Inhibition der 5-Lipoxygenase als neuer Angriffspunkt bei der Therapie der akuten myeloischen Leukämie
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- Mona Albrecht
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1 Inhibition der 5-Lipoxygenase als neuer Angriffspunkt bei der Therapie der akuten myeloischen Leukämie Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften vorgelegt beim Fachbereich Pharmazie der Johann Wolfgang Goethe Universität in Frankfurt am Main von Jessica Roos aus Grünstadt Frankfurt 2013 (D30)
2 Inhaltsverzeichnis 5 Inhaltsverzeichnis DANKSAGUNG INHALTSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS TABELLENVERZEICHNIS ABKURZUN GS VERZEICHNIS 1. EINLEITUNG Hämatopoese Die hämatopoetische Stammzelle HSC und dessen Oberflächenmarker Die Stammzellhomöostase und involvierte Signalwege Der Wnt/ß-Catenin-Signalweg ß-Catenin und y-catenin Der Wnt-Signalweg in der Hämatopoese 1.2 Leukämie Akute myeloische Leukämie (AML) Klassifikationssysteme der AML FAB-Klassifikation WHO-Klassifikation Prognostische Faktoren der AML AML-assoziierte Fusionsproteine PML/RARa-t(15;17) in der APL Biologie und Mechanismus des PML/RARa-induzierten Differenzierungsblocks ATRA und Arsen in der Therapie der PML/RARa-positiven APL DEK/CAN-t(6;9) in der AML Struktur und Funktion von DEK/CAN Rolle von DEK/CAN in der Leukämogenese Therapiekonzepte in der AML Induktionstherapie Konsolidierungstherapie Erhaltungstherapie Das Konzept der leukämischen Stammzelle Rolle des Wnt-Signalwegs bei der Leukämie Wnt-Signalweg und Hemmung der LSC durch Verwendung von NSAP 1.3 Struktur und Regulation der 5-Lipoxygenase Arachidonsäurekaskade LO-Signalweg Struktur der 5-LO Bindungspartner und Regulation der 5-LO LO als therapeutisches Target
3 Inhaltsverzeichnis LO bei malignen Erkrankungen Effekt der pharmakologischen Inhibition der 5-LO bei malignen Erkrankungen Arbeitshypothese und Zielsetzung der Promotionsarbeit MATERIAL UND METHODEN Material Geräte Chemikalien Verbrauchsmaterialien Bakterienkultur Zellkultur Primäre Antikörper Sekundäre Antikörper FACS-Antikörper Enzyme Verwendete Vektoren und rekombinante Plasmide Methoden Bakterienkultur Bakterienkonservierung Plasmidpräparation Mini, Midi und Maxi (Mini-, Midi-, Maxi-Präp) Quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren (Sambrook et al., 89) Restriktionsverdau Sequenzierung von DNA-Fragmenten Agarose-Gelelektrophorese (Sambrook et al., 89) Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Klenow Fill-in": Auffullen von DNA-Überhängen ClP-vermittelte Dephosphorylierung linearisierter Vektorfragmente Ligation von DNA-Fragmenten Gateway-Rekombination der Firma Invitrogen Klonierung zusätzlich verwendeter Konstrukte Präparation chemokompetenter Bakterien Transformation rekombinanter Plasmide in chemokompetente E. coli Spektralfotometrische Proteinkonzentrationsbestimmung bei 280 nm SDS-Polyacrylamid Elektrophorese (SDS-PAGE) mittels BioRad-System Westemblot-Transfer mit dem NOVEX NuPAGE Wet-Blot System (Invitrogen) Westernblot-lmmundetektion von Proteinen auf Nitrozellulose Mehrmalige Immundetektionen mit ein und derselben Membran Fluoreszenz aktivierte Durchflusszytometrie (FACS)- Antikörper gekoppelte Fluoreszenz FACS-Analyse der Annexin V Färbung FACS-Analyse mit Hilfe von intrazellulären Fluoreszenzfarbstoffen, proteinvermittelter Fluoreszenz, sowie Substratfluoreszenz Dual Luciferase Assay" (Promega) Allgemeine Zellkulturbedingungen Zellpassage von Suspensionszelllinien Zellpassage von adhärenten Zelllinien Einfrieren von Zellen Auftauen von Zellen Zellzählung Transfektion von Zellen mit CaP04-Methode (adhärente Zellen) Transfektion von Zellen mittels Nukleofektion 68
4 Inhaltsverzeichnis Expressionsinduktion von MT-Promotoren Transaktivierungsassay Applikation von CJ-13,610, Zileuton und DMSO Bestimmung der 5-LO-Produktbildung in intakten THP-1 Zellen Isolierung von primären, murinen hämatopoetischen Stammzellen Infektion muriner Zelllinien und primärer Seal + /Lin" Zellen Flüssigkultur mit murinen hämatopoetischen Stammzellen Bestimmung der 5-LO-Produktbildung in Scal + /Lin" Zellen Colony-Assay ( colony forming unit"-cfu) in semi-solidem Medium ( replating efficiency"- Experiment) Colony forming unit-spleen day 12" (CFU-S12)-Assay Immunohistochemische-Färbung der CFU-S12-Milzen Competitive repopulating assay" (CRA) Kopplung der Antikörper an die magnetischen Dynabeads Koimmunopräzipitation (Co-IP) Immunofluoreszenz-Färbung Statistische Analyse ERGEBNISSE LO wird durch NSAP inhibiert und wird sowohl in normalen, als auch in malignen Stammzellen exprimiert Effekt der pharmakologischen 5-LO-Hemmung auf die aberrante Stammzeilkapazität von PML/RARa- und DEK/CAN-exprimierenden HSPC Die Hemmimg der 5-LO durch CJ-13,610 reduziert die aberrante replating efficiency" von PML/RARa und DEK/CAN exprimierenden HSPC Die pharmakologische Hemmung der 5-LO inhibiert die aberrante ST-Stammzellkapazität von PML/RARa- und DEK/CAN-exprimierenden HSPC Die pharmakologische Hemmung der 5-LO inhibiert die aberrante LT-Stammzellkapazität von PML/RARa-exprimierenden HSPC Effekt der genetischen 5-LO-Hemmung auf die aberrante Stammzellkapazität von PML/RARaund DEK/CAN-exprimierenden HSPC Der Verlust der 5-LO-Expression rekapituliert nicht den hemmenden Effekt der Inhibitoren im leukämischen Phänotyp von PML/RARa und DEK/CAN Die Koexpression der 5-LO inhibiert die PML/RARa-induzierte Wnt-Signalweg-Aktivierung in der humanen leukämischen Zelllinie U937 < LO zeigt eine direkte Interaktion mit ß-Catenin LO kolokalisiert mit ß-Catenin und verhindert die Translokation von ß-Catenin in den Nukleus DISKUSSION Untersuchung der Rolle der 5-LO in der AML Aufklärung der Rolle der 5-LO auf die aberrante Stammzellkapazität von PML/RARa-positiven HSPC Aufklärung der Rolle der 5-LO auf den Wnt-Signalweg Rolle der 5-LO in der DEK/CAN-positiven AML LO-lnhibition als neuer Ansatz der Stammzelltherapie 108
5 Inhaltsverzeichnis 8 \ 5. ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG LEBENSLAUF 134
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