Ab 1. Juli 2016 neuer EBM Humangenetik (Kap. 11) Molekularpathologie (Kap. 19) NEXT GENERATION SEQUENCING 2. Auflage 2016 NGS

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1 ZENTRUM FÜR HUMANGENETIK UND LABORATORIUMSDIAGNOSTIK (MVZ) Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen Ab 1. Juli 2016 neuer EBM Humangenetik (Kap. 11) Molekularpathologie (Kap. 19) NEXT GENERATION SEQUENCING 2. Auflage 2016 Virologie Humangene k Mikrobiologie NGS medizin Pathologie Laboratoriums- Transfusionsmedizin

2 Vorwort Die Weiterentwicklung der DNA-Sequenzanalysetechnologie ( Next Generation Sequencing oder NGS ) hat wie kaum eine andere Technologie in den vergangenen Jahren den Life Science -Bereich beflügelt und neue Zusammenhänge zwischen Genotyp und Phänotyp ans Licht gebracht. Inzwischen hat NGS auch Einzug in die medizinische Diagnostik gehalten, wodurch z.b. genetisch bedingte Erkrankungen oder genetische Veränderungen in Tumoren mit einer verbesserten Aufklärungsrate untersucht werden können. Im Vergleich zu der bisher dominierenden Sanger-Methode liegt der Durchsatz der modernen Geräte um bis zu fach höher. Das bedeutet, dass wesentlich mehr Gene als bisher und diese Gene mit einer sehr hohen Sequenziertiefe (Genauigkeit) untersucht werden können. Mit Inkrafttreten des überarbeiteten EBM für den Fachbereich Humangenetik (Kapitel 11) und Schaffung eines neuen Kapitels für Molekularpathologie (Kapitel 19) wird der Einsatz von NGS-Panels nun auch in der gesetzlichen Krankenversicherung bei den meisten Indikationen ermöglicht. Die Anforderung erfolgt mittels Überweisungsschein Muster 10. Wir haben uns bemüht, Ihnen die wichtigsten Indikationen einfach und verständlich in blauen Boxen darzustellen und diese mit dem Reiter gekennzeichnet. In bestimmten Fällen kann eine Erweiterte Diagnostik indiziert sein (grüne Boxen). Darüber hinaus gehende Analysen können bei uns in Einzelfällen und nach Rücksprache in die MIDAS-Studie (Multiple Integration of Data Annotation Study) aufgenommen werden (s. Seite 12). Es besteht weiterhin die Möglichkeit, für umfangreichere Untersuchungen (z.b. Exom-Analysen) beim Versicherer eine Kostenübernahme mit Begründung der medizinischen Notwendigkeit für den Einzelfall zu beantragen. Detailliertere Informationen zum Thema Abrechnung finden Sie auf Seite 168 ff. Die 2. Auflage des Handbuchs enthält: ü Indikationsgebiete für NGS-Analysen aus 5 Facharztbereichen ü Eingearbeitete Systematik des neuen EBM für Kapitel 11 (Humangenetik) und 19 (Pathologie) ü Hintergrundinformationen zu jedem Indikationsgebiet ü Darstellung der genetischen Heterogenität komplexer Krankheitsbilder in Venn-Diagrammen ü OMIM-P (klinische Subentitäten), OMIM-Gen- und ICD-10 Code in tabellarischer Form ü Abrechnungsinformationen Wir hoffen, Ihnen hiermit einen nützlichen Leitfaden für die immer komplexere Welt der molekulargenetischen Diagnostik an die Hand geben zu können und freuen uns auf Ihre Anregungen und Verbesserungsvorschläge. Mit kollegialen Grüßen Dr. med. Hanns-Georg Klein Dr. med. Imma Rost 1

3 Multi-Gen-Panel-Sequenzierung (MGPS) 1. Aortenerkrankungen/Bindegewebserkrankungen Marfan Syndrom (MFS) Marfan-ähnliche Erkrankungen Thorakale Aortenerkrankungen (TAAD) Bikuspide Aortenklappe mit Risiko für Aortenstenose/-dilatation Kollagen 4-assoziierte intrazerebrale Blutungen Ehlers-Danlos-Syndrom (EDS) EDS, autosomal-dominante Subtypen EDS, autosomal-rezessive Subtypen EDS, seltene Subtypen Cutis laxa (CL) Augenerkrankungen Retinitis pigmentosa Usher-Syndrom Stickler-Syndrom (STL) Senior-Løken-Syndrom Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) und Alström-Syndrom Bindegewebserkrankungen/Skeletterkrankungen Osteogenesis Imperfecta (OI) Stickler-Syndrom (STL) Jeune-/Kurzrippen-Polydaktylie-Syndrom Kraniosynostosen Blut und blutbildendes System Sphärozytose, hereditäre (HS) Fiebersyndrome Hereditäre periodische Fiebersyndrome (HPF) Gerinnungsstörungen Blutungsneigung Thromboseneigung/Thrombophilie Herzerkrankungen Arrhythmogene Erkrankungen Arrhythmogene rechtsvetrikuläre Dysplasie Brugada-Syndrom (BrS) Catecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT) Dilatative Kardiomyopathie (DCM) Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) Long QT-Syndrom (LQTS) Non-compaction Kardiomyopathie (NCCM) Angeborene Herzfehler Herzfehler, isolierte Herzfehler, syndromale Herzfehler, Heterotaxie assoziierte Herzfehler/RASopathien Immundefekte (im Kindesalter), primäre Kombinierte T- und B-Zellimmundefekte Kombinierte T- und B-Zellimmundefekte Schwere kombinierte Immundefekte T-B Schwere kombinierte Immundefekte T-B Omenn-Syndrom Agammaglobulinämie, hereditär Neutropenie, kongenital 56 2

4 9. Intelligenzminderung/Entwicklungsstörungen Rett-Syndrom/Rett-Syndrom ähnliche Erkrankungen Autosomal-rezessive primäre Mikrozephalien (MCPH) - Mikrozephalie-Kleinwuchs-Syndrome Cornelia-de-Lange-Syndrom Lungenerkrankungen Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) Interstitielle Lungenerkrankungen (ILD) / diffuse parenchymatöse Lungenerkrankungen (DPLD) Cystische Fibrose (Mukoviszidose, CF) Mitochondriale Erkrankungen Muskelerkrankungen Muskelatrophien, spinale (SMA) Muskelatrophien, spinale (SMA), frühmanifestierend Muskelatrophien, spinale (SMA), spätmanifestierend Myopathien, kongenitale Muskeldystrophien Muskeldystrophien (Dystroglycanopathien Typ A+B) Muskeldystrophien (Kollagen-assoziierte und sonstige) Myopathien, myofibrilläre (MFM) Muskeldystrophien, progressive Progressive Muskeldystrophien (Typ Duchenne/Typ Becker) Progressive Muskeldystrophien (Gliedergürtelmuskeldystrophien AD+AR) Emery-Dreifuß Muskeldystrophie Nicht-dystrophische Myotonien und periodische Paralysen Stoffwechselmyopathien Stoffwechselmyopathien 83 (Glycogenosen mit muskulärer Symptomatik und Carnitinstoffwechselstörungen) Stoffwechselmyopathien 83 (Defekte der mitochondrialen ß-Oxidation und Deletionssyndrome mit Myopathie) 13. Neurogenetische Erkrankungen Ataxien Autosomal-dominante Spinocerebelläre Ataxien Spinocerebelläre Ataxien, autosomal-rezessive Ataxien, syndromale Formen Ataxie: Leukoencephalopathie mit Verlust der weißen Substanz Ataxie mit Okulomotorischer Apraxie (AR) Ataxie: Joubert-Syndrom Episodische Ataxien Spastische Ataxien Hyperekplexie Choreatiforme Bewegungsstörungen Hereditäre Neuropathien Alzheimer Erkrankung, familiär Epilepsien, genetisch bedingt Frühkindliche epileptische Enzephalopathien Benigne Neugeborenenkrämpfe Fokale Epilepsien Generalisierte juvenile myoklonische Epilepsien Epilepsien mit Therapierelevanz Familiäre hemiplegische Migräne (FHM) Nierenerkrankungen Angeborene Fehlbildungen der Nieren und ableitenden Harnwege (CAKUT) Fehlbildungen der ableitenden Harnwege Nierenagenesie/Hypoplasie Renale tubuläre Dysgenesie Nierenerkrankungen, polyzystische Nephronophthise (NPHP) Nephrotisches Syndrom (NS)/Fokal segmentale Glomerulosklerose (FSGS) Alport-Syndrom Hyperoxalurie Laboratoriumsmedizin Mikrobiologie/Virologie Transfusionsmedizin Pathologie Humangenetik

