Estrone ELISA. Enzymimmunoassay für die direkte quantitative Bestimmung von Estron in humanem Serum.

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1 Arbeitsanleitung Estrone ELISA Enzymimmunoassay für die direkte quantitative Bestimmung von Estron in humanem Serum. DB C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBLInternational.com D22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. ZWECKBESTIMMUNG Enzymimmunoassay für die direkte quantitative Bestimmung von Estron in humanem Serum. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Estron ist ein ähnliches Steroid wie Estriol und Estradiol und gehört zur Klasse der Östrogene. Die Östrogene sind an der Entwicklung weiblicher Geschlechtsorgane und sekundärer Geschlechtsmerkmale beteiligt. Bevor die Eizelle befruchtet wird, sind die Östrogene hauptsächlich für Wachstum und Funktion des Fortpflanzungstraktes verantwortlich, um diesen auf die befruchtete Eizelle vorzubereiten. Während der Follikelreifung des Menstruationszyklus steigt der EstronSpiegel leicht an. Die Estronproduktion nimmt dann immer deutlicher zu und erreicht ihren Höhepunkt um den 13. Tag herum. Der Höhepunkt ist nur von kurzer Dauer und ab dem 16. Zyklustag ist der EstronSpiegel wieder niedrig. Ein zweiter Höhepunkt wird um den 21. Zyklustag herum erreicht. Wenn zu diesem Zeitpunkt keine Befruchtung stattfindet, nimmt die Estronproduktion wieder ab. 3. TESTPRINZIP Kompetitiver Enzymimmunoassay (ELISA). Die unbekannte Menge an Antigen in der Probe und eine bekannte Menge an enzymmarkiertem Antigen (EAg) konkurrieren um die Bindungsstellen des an die Wells der Mikrotiterstreifen gebundenen Antikörpers. Nach der Inkubation wird nicht gebundenes EAg durch Waschen entfernt. Die Intensität der gebildeten Farbe nach der Substratreaktion ist umgekehrt proportional zur AntigenKonzentration in den Proben. Die Ergebnisse der Proben können direkt anhand der Standardkurve bestimmt werden. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum InvitroGebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. ChargenNummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBLHomepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. 9. Alle Reagenzien dieses Kits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf antihcv, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/IIVirus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 28 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Die Mikrotiterplatte ist auch nach dem Öffnen der Verpackung bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar, wenn der Beutel sorgfältig wieder verschlossen und bei 28 C gelagert wird. Standards und Kontrollen müssen nach dem Öffnen innerhalb von 14 Tagen aufgebraucht oder aliquotiert bei 20 C gelagert werden. V7.1 März 24, 2016 (02) 1 / 6

3 6. PROBENGEWINNUNG UND AUFBEWAHRUNG Serum Die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Blutabnahme sind einzuhalten. Die chemische Integrität der Blutproben muss vom Zeitpunkt der Blutabnahme bis zur Testdurchführung erhalten bleiben. Keine hämolytischen, ikterischen oder lipämischen Proben verwenden. Proben, die Natriumazid oder Thimerosal enthalten, sollten nicht verwendet werden, da sie zu falschen Ergebnissen führen können. Getrübte Proben sollten vor der Testdurchführung zentrifugiert werden, um Partikel zu entfernen. Lagerung 4 C 10 C (Aliquotiert) Vor Hitze und Sonneneinstrahlung schützen. Haltbarkeit 24 h 24 h Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. 7. KOMPONENTEN DES KITS Anzahl / Menge Symbol 1 x 12 x 8 MTP 1 x 15 ml ENZCONJ 1 x 2 ml 1 x 5 x 1.0 ml CAL A CAL BF 1x 2 x 1.0 ml CONTROL LOW CONTROL HIGH 1 x 18 ml TMB SUBS 1 x 8 ml TMB STOP 2 x 50 ml WASHBUF CONC Komponente Mikrotiterplatte Wells einzeln abbrechbar. beschichtet mit KaninchenantiEstronAntikörper (polyklonal). Enzymkonjugat Enthält: Estrone HRP Konjugat in ProteinPuffer, Quecksilberfreie Konservierungsmittel. Standard A 0 pg/ml Gebrauchsfertig. Enthält: Estron in ProteinPuffer, Quecksilberfreie Konservierungsmittel. Genaue Konzentrationen siehe Fläschchenetiketten oder QC Zertifikat. Standard BF 10; 25; 100; 400; 2000 pg/ml Gebrauchsfertig. Enthält: Estron in ProteinPuffer, Quecksilberfreie Konservierungsmittel. Genaue Konzentrationen siehe Fläschchenetiketten oder QC Zertifikat. Kontrollen Gebrauchsfertig. Enthält: Estron in ProteinPuffer, Quecksilberfreie Konservierungsmittel. Genaue Konzentrationen siehe Fläschchenetiketten oder QC Zertifikat. TMB Substratlösung Gebrauchsfertig. Enthält: TMB und Wasserstoffperoxid in einem DMF oder DMSOfreien Puffer. TMB Stopplösung Gebrauchsfertig. 1 M H2SO4. Waschpuffer, Konzentrat (10 x) Enthält: Puffer mit nichtionischem Detergenz und Quecksilberfreie Konservierungsmittel. 8. ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3% VK). Volumina: 50, 100, 150, 300 μl 2. Orbitalschüttler (600 U/min) (z.b. EAS 2/4, SLT) oder Linearschüttler (200 U/min) 3. 8Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 4. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 5. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 450 nm (Referenzwellenlänge nm) 6. Bidest. oder deionisiertes Wasser 7. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr V7.1 März 24, 2016 (02) 2 / 6

