Isolierung von Nukleinsäuren (DNA) aus Formalin-fixierten Paraffingewebe-Schnitten (FFPE) DNA - Isolierung aus FFPE Schnitten Grundlagen

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1 Isolierung von Nukleinsäuren (DNA) aus Formalin-fixierten Paraffingewebe-Schnitten (FFPE) Grundlagen Fixierung DNA Isolierung Grundlagen Nukleotid: Zucker, Phosphor, Base Cytosin Guanin Thymin Adenin Bildquelle: Purinbasen: Guanin und Adenin Pyrimidinbasen: Cytosin und Thymin (RNA: Uracil) 1

2 Grundlagen Spiralige Aufwicklung der Nukleosome bis ein verdichteter, stark gewundener Chromatidfaden entsteht Grundlagen - Fixierung DNA-Qualität aus FFPE-Material hängt von verschiedenen Faktoren ab: 1. Prä-Fixation: Gewebeart und Größe, Grad der Autolyse z.b. Lungenbiopsien 2. Fixation: ph, Temperatur, Dauer der Fixierung, Art der Fixierung Formaldehyd (HCHO) führt zu DNA-Protein Quervernetzungen: Fragmentierung der DNA Desaminierung des Cytosins ( Maskierung ; A-rule) 3. Post-Fixation: Temperatur und Dauer der Lagerung 2

3 Grundlagen - DNA-Qualität Richtiges Fixiermittel auswählen optimal: Aceton; 95% Ethanol praktikabel (auch für IH geeignet): 7,5 % Formalin, gepuffert Fixierdauer beachten nicht länger als 24 Stunden Temperatur der Fixierung beachten nicht höher als 40 C Arbeitsschritte 1. Anfertigung der Schnitte 2. Entparaffinierung (nicht zwingend notwendig) 3. Auflösung der Zellmembran und Abbau der Zellproteine 4. Aufreinigung (wir: Magnetic Beads) 5. Nachweis der DNA 3

4 Schritt 1 Anfertigung der Schnitte Kennzeichnung des Tumor-Areals auf HE durch PathologIn 4 6 x 5 µm Schnitte (Biopsien > 6) Schritte FFPE-Schnitte entparaffinieren 1000 µl Xylol µl Ethanol Tube kurz vortexen, 2 min zentrifugieren, Überstand vorsichtig abpipettieren 1000 µl Ethanol Tube kurz vortexen, 2 min zentrifugieren, Überstand vorsichtig abpipettieren Pellet im Thermocycler (56 C) trocknen lassen (Tube ist geöffnet) 3. Auflösung der Zellmembran (Lysozyme) und proteolytischer Abbau der Zellproteine (Proteinase K) 180 µl ATL-Puffer und 20 µl Proteinase K dazupipettieren, kurz vortexen Bis zu 65 Std. bei 56 C schütteln lassen (Formalin-crosslinking: durch Wärme teilweise reversibel!) 4. Extraktionsschritte: Trennung der verdauten Proteine von der DNA (verschiedene Methoden) Automat EZ1 (Fa. Qiagen) - Magnetpartikel 4

5 Schritt 4: Aufreinigungsmethoden Phenol-Chloroform Extraktion DNA: auf Denaturierungsmittel (z.b.gtc) verzichten Phenol Chloroform Wässrige Phase (RNA, DNA) Phasenübergang (DNA) Säulchen-Methode DNA bindet in Gegenwart hoher Salzkonzentration an Kieselgel Organische Phase (Proteine) RNA (DNA) Pellet Spin Spin Spin Spin Spin Filter DNA binding Add washing Add Binding Add washing buffer 2 buffer buffer 1 Drying Add Elution buffer Genomic DNA Magnetic-Beads mit bioaffinen Liganden Schritt 4: EZ1 Automat (Fa.Qiagen) Magnetic-Beads mit bioaffinen Liganden untersch. beschichtet (z.b.silikagel, Polymere) Probe Zugabe eines Lysepuffers Zugabe von Proteinase K Zugabe von Magnet-Partikel Festhalten der DNA Trennung der DNA Wasch-Schritt Eluierung 5

6 Schritt 4: EZ1 Automat (Fa.Qiagen) Magnetpartikel Schritt 5: Nachweismethoden Qualität: Agarose-Gelelektrophorese (0,8 %iges Agarosegel) Trennung der Nukleinsäure-Stränge aufgrund ihrer Größe Quantität: Spektralphotometer Absorptionsspektrum: nm DNA: 260 nm Proteine: 280 nm 260/280 ratio: 1,8 2,0 6

7 Anwendung DNA ist degradiert: DNA verdünnen Hemmstoffe (z.b. Melanin, Ethanol, Phenol,..) in DNA: DNA verdünnen PCR Inhibitor Removal Kit (z.b. Fa. Zymo, D6030) Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! 7

8 Fixierprogramm Routine (über Nacht) Reagenz Zeit in min Temp. C Formalin 7,5 % % Alk % Alk % Alk x 100 % Alk 3 x Xylol x Paraffin 4 x Fixierprogramm Kurzprogramm Reagenz Zeit in min Temp. C Formalin 7,5 % % Alk % Alk % Alk Xylol Paraffin

9 Geschichte Formalinfixierung - Quervernetzungen 9