5 15. Pankreatitis, hereditäre RASopathien Noonan-Syndrom Cardio-Fazio-Cutanes-Syndrom LEOPARD-Syndrom Schwerhörigkeit/Taubheit Taubheit, autosomal-dominant Taubheit, autosomal-rezessiv Taubheit, syndromal Taubheit, mitochondrial Usher-Syndrom (USH) Stoffwechselerkrankungen Congenitale Defekte der Glykosylierung (CDG) Fettstoffwechselstörungen primäre Hyperlipoproteinämien Harnstoffzyklus-Defekte Hyperoxalurie Maligne Hyperthermie (MH) Maturity-onset-Diabetes of the Young (MODY) Mukopolysaccharidosen (MPS) Porphyrien Ziliopathien Joubert-Syndrom Meckel-Gruber-Syndrom Jeune-/Kurzrippen-Polydaktylie-Syndrom Senior-Løken-Syndrom Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) Oro-fazio-digitales Syndrom (OFS) Primäre ziliäre Dyskinesie Heterotaxie Nephronophthise (NPHP) Polyzystische Nierenerkrankungen 143 MGPS bei hereditärer Tumorprädisposition 20. Tumorerkrankungen, familiäre Familiäres Mamma- und Ovarialkarzinom Kolonkarzinom, familiär (HNPCC, Lynch-Syndrom) Gastrointestinale Polyposis-Syndrome Multiple Endokrine Neoplasie 147 neonatalis bei Erkrankungen des Neugeborenen 21. Erkrankungen des Neugeborenen und Säuglings neonatalis basic [18 Gene] 21.2 neonatalis extended [> 600 Gene] Clinical Exome Sequencing (CES) / Whole Exome Sequencing (WES) 22. CES/WES bei kindlicher Entwicklungsverzögerung Ultradeep Sequencing (UDS) bei Keimbahnmosaik 23. Mosaik-Diagnostik

6 MGPS und Ultradeep Sequencing (UDS) bei Leukämien und Lymphomen 24. Erkrankungen der myeloischen Zellreihe Akute myeloische Leukämie (AML) Myelodysplastisches Syndrom (MDS) Chronische myelomonozytäre Leukämie (CMML) Atypische chronische myeloische Leukämie (acml) Chronische myeloische Leukämie (CML) Chronische Neutrophilenleukämie (CNL) Polyzythämia vera (PV) Primäre Myelofibrose (PMF) Essentielle Thrombozythämie (ET) Mastozytose Erkrankungen der lymphatischen Zellreihe Akute lymphatische Leukämie (ALL) Chronische lymphatische Leukämie (CLL) Haarzellleukämie (HZL) Morbus Waldenström (MW) Lymphom allgemein Großzellige granuläre Lymphozyten-Leukämie (T-LGL, NK-LGL) 157 Prenatalis - Nicht-invasiver Pränataltest (NIPT) 26. Nachweis einer Trisomie 21, 18, 13 Fehlverteilungen der Geschlechtschromosomen X und Y Prenatalis : Befundübermittlung innerhalb 8-10 Werktagen 26.2 Prenatalis Prior: Befundübermittlung innerhalb 5 Werktagen Targeted Cancer Panels an Tumormaterial 27. Tumoren des Gastrointestinaltraktes Gastrointestinale Stromatumoren (GIST) Kolorektales Karzinom (CRC) Pankreaskarzinom Tumoren des endokrinen Systems Schilddrüsenkarzinom Ovarialkarzinom Tumoren der Haut Malignes Melanom Tumoren der Lunge Lungenkarzinom, nicht-kleinzellig (NSCLC) Tumoren der Niere und der ableitenden Harnwege Harnblasenkarzinom 160 Companion Diagnostics an Tumormaterial 32. DNA-Signatur-Tests im Rahmen einer Therapieindikation HLA-Typisierung 33. HLA-Typisierung Hochauflösende HLA-Typisierung Ultrahochauflösende HLA-Typisierung 163 Laboratoriumsmedizin Mikrobiologie/Virologie Transfusionsmedizin Pathologie Humangenetik 5

7 Mikrobiologie/Virologie 34. Mikrobiom-Analyse HIV/HCV Genotypisierung und Resistenztestung Laboratoriumsmedizin 36. cf-dna-analyse Abrechnung 168 Liste der Erkrankungen/Syndrome 172 Liste der Gene 179 Impressum Alle Rechte vorbehalten Zentrum für Humangenetik und Laboratoriumsdiagnostik (MVZ) Dr. Klein, Dr. Rost und Kollegen Leistungsverzeichnis und Leitfaden für die Praxis Herausgegeben von Dr. med. Hanns-Georg Klein und Dr. med. Imma Rost Redaktion: Dr. med. Hanns-Georg Klein Grafische Gestaltung: Rüdiger Schmautz (Herrsching) Verlag: Dr. Klein, München Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Alle Rechte, auch die der Übersetzung, des Nachdrucks und der Vervielfältigung des Buches oder Teilen daraus, vorbehalten. Kein Teil des Werkes darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form (Fotokopie, Mikrofilm, Datenträger oder anderen Verfahren) reproduziert oder unter Verwendung elektronischer Systeme verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden. Wichtiger Hinweis: Wissenschaft unterliegt einem ständigen Fluss. Für die Richtigkeit des Inhalts der einzelnen Kapitel kann keine Garantie übernommen werden. Soweit möglich, wurden die wichtigsten Quellen für die wissenschaftlichen Laborinformationen angegeben. Der Kenntnisstand entspricht dem Zeitpunkt der Drucklegung im Juli

