationen 63 4 Nachweis der STEC-Ausscheidung 64

4 4.1 Nachweis von Stx-Genen in Kotproben ~ Probenaufbereitung jte//jtr2-multiplex-pcr Bestimmung der Nachweisgrenze für die stxl/stx2-mult\p]ex-pcr jüc2-typisierungs-pcrs Bestimmung der Nachweisgrenze für die s c2/sf;t.2c-typisierungs-pcr Nachweis von Stx im Kot 72 5 Isolierung und Charakterisierung von STEC-Stämmen Anzuchtverfahren Typisierung der STEC (x//ite2-Multiplex-PCR und itt2-typisierungs-pcrs Multiplex-PCR für stx, ehxa, eae Intimin-Typisierungs-PCR Wachstum auf Selektivagar Überprüfung der in v/m>-stx-bildung Pulsfeld-Gelelektrophorese(CHEF-PFGE) Bindungsversuche im Zellkulturmodell (Adhäsionstests) Verwendetet. co//-stämme Anzucht der Bakterien Fluorescence Actin Staining-Test (FAS-Test) Giemsa-Test Nachweis von Stx in Zellkulturüberständen 83 VI Ergebnisse 85 1 Nachweis von Stx-spezifischen Antikörpern in Serum-, Kolostrum- und Milchproben Verozell-Neutralisationstest Stx 1-spezifische Antikörper Serum, Kolostrum und Milch der Muttertiere Serum der Kälber Serum weiterer Tiere Stx2-spezifische Antikörper Serum, Kolostrum und Milch der Muttertiere Serum der Kälber Serum weiterer Tiere Stx2c-spezifische Antikörper Kompetitiver ELISA Stx 1-spezifische Antikörper Stx2-spezifische Antikörper Stx2c-spezifische Antikörper 96 III

5 1.3 Western Blot/Immunofärbung Stx 1-spezifische Antikörper 97 2 Nachweis der STEC-Ausscheidung Kotuntersuchungen mittels PCR Jtt/Aft2-Multiplex-PCR s«:2-typisierungs-pcrs Nachweis von Stx im Kot Isolierung und Charakterisierung von bovinen STEC-Stämmen Typisierung der isolierten Stämme Charakterisierung des Makrorestriktionsmusters via PFGE-Analyse Bestimmung des Intimin-Subtyps Bindungsversuche im Zellkulturmodell Bindungsversuche mit HEp2(Clone2b)-Zellen FAS-Test Giemsa-Test Bindungsversuche mit bovinen Kolonkryptenzellen FAS-Test Giemsa-Adhäsionstest Nachweis von Stx in Zellkulturüberständen 120 VII Diskussion 122 VIII Zusammenfassung 136 IX Summary 138 X Literaturverzeichnis 140 XI Anhang Übersicht untersuchte Tiere Stx-spezifische Antikörper, Verozell-Neutralisationstest und kompetitiver ELISA, einzelne Titerwerte Übersicht Über verwendete Geräte, Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Verwendete Puffer und Medien Puffer, Lösungen und Medien für Zellkulturtechniken 179 IV

6 4.2 Puffer und Lösungen für den ELISA Puffer und Lösungen für die Tricine-PAGE Puffer und Lösungen lür Western Blot und Immmunofärbung Puffer und Uisungen für CHEF-PFGE Puffer und Lösungen für PCRs Kulturmedien für die Bakterienanzucht 189 XII Abbildungsverzeichnis Abbildungen Tabellen 192 V

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