4 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (1825 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal Pipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. 4. Enthalten Komponenten 250 μl Flüssigkeit, sollte sich vor dem Öffnen der gesamte Inhalt auf dem Boden des entsprechenden Fläschchens befinden. 5. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen, um eventuelle Pipettierfehler zu erkennen. 6. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. 7. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8Kanal Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 8. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 9. Feuchtigkeit beeinflusst die beschichteten Wells/Röhrchen. Verpackung nicht öffnen bevor Raumtemperatur erreicht ist. Nicht benötigte Wells/Röhrchen sofort in den wieder verschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben 10. TESTVORBEREITUNGEN Vorbereitung konzentrierter Komponenten Verd. / rekonst. Komponente mit Diluent Verhältnis Lagerung Haltbarkeit 50 ml WASHBUF CONC 450 ml bidist. Wasser 1:10 28 C 12 mon Proben, die eine höhere Konzentration als der höchste Standard aufweisen, müssen weiter mit Standard A im Verhältnis von höchstens 1:8 verdünnt und erneut getestet werden. Das Ergebnis sollte mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert werden. V7.1 März 24, 2016 (02) 3 / 6

5 11. TESTDURCHFÜHRUNG μl von jedem Standard, jeder Kontrolle und Probe in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Je 100 μl Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren h bei RT auf einem Orbitalschüttler (ca. 600 U/min) oder Linearschüttler (ca. 200 U/min) inkubieren. 4. Platte 3 x mit 300 μl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 5. Substrat und Stopplösung möglichst mit einer 8KanalPipette pipettieren und Substrat und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. Mit positivem Vorhub pipettieren, um die Bildung von Luftbläschen zu vermeiden. 6. Je 150 μl TMB Substratlösung in jedes Well pipettieren min bei RT auf einem Orbitalschüttler (ca. 600 U/min) oder Linearschüttler (ca. 200 U/min) inkubieren oder bis Standard A eine dunkelblaue Farbe für die gewünschte OD erreicht. 8. Die Substratreaktion durch Zugabe von je 50 μl TMB Stopplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. 9. Die Optische Dichte mit einem Photometer bei 450 nm* innerhalb von 20 min messen. *) Wenn die OD die höchste Erkennungsgrenze überschreitet oder kein 450 nm Filter verfügbar ist, kann auch ein 405 oder 415 nm Filter verwendet werden. Die optischen Dichten werden dann niedriger sein. Dies hat jedoch keinen Einfluss auf das Ergebnis der Patienten/Kontrollproben. 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP Regeln (Good Laboratory Practice) und andere einschlägige Normen und Gesetze beachten. Alle KitKontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus laborinterne Kontrollen mitführen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Die erhaltenen OD der Standards (yachse, linear) gegen deren Konzentration (xachse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semilogarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die CubicSplineMethode, 4ParameterAnalyse (linlog) oder LogitLogBerechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden). Die Konzentrationen der Proben können direkt von der Standardkurve abgelesen werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, müssen wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben verdünnt und erneut analysiert werden. Typische Standardkurve (Beispiel. Nicht zur Testauswertung verwenden!) Standard OD Value (pg/ml) A B C D E F Unbekannt V7.1 März 24, 2016 (02) 4 / 6