8 Next Generation Sequencing oder die Evolution der molekularen Diagnostik Die technischen Möglichkeiten, das Erbgut von Mensch, Tier und Pflanzen, aber auch das von Infektionserregern, Mikroorganismen oder Parasiten - kurz der gesamten belebten Materie - zu analysieren, haben sich seit 2007 durch Entwicklung neuer Hochdurchsatz-Methoden, die unter dem Begriff Next Generation Sequencing (NGS) zusammen gefasst werden, dramatisch weiterentwickelt. Wurde der vorläufige Abschluss des Humanen Genom-Projekts (HGP) im Jahr 2000 noch als Durchbruch in der biomedizinischen Forschung durch tausende beteiligte Wissenschaftler gefeiert, kann heute ein Humanes Genom von einem technisch versierten Mitarbeiter innerhalb von einer Woche in hoher Qualität sequenziert werden. Die Kosten für die Sequenzierung von einem kompletten menschlichen Genom haben sich in den vergangenen 15 Jahren von 100 Mio US$ auf nunmehr etwas mehr als US$ reduziert. Gleichzeitig hat sich der Durchsatz der Geräte unter der Annahme einer 100-fachen Abdeckung/Base ebenfalls um den Faktor erhöht. Zu berücksichtigen sind allerdings Leseweiten, schlecht abgedeckte Bereiche (geringe Coverage) und ca. 10% Lücken (Gaps), so dass der Einsatz der Gesamt-Genomsequenzierung für die Diagnostik derzeit noch nicht empfohlen wird (Klein HG et al, J Lab Med 38:221, 2014). Die gewaltigen technologischen Fortschritte in den DNA-Sequenziertechnologien übertreffen sogar die Geschwindigkeit der Weiterentwicklung von Speichermedien in der IT-Industrie (sog. Moore sches Gesetz) und ein Ende der Entwicklung ist derzeit noch nicht abzusehen (Klein HG und Rost I, Bundesgesundheitsbl 58:113, 2015). Auch für die Anwendungen in der Diagnostik haben die Hochleistungs-Sequenziertechnologien erhebliche Bedeutung. So wird in der Humangenetik bereits darüber diskutiert, seltene Erkrankungen anstatt der bisher üblichen Zieldiagnostik grundsätzlich einer Genomanalyse zu unterziehen. Aber wie geht man mit Zusatzbefunden um, die ein Risiko für eine spätmanifestierende neurodegenerative Erkrankung erkennen lassen? Wie kommuniziert man die zahlreichen unklaren genetischen Varianten, deren Interpretation zum heutigen Zeitpunkt noch nicht möglich ist? Wie klärt man Patienten im Sinne des Gendiagnostikgesetzes (GenDG) über Wesen, Bedeutung und Tragweite einer Genomanalyse auf? Kann ein Recht auf Nichtwissen oder Datenschutz im Zeitalter des Data Sharing und der Digitalisierung der Medizin überhaupt noch gewährleistet werden? Auch in der Pathologie tun sich bisher ungekannte Fragen auf: Inwieweit sind somatische Neumutationen, die in geringer Anzahl im Tumor nachweisbar sind, überhaupt therapierelevant? Die Liste der offenen Fragen könnte man nach Belieben verlängern. Weder die medizinischen Fachgesellschaften noch die Ärztliche Selbstverwaltung, geschweige denn der Gesetzgeber oder die Regulierungsbehörden kommen der Dynamik der Prozesse hinterher. Dies wird jedoch die Entwicklung nicht stoppen, sondern sollte Ansporn für eine aktive Mitgestaltung der Zukunft sein. 7

9 Next Generation Sequencing (NGS) - Plattformen am MVZ Martinsried Illumina HiSeq 2500 (Leseweite ca. 2 x 125 bp) Illumina NextSeq 500 Leseweite ca. 2 x 150 bp MiSeq Benchtop Sequencer Leseweite ca. 2 x 300 bp Ion Torrent PGA (Leseweite ca. 1 x 200 bp) Roche GS FLX (Leseweite ca. 600 bp) Roche GS FLX+ (Leseweiten > bp) Roche 454 Junior (Leseweite ca. 600 bp) Durchsatz*: Gb/Lauf (6 Tage) Durchsatz*: Gb/Lauf (48 Std.) Durchsatz*: 15 Gb/Lauf (65 Std.) Durchsatz*: 3 Gb/Lauf (24 Std.) Durchsatz*: 1 Gb/Lauf (10 Std.) Durchsatz*: 1 Gb/Lauf (10 Std.) Durchsatz*: 0,05 Gb/Lauf (8 Std.) *Durchsatz bei NGS bezieht sich auf 1-fache Abdeckung (Coverage) je Base. Für die Diagnostik wird mindestens 20-fache Coverage gefordert. Zum Vergleich das bisher leistungsfähigste Gerät, mit dem das Human Genom-Projekt (HGP) durchgeführt wurde: ABI 3730xl 96-Kapillar-Sequencer (Leseweite ca. 800 bp) Durchsatz: < 0,0001 Gb/Lauf (8 Std.) Analytische Ansätze in der Humangenetik Multi-Gen-Panel Sequenzierung (MGPS) Der Panel-Ansatz stellt im Grunde die Weiterentwicklung der bisherigen Stufendiagnostik mittels Sanger- Sequenzierung dar. In den vergangenen 15 Jahren wurden immer neue Gene in Assoziation mit seltenen Erkrankungen beschrieben, was dazu geführt hat, dass auch immer mehr Gene diagnostisch untersucht wurden. Viele der neu beschriebenen Gene sind jedoch weit seltener ursächlich als die bereits bekannten Hauptgene ( Core Genes ). Daher werden auch heute noch die einzelnen Gene beginnend mit den am häufigsten betroffenen Regionen stufenweise analysiert, um den Aufwand auf ein sinnvolles Maß zu begrenzen. Nun können aufgrund des enormen Durchsatzes der NGS-Methoden alle bekannten krankheitsassoziierten Gene in einem Panel-Ansatz parallel analysiert werden, wodurch der technische Aufwand deutlich reduziert wird. In gleichem Maße steigt allerdings der Aufwand für die Interpretation der zahlreichen Varianten, die bei der simultanen Analyse von mehreren Genen anfällt, deutlich an. Dennoch stellen die Panel-Ansätze in der Diagnostik von seltenen Erkrankungen heute die Methode der Wahl dar, eine Tatsache, die leider in Deutschland vom Gemeinsamen Bundesausschuß (G-BA) und den Spitzenverbänden über Jahren ignoriert wurde. Die Vorteile der Panel-Ansätze gegenüber Exom- oder Genom-weiten Ansätzen liegen derzeit noch 1) in der Qualität der analysierten Genabschnitte (keine Lücken, alle Bereiche sicher abgedeckt*), 2) in geringeren Kosten für die Reagenzien und 3) in der Vermeidung von unerwünschten Zusatzbefunden. * eine lückenlose Abdeckung und diagnostische Qualität kann nur erreicht werden, wenn die Panel-Gene gleichzeitig auch auf das Vorliegen von Mikrodeletionen untersucht werden (Klasse A-Analysequalität) 8

10 Clinical Exome Sequenzierung (CES) Im Vergleich zu Whole Exome Sequencing (WES), bei der alle proteincodierenden Bereiche angereichert und sequenziert werden, wird bei Clinical Exome Sequencing (CES) ein Subset des Exoms angereichert. Hierbei wird auf krankheitsassoziierte Gene fokussiert, die in der Human Gene Mutation Database (HGMD) beschrieben sind. Die angereicherte Region umfasst hierbei derzeit, je nach Anbieter, zwischen Gene (Agilent Inherited Disease) und Gene (Illumina TruSightOne) und damit bis zu Exons (weitere Informationen und vollständige Genliste siehe auf bzw. Der Vorteil der CES liegt in der Vorauswahl von krankheitsrelevanten Genen, die die Interpretation der identifizierten Varianten erleichtert und gleichzeitig das Auftreten von Varianten unklarer Signifikanz und das Vorkommen von Zusatzbefunden minimiert. CES ist flexibel einsetzbar für verschiedene Indikationen wie ursächlich ungeklärte Entwicklungsstörungen sowie Erkrankungen, die durch Mutationen in mehreren verschiedenen Genen bedingt sein können. Eine vollständige, lückenfreie Analyse ist allerdings bei CES nicht möglich, da - mit vertretbarem Aufwand - weder für alle untersuchten Gene eine MLPA durchgeführt werden, noch in allen Bereichen eine vollständige Abdeckung erreicht werden kann. Die Untersuchung mit CES ist derzeit keine Regelleistung der Krankenkassen. Vor der Untersuchung muss daher eine Kostenübernahme bei der Krankenversicherung beantragt werden. CES unterliegt den Regelungen des Gendiagnostik-Gesetzes (GenDG), d.h. es ist eine ausführliche Aufklärung und eine schriftliche Einwilligung, sowie vor prädiktiven Analysen (d.h. Untersuchung von Gesunden) zusätzlich eine genetische Beratung erforderlich. Da der Untersuchungsansatz sehr viele krankheitsassoziierte Gene umfasst, bieten wir für bestimmte Erkrankungen (z.b. hereditäre Krebserkrankungen oder neurodegenerative Erkrankungen) im Rahmen der Aufklärung und/oder genetischen Beratung eine Wahlmöglichkeit, diese Gene in die Auswertung mit einzubeziehen oder auszublenden (Opt-in/Opt-out). Exom 50 Mb (ca Gene) Genom 3 Gb Clinical Exom 7-12 Mb ( Gene) Schematische Darstellung der großen analytischen Ansätze in der Humangenetik: Clinical Exome ( Gene, 7-12 Mb), Whole Exome (ca Gene, 50 Mb), Whole Genome (ca Gene plus nicht-codierende Genregionen, Mb). Whole Exome Sequencing (WES) Whole Exome Sequencing (WES) umfasst die Anreicherung und Sequenzierung aller proteincodierenden Bereiche (ca Gene), wohingegen bei Clinical Exome Sequencing (CES) nur ein Subset des Exoms (krankheitsassoziierte Gene) angereichert wird. WES hat sich in der jüngeren Vergangenheit als hervorragendes Mittel zur Identifikation von krankheitsverursachenden Mutationen in bisher unbekannten Genen etabliert, sowohl im Fall von autosomal-rezessiven Erkrankungen (Ng, SB et al, Nat Genet 2009) wie auch bei autosomal-dominanten Erkrankungen (Hoischen, A et al, Nat Genet 2010). Seitdem wird WES auch immer mehr in der Diagnostik eingesetzt, vor allem bei Indikationen, bei denen Mutationen in einer Vielzahl von Genen als krankheitsverursachend in Frage kommen. 9

11 Mehrere Studien in den letzten beiden Jahren, in denen Patienten mit schwerer Intelligenzminderung (IQ<50) mittels neuer Hochdurchsatz-Techniken wie der Exom-Sequenzierung untersucht wurden, konnten bestätigen, dass autosomal-dominante Neumutationen offenbar in erheblichem Umfang zur Ursache der schweren Intelligenzminderung beitragen (z. B. Vissers L. et al, Nat Genet, 2010, de Ligt, J. et al, NEJM, 2012 und Rauch, A. et al, Lancet, 2012). Während bei chromosomalen Trisomien das Risiko mit dem mütterlichen Alter steigt, nimmt die Rate an autosomal-dominanten Neumutationen mit dem väterlichen Alter zu (Veltman JA et al, Nat Rev Genet, 2012). Bei den untersuchten Patienten wurden Varianten in verschiedenen Genen gefunden, wobei in der Studie von de Ligt et al bei 16% der Patienten eine kausale Mutation in einem bereits im Zusammenhang mit Entwicklungsstörungen beschriebenen Gen gefunden wurde, bei Rauch et al bei 35% der Patienten. Man geht daher nach diesen Studien davon aus, dass bis zu 50% der schweren, nicht-syndromalen Entwicklungsstörungen durch de novo-punktmutationen und kleine Indels verursacht werden, wobei eine große genetische Heterogenität zu beobachten ist. Mutationen in noch unbekannten bzw. nicht im Zusammenhang mit Entwicklungsstörungen bekannten Genen erfordern allerdings noch einen immensen Aufwand an integrierter Diagnostik (einschließlich funktioneller Tests), um den ursächlichen Zusammenhang zu beweisen, weshalb WES nur in besonderen Fällen für den Routineeinsatz geeignet ist. Zusätzlich zu der Diagnostik von Entwicklungsstörungen kann WES genutzt werden, um die bestehende Diagnostik zu erweitern. Im Bereich der Epilepsien, Ziliopathien (Joubert-Syndrom) und weiteren Indikationen ist der Einsatz von WES nach Rücksprache möglich. Whole Genome Sequencing (WGS) Im Vergleich zum Clinical Exome Sequencing (CES), bei dem ein Subset des Exoms angereichert und sequenziert wird oder Whole Exome Sequencing (WES), bei dem alle proteincodierenden Bereiche analysiert werden, handelt es sich bei Whole Genome Sequencing (WGS) um die Sequenzierung des gesamten Genoms, d.h. auch aller nicht codierenden Regionen (weitere Informationen siehe auf Der Vorteil der WGS liegt vor allem darin, dass keine Anreicherungsartefakte entstehen, da es sich um die direkte Analyse einer aus genomischer DNA hergestellten Library handelt. Hierdurch ist auch ein Nachweis von Copy Number Variations (CNVs) möglich. Aufgrund der Kosten, der Datenqualität und vor allem der zu erwartend besonders hohen Anzahl von unklaren Varianten (VUS) hat sich der Einsatz von WGS in der Routine-Diagnostik noch nicht durchgesetzt. Eine umfassende Aufklärung nach den Vorgaben des Gendiagnostikgesetzes (GenDG) ist bei WGS kaum noch möglich. WGS wird derzeit daher vor allem in der Erforschung von seltenen Erkrankungen und in der Onkologie (Tumorgenome) eingesetzt (Klein HG et al, J Lab Med 38:221, 2014; Klein HG und Rost I, Bundesgesundheitsbl 58:113, 2015). Wie funktionieren NGS-Technologien? Bei der Illumina Sequencing-by-Synthesis (SBS)-Methode wird die fragmentierte Template DNA über spezifische Adaptoren kovalent an einen Glasobjektträger (FlowCell) gebunden, auf dem die Sequenzierreaktion stattfindet. Von dem gebundenen Startmolekül ausgehend werden durch einen PCR-ähnlichen Schritt Cluster aus identischen Molekülen gebildet (Bridge Amplification). Die Sequenzierung erfolgt zyklisch und nutzt reversible Terminatorchemie sowie fluoreszenzmarkierte Nukleotide. In jedem Zyklus wird genau ein Nukleotid komplementär zu der Template-DNA eingebaut. Ein besonderes Merkmal der SBS-Methode ist die sog. paired-end-sequenzierung. Hierbei werden die zu sequenzierenden DNA-Fragmente von jeder Seite mit einer vorher festgelegten Leseweite von bp sequenziert. Je nach Größe der DNA-Fragmente können diese Reads überlappen oder durch einen nicht-sequenzierten DNA-Teil (Insert) getrennt sein. Dieser Ansatz bietet Vorteile bei der bioinformatischen Auswertung und kann die Genauigkeit der Analysen signifikant erhöhen. Roche 454 Sequenziersysteme verwenden Emulsions-PCR (empcr) für die klonale Amplifikation der Proben, gefolgt von hoch-parallelem Pyrosequencing. Während der empcr wird die zu sequenzierende DNA an spezifische Beads gebunden und klonal amplifiziert. Die DNA tragenden Beads werden dann angereichert und in spezielle Reaktionskammern auf sog. Pico Titre Plates (PTP) befördert, welche alle für die Sequenzierung benötigten Reagenzien enthalten. Anschließend werden sequenziell Fluoreszenz-Desoxyribonucleotide (datp, dttp, dctp, dgtp) zugegeben. Bei Komplementarität zur Base des Templates erfolgt der Einbau des korrespondierenden Desoxy-Nukleotids und die Emission eines Lichtsignals. Sind in der zu sequenzierenden DNA mehrere aufeinanderfolgende, identische Nukleotide (Homopolymere) vorhanden, 10