6 14. NORMWERTE Wie bei allen klinischen Assays sollte jedes Labor Daten sammeln und seinen eigenen Bereich für Normwerte erstellen. Gruppe Bereich (pg/ml) Männer Frauen vor Menopause Frauen nach Menopause TESTCHARAKTERISTIKA SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze (LOD) wurde durch die Analyse von 60 Proben Standrsd A und Proben niedriger niedrigen Konzentrationbestimmt und wie folget berechnet: LoD = µb σB σS, wobei σb und σs die Standardabweichung von Standard A und der Probe ist und µb der Mittelwert von Standard A ist. Die untere Nachweisgrenze (LOD) wurde bestimmt bei 3 pg/ml. SPEZIFITÄT (KREUZREAKTIVITÄT) Die folgenden Verbindungen wurden mit dem Estrone ELISA kit auf ihre Kreuzreaktivität getestet, wobei Estron eine Kreuzreaktivität von 100% hat. Steroid % Kreuzreaktivität Estron 100 Estron3Sulfat ßEstradiol 2.2 Estron3Glucoronid ßEstradiol3Glucoronid 0.14 Die folgenden Steroide wurden getestet, wiesen jedoch eine Kreuzreaktivität von weniger als 0.1 % auf: Androstendion, Cholesterol, Corticosteron, Cortisol, Cortison, DHEAS, Diethylstilbesteron, Estriol, 17βEstradiol3 Glucoronid, EstradiolSulfat, Progesteron, 17OH Progesteron, und Testosteron. INTRAASSAY PRÄZISION Es wurden drei Proben je zehnmal mit derselben Standardkurve gestestet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt (in pg/ml): Probe Mittelwert SD VK % INTERASSAY PRÄZISION Über einen Zeitraum von vier Wochen wurden drei Proben zehnmal getestet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt (in pg/ml): Probe Mittelwert SD VK % WIEDERFINDUNG Die nativen Proben wurden durch Zugabe bestimmter Menge an Estron zu drei Patientenserumproben hergestellt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt (in pg/ml): Probe Gemessenes Erwartetes Wiederfindung 1 Nativ Nativ Nativ Ergebnis Ergebnis % V7.1 März 24, 2016 (02) 5 / 6

7 LINEARITÄT Es wurden drei Patientenserumproben mit Standard A verdünnt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt (in pg/ml): Probe Gemessenes Erwartetes Wiederfindung 1 1:2 1:4 1:8 2 1:2 1:4 1:8 3 1:2 1:4 1:8 Ergebnis Ergebnis % VERGLEICHBARE STUDIEN Der Estrone ELISA kit (y) wurde mit LC/MS (x) verglichen. Der Vergleich von 19 Serumproben ergab die folgenden Regressionsergebnisse: y = x r 2 = LITERATUR ÜBER DAS PRODUKT 1. Hauptmann. H. et al: Concepts for the synthesis ofbiotinylated steroids. Part 2: 17βestradiol derivatives as immunochemical probes. Bioconjugate Chem. 11(2000) Dressendorfer R.A. et al: Synthesis of a cortisolbiotin conjugate and evalution as atracer in an immunoassay for salivary cortisol measurement. J. Steroid Biochem. Molec. Biol.: 43 (1992) Mayer H.H.D. et al: Immunoaffinity chromatography and a biotinstreptavidin amplified immunoassay for sensitive and specific estimation of estradiol17_. J. Steroid Biochem. 35 (1990) Folan J. et al: Solidphase Enzymoimmunoassay of estrone in serum. Clin. Chem. 34 (1988) Folan J. et al: SolidPhase Enzymoimmunoassay of estrone in saliva. Clin. Chem. 35:4 (1989) Speroff L. et al: Hormone biosynthesis, metabolism, and mechanism of action. In: Clinical gynecologic endocrinology & infertility, 3rd ed. Willanms & Wilkins. 1983: Kim M.H. et al: Plasma levels of estrogen, androgens and progesterone during normal and dexamethasonet reated cycles. J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) Speight A.C. et al; Nonprotein bound oestrgens in plasma and urinary excretion of unconjugated oestrogens in nonpregnant women. J. Endocrino 83 (1979) Kricka, L.J., Human antianimal antibody interferences in immunological assays. Clin. Chemistry 45:7, Check, J.H., et al, Falsely elevated steroidal assay levels related to heterophile antibodies against various animal species. Gynecol Obstet Invest 40:139140, V7.1 März 24, 2016 (02) 6 / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.No.: / Kat.Nr.: / No. Cat.: / Cat.No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / ΑριθμόςΚατ.: LotNo.: / ChargenBez.: / No. Lot: / LotNo.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / InvitroDiagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για InVitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: 11 IBL@IBLInternational.com WEB: Symbols Version 4.5 /