12 werden mehrere gleiche Nukleotide nacheinander eingebaut und das korrespondierende Lichtsignal ist proportional stärker. Life Technologies Sequenziersysteme (z.b. Ion Torrent PGA oder Proton) basieren auf einer ph-vermittelten Sequenzierung und werden auch als Post-Light -Sequenzierung bezeichnet. Die Methode folgt einem Sequenzierung-durch-Synthese-Ansatz insofern, dass ein DNA-Template durch sequentiellen Nukleotideinbau komplementiert wird. Die Methode zur Detektion der eingebauten Nukleotide unterscheidet sich allerdings substantiell von den vorher beschriebenen Methoden durch den Verzicht auf ein optisches Signal. Der Einbau eines Nukleotids involviert das Formen einer kovalenten Bindung unter Freisetzung eines Pyrophosphats und eines positiv geladenen Wasserstoffions. Der Einbau eines Nukleotids durch die DNA-Polymerase wird bei dem Ion Torrent-System durch eine Änderung des ph-wertes, ausgelöst von dem freigesetzten Wasserstoffion, detektiert. Die zu sequenzierende DNA wird in Mikroreaktionskammern auf einen Halbleiterchip gebracht. Diese Reaktionskammern enthalten die DNA-Polymerase, die verschiedenen Nuleotide werden sequentiell zugesetzt. Komplementäre Nukleotide werden von der Polymerase eingebaut und die freigesetzten Wasserstoffionen werden von einer ionensensitiven Schicht unter den Reaktionskammern detektiert. Wie bei der Roche 454 Technologie kann es zum Einbau von multiplen Nukleotiden in den Template-Strang kommen, falls eine Homopolymer-Region vorliegt. Auch hier ist das detektierte ph-signal proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide. Die Sequenzierung eines Halbleiterchips dauert 2-4 Stunden, die Leseweite beträgt je nach eingesetztem Kit durchschnittlich 100, 200 oder 300 bp. Es werden verschiedene Chip-Größen angeboten, die einen flexiblen Durchsatz ermöglichen: bis 10 Mb mit dem 314 Chip, bis 100 Mb mit dem 316 Chip und bis zu 1 Gb mit dem 318 Chip. Bioinformatik - Management von Big Data Die Bioinformatik ist ein interdisziplinäres Feld der Naturwissenschaft, das Methoden für die computergestützte Analyse, Organisation und Speicherung von biologischen Daten entwickelt und implementiert. Ein wichtiges Aufgabenfeld der modernen Bioinformatik ist die Entwicklung von spezifischer Software für die Analyse und Extraktion von biologisch oder klinisch relevanten Daten aus großen Mengen an Rohdaten. Die Bioinformatik hat sich zu einem essentiellen Gebiet innerhalb der molekularen Biologie entwickelt und wird besonders in der Genetik und Genomik eingesetzt. Mithilfe von bioinformatischen Methoden und Software wird die Sequenzierung und Annotation von Genen und Genomen und die Identifikation der enthaltenen genetischen Varianten unterstützt. Auch die Auswertung von weiteren genomweiten Untersuchungen wie Array-CGH, Identifikation von Repeat-Regionen, die Suche nach speziellen Sequenzmustern (Promoterregionen, Transkriptionsfaktor- oder MikroRNA-Bindestellen) oder die Erstellung von Protein- Interaktionsnetzwerken wird mittels bioinformatischer Methoden und Algorithmen durchgeführt. Die Bioinformatik benutzt und integriert dabei Methoden aus der Informatik, Mathematik und (Bio-) Statistik. Die Auswertung und Speicherung von biologischen Daten kann Algorithmen aus den Feldern Data Mining, maschinelles Lernen, Datenbanktheorie und künstliche Intelligenz beinhalten. Häufig benutzte Programmiersprachen für die Implementierung von bioinformatischer Software sind zum Beispiel Java, Perl, Python, R, SQL oder MATLAB. Insbesondere bei der Auswertung von NGS-Daten kommt die Bioinformatik zum Einsatz. Einzelne Auswerteschritte werden hierbei zu einer Pipeline zusammengeführt, um eine Automatisierung der Datenanalyse zu erreichen. Die Rohdaten der Sequenzierung liegen im sogenannten.fastq Format vor, das alle Sequenzen und deren korrespondierende Qualitätswerte enthält. Als erstes werden die Reads den jeweiligen Patientenproben zugeordnet, die über einen eindeutigen Barcode identifiziert werden (Demultiplexing). Danach werden die Sequenzen der einzelnen Proben an das Humangenom (hg19) aligniert (Mapping). Mit diesem Mapping als Grundlage wird ein Variant Call durchgeführt, der alle Abweichungen der zu analysierenden Sequenzen von der Referenzsequenz in Form einer Tabelle ausgibt. Diese werden neben Exonnummerierung, cdna- und Aminosäureaustausch mit verschiedenen externen Ressourcen und Datenbanken wie HGMD, dbsnp, COSMIC, dbnsfp, PGX, sowie Daten aus großen, internationalen Sequenzierprojekten wie dem Exome Variant Server (EVS) und dem Exome Aggregation Consortium (ExAC), Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM ) Informationen und experimentell verifizierten transcription factor-binding sites (TFBS) annotiert. Des Weiteren werden Bereiche, die nicht ausreichend für eine diagnostische Beurteilung abgedeckt sind detektiert (Coverage < 20). Diese Bereiche können gegebenenfalls mittels Sanger-Sequenzierung nachanalysiert werden. 11

13 MIDAS (Multiple Integration of Data Annotation Study) Das MIDAS-Projekt setzt genetische Informationen strukturiert in einen Kontext zu Phänotyp-Merkmalen. Die Erfassung der Phänotypdaten erfolgt mittels der international verwendeten Human Phenotype Ontology (HPO), die Zuordnung der Genotypen über den MIDAS-Algorithmus. Zu beachten sind: - Diagnostischer Fokus (Indikationsgruppen, Gene mit Krankheitsassoziation), - Vollständigkeit der durchgeführten Analytik (Abdeckung, diagnostische Lücken), - Bewertung der detektierten genetischen Varianten (Klasse 1-5). Durch die Auswertung von Genotyp-Phänotyp-Korrelationen können Ähnlichkeiten in der Symptomatik verschiedener Krankheitsbilder erkannt und gezielt für die Auswertung und Befunderstellung verwendet werden. D.h. neugewonnene Erkenntnisse bei der Datenerhebung und Analyse eines Patienten stehen dann auch direkt für andere Patienten zur Verfügung, die möglicherweise von der gleichen seltenen Erkrankung betroffen sind. Die Begutachtung der Analyseergebnisse großer Mengen genetischer Daten aus NGS-Analysen wird somit erleichtert, das Risiko für Fehlinterpretationen reduziert. Die MIDASDatenbank nützt Informationen von allen sequenzierten Proben in anonymisierter Form zur internen Qualitätskontrolle, der Detektion von potentiellen Artefakten der Sequenzierung und zur Bestimmung der Frequenz jeder Variante in dem hausinternen Patientenkollektiv. Die Datenbank ist über ein Webinterface abfragbar und erlaubt ein dynamisches Filtern der Daten während der Auswertung. M I D A S T U D Y "Core Genes in der humangenetischen Diagnostik "Core Genes oder Hauptgene beziehen sich auf ein oder mehrere klinische Kernsymptome und umfassen alle erforderlichen Gene, die obligatorisch bei der diagnostischen Abklärung einer Erkrankung oder Verdachtsdiagnose untersucht und beurteilt werden müssen. Alle "Core Genes müssen zu 100% abgedeckt sein, d.h. sie dürfen keine diagnostischen Lücken (Gaps) aufweisen (s. auch Guidelines for diagnostic nextgeneration sequencing, EuroGenTest 2014, sog. Klasse A-Analysequalität, s. auch Rehm HL et al, Genet Med 15:733, 2013) Merkmale von "Core Genes - Gene aus etablierter Standard-/Stufendiagnostik, für die prophylaktische oder therapeutische Konsequenzen bereits bekannt und/oder etabliert sind (z.b. Gene aus existierenden Leitlinien oder Empfehlungen von Fachgesellschaften), - Gene, die aufgrund von Literatur- und Datenbank-Recherchen als (sehr wahrscheinlich) krankheitsassoziiert eingestuft werden müssen, - Gene, bei denen die Befundrückführungszeit 12 Wochen nicht übersteigt, - Gene, deren Qualifikationskriterien regelmäßig überprüft werden. Einschlußkriterien für "Core Genes - möglichst mehrfach beschrieben, auch in verschiedenen Familien, - wissenschaftlich belegte funktionelle Signifikanz im Zusammenhang mit der Erkrankung, - diagnostische Sensitivität > 1% der klinisch gesicherten Fälle, - diagnostische Sensitivität 0,1 1% bei sehr seltenen Erkrankungen und bei therapeutischer Konsequenz. Ausschlußkriterien für "Core Genes - isolierte Evidenz aus Assoziationsstudien, - genetische Varianten mit hoher Frequenz in der Normalbevölkerung in Abhängigkeit von der jeweiligen Erkrankung und dem Vererbungsmodus. 12

14 Variantenklassifikation Eine weitere wichtige Forderung der Fachgremien sind transparente und nachvollziehbare Regelungen, nach welchen Kriterien genetische Varianten beurteilt und eingeordnet werden. Hier hat sich in den vergangenen Jahren eine Klassifikation aus 5 Kategorien durchgesetzt, die jeder Anbieter entsprechend seines Leistungsspektrums definieren soll (Richards S et al, Genet Med, March 2015, doi: /gim / Sukhai MA et al, Genet Med, April 2015,doi: /gim ). Klasse Bezeichnung Beschreibung 5 pathogene Mutation a) ln der Literatur bzw. in genspezifischen Mutations- Datenbanken als eindeutig pathogen beschriebene Mutationen b) nicht in der Literatur beschriebene Mutationen: - Nonsense- und Frameshift-Mutationen (Ausnahme Nonsense nahe Carboxyterminus) - Spleißmutationen in hochkonservierten Bereichen (+1+2/-1-2) - Deletionen (eines oder mehrerer Exons, außer in frame) - Sonstige als eindeutig pathogen beschriebene Varianten, deren Ursächlichkeit z.b. durch Segregations- bzw. Funktionsanalysen nachgewiesen wurde c) nicht beschriebene Missense-Varianten, deren Aminosäuresubstitution bei dieser Erkrankung ein sehr starkes Indiz für Ursächlichkeit darstellt (Glycin-Substitution im COL1A1-Gen bei Osteogenesis imperfecta, Cystein- Substitution in FBN1-Gen...) 4 wahrscheinlich pathogene Variante 3 Variante unklarer Signifikanz 2 wahrscheinlich benigne Variante a) Spleißvarianten in mäßig konservierten Bereichen, bei denen in silico- Programme einen deutlichen Spleißdefekt vorhersagen (MaxEntScan >45% Reduktion) b) nicht beschriebene Varianten, die gemäß ACMG-Leitlinien als Klasse 4- Variante eingestuft werden können c) nicht beschriebene Missense-Varianten, die von mind. 3 in silico-programmen als pathogen bewertet werden und die mit einer Häufigkeit <0,01% (krankheitsabhängig) in der Normalbevölkerung auftreten und zusätzlich eine vergleichbare eindeutig pathogene Aminosäure-Substitution an derselben Position bekannt ist. a) Varianten, die gemäß ACMG-Leitlinien als Klasse 3 eingestuft werden b) bekannte in der Literatur kontrovers diskutierte Varianten c) Varianten, die keiner anderen Klasse zugeordnet werden können. a) Varianten, die gemäß ACMG-Leitlinien als Klasse 2 eingestuft werden b) Klasse 3- oder 4-Varianten, die nicht mit der Erkrankung kosegregieren, c) Varianten, die gemeinsam mit einer Klasse 5-Mutation in trans auftreten (dominante Erkrankungen). 1 benigne Variante/ Polymorphismus a) Varianten, die in der Literatur oder den Datenbanken als solche(r) beschrieben sind, b) Varianten mit einer im Verhältnis zur Prävalenz der Erkrankung zu hohen Frequenz in der Normalbevölkerung. 13

15 Qualitätsmerkmale entsprechend EuroGenTest-Leitlinie Guidelines für den Einsatz von NGS in der Diagnostik Durch die Einführung von neuen Sequenziertechnologien werden auch neue Herausforderungen an bestehende Prozesse wie die Validierung von genetischen Untersuchungen gestellt. Bisherige Guidelines für die Test-Validierung (wie zum Beispiel Mattocks et al, 2010) können nicht ohne Anpassungen übertragen werden. Es ist notwendig, Qualitätskriterien und Standards für diese Technologien neu zu definieren (Guidelines for diagnostic next generation sequencing, Matthijs et al, 2015, Eur J Hum Genet, accepted, Je nach angelegten Qualitätskriterien lassen sich NGS-basierte Tests in drei Gruppen einteilen: Typ A Test Diese Art von Test bietet die vollständigste Analyse die mit dem derzeitigen Stand der Technik durchführbar ist. Das bedeutet, dass alle Zielregionen entweder ausreichend mittels NGS-Reads abgedeckt sind (Coverage 20x). Ist eine Zielregion nicht ausreichend abgedeckt, werden alle Lücken mittels Sanger-Sequenzierung geschlossen. Bei einem Typ A Test werden alle Gene des Panels vollständig abgedeckt. Typ B Test Bei sehr großen MGPS-Analysen (> 50 Gene) ist es oft nicht mehr möglich, für alle Gene eine lückenlose Abdeckung zu garantieren. Deswegen werden hier nur die jeweiligen Core-Gene vollständig abgedeckt. Nur für diese Gene werden eventuelle Lücken mittels Sanger-Sequenzierung geschlossen, Lücken in Nicht- Core-Genen bleiben bestehen. Es handelt sich hierbei um Tests, die dafür bestimmt sind, Verdachtsdiagnosen zu bestätigen, nicht jedoch um Diagnosen ausschließen zu können. Typ C Test Typ C Tests verwenden ausschließlich NGS-Sequenzierdaten, eventuelle Lücken werden nicht mit Sanger- Sequenzierung geschlossen. Ein Beispiel hierfür wäre die Whole-Exome Sequenzierung bei Entwicklungsverzögerungen, bei der hunderte von potenziell ursächlichen Genen bekannt sind. Aufgrund der Heterogenität dieser Erkrankungsgruppe ist es kaum möglich, Core-Gene zu definieren. Die Einteilung in Typ A, B und C Tests bezieht sich ausschließlich auf Sequenziertechnologien. Je nach Erkrankung und Indikationsgruppe kann es nötig sein, einzelne oder mehrere Gene zusätzlich auf Mutationen, die mit Sequenziertechnologien nicht erkannt werden können, zu untersuchen. Hier müssen andere Analyseverfahren wie MLPA oder Blotting-Analysen eingesetzt werden. Zusatzbefunde Der Umgang mit Zusatzbefunden, das heißt die Identifikation von pathogenen Varianten einer nicht-angeforderten Indikation, muss klar geregelt sein. Diese Art von Zusatzbefunden tritt am häufigsten bei genomweiten Untersuchungen wie WES oder WGS auf, ist allerdings auch bei MGPS nicht vollständig ausgeschlossen. Der Umgang mit diesen Daten wird derzeit kontrovers diskutiert und reicht bis zu Empfehlungen des American College of Human Genetics, 56 Gene z.b. für Tumordispositions-Syndrome bei jedem Patienten aktiv zu begutachten (Berg et al, 2013; Christenhusz et al, 2013; McGuire et al, 2013; van El et al, 2013; ACMG, Green et al, 2013). Einigkeit besteht darüber, dass eine aktive und gründliche Aufklärung der Patienten erfolgen muss, und diese eine Wahlmöglichkeit besitzen müssen, ob Zusatzbefunde mitgeteilt werden sollen oder nicht. 14

16 Aufklärung und Genetische Beratung bei NGS (MGPS, CES, WES, WGS) Die Analyse zahlreicher oder aller Gene in einem Ansatz erfordert eine besondere bzw. erweiterte Aufklärung des Patienten im Vorfeld. Bei CES, WES und v.a. WGS ist eine umfassende Aufklärung, wie sie das GenDG vorsieht und die möglichst alle Eventualitäten einer Untersuchung erfasst, nicht mehr möglich. Umso wichtiger ist es, die im Folgenden genannten Punkte anzusprechen und eine genetische Beratung durchzuführen. Es muss auf die Möglichkeit von Zufalls- oder Zusatzbefunden aufmerksam gemacht werden und auf die Möglichkeit unklarer Befunde. Beispiel: MGPS bei der Fragestellung arrhythmogene Herzerkrankung. Es wird eine pathogene Mutation in einem Ionenkanalgen gefunden, die auch bereits im Zusammenhang mit Epilepsie beschrieben wurde. Das Resultat kann für die Beurteilung der Symptomatik (Synkope oder Krampfanfall?), Diagnostik und Therapie des Patienten von Bedeutung sein. Es muss im Vorfeld besprochen werden, welcher Art solche Zusatzbefunde sein können, ob bestimmte Gene (z.b. für erbliche Tumordispositionssyndrome bei CES/WES) nicht untersucht werden (sollen), welche Zusatzbefunde mitgeteilt werden können oder sollen (s.a. Stellungnahme der GfH zu Zusatzbefunden, Newsletter/Archiv/gfh_newsletter_2013_01.htm). Unklare Befunde: bei der Analyse einer Vielzahl von Genen nimmt die Wahrscheinlichkeit, eine Vielzahl von Varianten nachzuweisen, zu. Darunter werden auch solche sein, die mit dem derzeitigen Kenntnisstand nicht eindeutig als krankheitsverursachend oder als nicht relevanter Polymorphismus einzuordnen sind. Der Patient sollte also darauf aufmerksam gemacht werden, dass die erweiterte Diagnostik nicht unbedingt gleichbedeutend mit einer sicheren Diagnose ist. CES und WES sollten außerdem im Rahmen einer genetischen Beratung und in enger Kooperation mit den betreuenden Ärzten erfolgen, um wichtige klinische Daten zu erfassen, den Untersuchungsmodus (z.b. Trioanalyse mit Erfassung von Varianten in Proben der Eltern, Erfassung des wahrscheinlichsten Vererbungsmodus) festzulegen und eine erweiterte Aufklärung (s.o.) vorzunehmen. Humangenetik 15

17 Multi-Gen-Panel-Sequenzierung (MGPS) 1. Aorten- und Bindegewebserkrankungen Dr. rer. nat. Karin Mayer Der gemeinsame molekularpathologische Nenner von primären Aortenerkrankungen (Aortopathien) und Bindegewebserkrankungen mit Aortenbeteiligung sind angeborene, genetisch bedingte Störungen a) der extrazellulären Matrix-Proteine, b) des TGF-beta-Signaltransduktionswegs oder c) der Strukturproteine der glatten Gefäßmuskulatur. Während Störungen unter a) und b) zu einer Schwächung der bindegewebigen Textur der Gefäßadventitia führen, sind Fehlfunktionen unter c) mit Funktionsverlusten des kontraktilen Apparats verbunden. Beides ist mit Einschränkungen der Windkesselfunktion der Aorta und einem erhöhten Risiko für Aneurysmen bzw. Aneurysma-Rupturen im arteriellen System verbunden. Gravierende, lebensbedrohliche Komplikationen reichen von Rupturen der Aorta ascendens bis hin zur Mesenterialarterien- Ruptur (z.b. in der Schwangerschaft). Seit der Identifikation der genetischen Ursache bei Marfan-Syndrom durch Identifizierung des Fibrillin 1- Gens (FBN1) wurden zahlreiche klinisch mehr oder weniger abgrenzbare Differenzialdiagnosen beschrieben und genetisch charakterisiert. Aortenerkrankungen sind ein Paradebeispiel für genetische und phänotypische Heterogenität und sind durch Pleiotropie gekennzeichnet. Schematische Darstellung der phänotypischen und genetischen Heterogenität bei Aortopathien. Core Genes (entsprechend der Clinical utility gene card für TAAD) sind fett dargestellt. 16

18 1.1 Marfan-Syndrom, Typ 1 Fibrillinopathien Dr. rer. nat. Karin Mayer Die häufigste Bindegewebserkrankung ist das klassische Marfan-Syndrom (MFS), das durch Mutationen in Fibrillin-1 bedingt ist. Bei den klinischen Symptomen stehen die Beteiligung von Herz- und Gefäßsystem, Skelett und die Augen (Linsenluxation) im Vordergrund. Anhand der revidierten Ghenter Nosologie von 2010 kann bei Vorliegen einer isolierten Aortenwurzeldilatation bzw. -dissektion oder einer isolierten Linsenluxation mit dem Nachweis einer Mutation im FBN1-Gen die Diagnose MFS gesichert werden, wenn diese im Zusammenhang mit einer Aortenwurzelerweiterung beschrieben ist. Dagegen führt eine Linsenluxation mit dem Nachweis einer heterozygoten FBN1-Mutation, die nicht mit Aortenwurzeldilatation assoziiert ist, zur Diagnose eines Ektopia Lentis-Syndroms (ECTOL1). FBN1-Mutationen sind bei Patienten mit klassischem Marfan-Syndrom beschrieben, aber auch bei den alternativen Diagnosen MASS-Phänotyp (Myopie, Mitralklappenprolaps, grenzwertige Aortenwurzeldilatation, Striae und Skelettbeteiligung) und Mitralklappenprolaps-Syndrom (MVPS). Andere Typ 1-Fibrillinopathien sind: - die akromikrische Dysplasie, die durch Kleinwuchs, kurze Hände und Füße, leichte faziale Dysmorphien und charakteristische Röntgenbefunde an den Händen charakterisiert ist, - die dominante Geleophysische Dysplasie, eine seltene Skelettdysplasie gekennzeichnet durch Kleinwuchs, prominente Fehlbildungen der Hände und Füße und ein charakteristisches Gesicht, - das Stiff-Skin-Syndrom, das durch harte, dicke Haut am gesamten Körper charakterisiert ist, wodurch die Beweglichkeit der Gelenke eingeschränkt wird und Gelenkkontrakturen die Folge sind, - das autosomal-dominant vererbte Weill-Marchesani-Syndrom, gekennzeichnet durch Minderwuchs, Brachydaktylie, Gelenkversteifung und charakteristischen Augenanomalien (Mikrosphaerophakie, Linsenektopie, schwere Myopie, Glaukom). Literatur Loeys et al, J Med Genet 47:476 (2010) Humangenetik Marfan-Syndrom und Typ 1 Fibrillinopathien Mutationssuche entspr. EBM Kapitel , GOP und (3 Gene): FBN1, ggf. TGFBR1 und TGFBR2 Marfan-Syndrom und Typ 1-Fibrillinopathien - klinisch abgrenzbare Subgruppen Erkrankung OMIM-P ICD-10 Gen OMIM-G Marfan-Syndrom (MFS) Q87.4 FBN MASS-Syndrom (MASS) Q87.4 FBN Ektopia lentis, familiär, isoliert (ECTOL1) Q12.1 FBN Akromikrische Dysplasie (ACMICD) Q77.8 FBN Geleophysische Dysplasie (GPHYSD2) Q87.1 FBN Stiff-Skin-Syndrom (SSKS) FBN Weill-Marchesani-Syndrom (WMS2) Q87.0 FBN Marfan-ähnliche Erkrankungen Dr. rer. nat. Karin Mayer Während heterozygote FBN1-Mutation die Ursache des dominant vererbten Ektopia Lentis-Syndroms (ECTOL1) sind, führen Mutationen im ADAMTS4-Gen zur rezessiv vererbten isolierten Linsenluxation (ECTOL2). Differenzialdiagnostisch zum klassischen MFS ist aufgrund der phänotypischen Überlappungen der kraniofazialen, kardiovaskulären, Skelett- und Hautmanifestationen das Shprintzen-Goldberg-Syndrom (SGS) zu nennen, wobei mentale Retardierung und Hypotonie der Skelettmuskulatur zusätzlich vorkommen. SGS ist hauptsächlich durch Mutationen im SKI-Gen bedingt. Die kongenitale kontrakturelle Arachnodaktylie (CCA) ist durch einen marfanoiden Habitus, Spinnenfingrigkeit, Gelenkkontrakturen, Kyphoskoliose, Muskelhypotonie, Ohrmuscheldysplasien und Aortenwurzelerweiterung gekennzeichnet. CCA ist durch Muta- 17

19 tionen im FBN2-Gen bedingt. Lujan-Fryns-Syndrom, das auch als X-chromosomale geistige Retardierung (XLMR) mit marfanoidem Habitus bezeichnet wird, weist mit marfanoidem Habitus, kraniofazialen Merkmalen, generalisierter Muskelhypotonie und Verhaltensproblemen sowohl Überlappungen mit MFS als auch mit SGS auf. Die Vererbung ist X-chromosomal-rezessiv mit Mutationen in den Genen MED12, UPF3B und ZDHHC9. Literatur Ahram et al, Am J Hum Genet 84:274 (2009) / Doyle et al, Nature Genet 44:1249 (2012) / Schwartz et al, J Med Genet 44: 472 (2007) Marfan-ähnliche Erkrankungen Mutationssuche entspr. EBM Kapitel , GOP (6 Gene): ADAMTSL4, FBN2, SKI, MEDF12, UPF3B, ZDHHC9 23,2 kb MFS-ähnliche Erkrankungen - klinisch abgrenzbare Subgruppen Erkrankung OMIM-P ICD-10 Gen OMIM-G Ektopia lentis, isoliert (ECTOL2) Q12.1 ADAMTSL4* Kongenitale kontrakturelle Arachnodaktylie Q68.9 FBN2* Shprintzen-Goldberg-Syndrom (SGS) Q87.8 SKI Lujan-Fryns-Syndrom Q87.8 MED XLMR mit marfanoidem Habitus Q87.8 UPF3B XLMR mit marfanoidem Habitus Q87.8 ZDHHC * auch einzeln anforderbar 1.3 Thorakale Aortenerkrankungen Dr. rer. nat. Karin Mayer Thorakale Aortenaneurysmen und Dissektionen (TAAD), welche die Aorta ascendens unmittelbar hinter der Aortenklappe (Typ A-Dissektion) oder die Aorta descendens im Bereich der linken Arteria subclavia distal des Aortenbogens (Typ B-Dissektion) betreffen, können in Verbindung mit einem genetisch bedingten Syndrom oder isoliert vorkommen. Etwa 10-20% sind autosomal-dominant vererbt, mit reduzierter Penetranz und variabler Expressivität. TAAD sind sowohl klinisch als auch genetisch heterogen. Zu den syndromalen Aortenerkrankungen zählen Marfan-Syndrom (MFS; FBN1-Gen), Loeys-Dietz-Syndrom Typ 1 und 2 (LDS1, LDS2; TGFBR1-Gen und TGFBR2-Gen), Loeys-Dietz-Syndrom Typ 3 (LDS3; SMAD3-Gen), Loeys-Dietz- Syndrom Typ 4 (LDS4; TGFB2-Gen) und Loeys-Dietz-Syndrom Typ 5 (LDS5; TGFB3-Gen), sowie das vaskuläre Ehlers-Danlos-Syndrom (EDS Typ IV; COL3A1-Gen), das Ehlers-Danlos-Syndrom mit periventrikulärer Heterotopie (EDS, PVNH4; FLNA-Gen), das klassische Ehlers-Danlos-Syndrom (EDS Typ I/II; COL5A1-Gen, COL5A2-Gen, COL1A1-Gen) und das Ehlers-Danlos-Syndrom kyphoskoliotischer Typ (EDS Typ VIA; PLOD1- Gen). Für isolierte familiäre TAAD wurden in Kopplungsanalysen bisher neun Genorte lokalisiert und sieben Gene identifiziert: AAT3 auf Chromosom 3p24-25 (TGFBR2-Gen), AAT4 auf Chromosom 16p13.13-p13.12 (MYH11-Gen), AAT5 auf Chromosom 9q33-q34 (TGFBR1-Gen), AAT6 auf Chromosom 10q22-24 (ACTA2- Gen), AAT7 auf Chromosom 3q21 (MYLK-Gen), AAT8 auf Chromosom 10q11.2-q21.1 (PRKG1-Gen) und AAT9 auf Chromosom 12p13.31 (MFAP5-Gen). Für AAT1 auf Chromosom 11q23-24 und AAT2 auf Chromosom 5q13-14 wurde bisher kein Gen identifiziert. Weitere Gene mit Mutationen bei TAAD sind MAT2A und SMAD2, sowie GATA5, LOX, NOTCH1 und SMAD6, wobei Veränderungen in den drei letztgenannten Ursachen für eine bikuspide Aortenklappe darstellen. Seltene Syndrome mit Risiko für TAAD sind das Arterial Tortuosity Syndrom (ATS; SLC2A10-Gen), die dominante Cutis laxa Typ 1 (ADCL1; ELN-Gen) und die rezessive Cutis laxa Typ 1B (ARCL1B; EFEMP2-Gen). Mutationen in den Genen für die α1- und α2-kette des Typ IV- Kollagens (COL4A1, COL4A2) führen zu intrazerebralen Blutungen. Da die klinische Differenzialdiagnose bei Aortenerkrankungen oft schwierig ist, stellt die genetische Diagnostik mittels NGS eine Möglichkeit der Ursachenfindung dar. Literatur Arslan-Kirchner et al, Eur J Hum Genet 24 (2016) / Bowdin et al, Canadian J Cardiol 32:131 (2016) / Guo et al, Am J Hum Genet 93:398 (2013) / Milewicz et al, in: GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle;