TrueScience RespiFinder Identification Panels

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1 TrueScience RespiFinder Identification Panels KURZANLEITUNG Die Richtlinien zur Sicherheit und Biogefährdung finden Sie im Abschnitt Safety im TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). Warnungen und Sicherheitsmaßnahmen finden Sie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Product Insert (PN ). Lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter aller Chemikalien und befolgen Sie die Handhabungsanweisungen. Tragen Sie eine geeignete Schutzbrille sowie Schutzkleidung und -handschuhe. Weitere Informationen zu den TrueScience RespiFinder Identification Panels finden Sie im Internet unter Die TrueScience RespiFinder Identification Panels Benutzerhandbücher können Sie auf unter der Rubrik Literature/ Support herunterladen. Diese Kurzanleitung behandelt folgende Themen: Panels Produktbeschreibung und Verfahrensprinzip Verwendungszweck Support-Anfragen Vor Beginn: Einmalige Verfahren Verfahrensweise Panels Diese Kurzanleitung behandelt die folgenden TrueScience RespiFinder Identification Panels: Panel Lagerung TrueScience RespiFinder 15 Viral Identification Panel 50 Tests TrueScience RespiFinder 19 Pathogen Identification Panel 50 Tests Produktbeschreibung und Verfahrensprinzip Die TrueScience RespiFinder Identification Panels verwenden einen Multiplex-PCR-Test zur Detektion und Differenzierung von Pathogenen, die Atemwegsinfektionen hervorrufen können. Der TrueScience RespiFinder Identification Panels Assay umfasst einen Verfahrensschritt der kombinierten Reversen Transkription/PCR (zur Umwandlung viraler RNA in cdna und zur Amplifikation der Target- DNA/cDNA), einen Schritt der Sondenhybridisierung und einen Schritt der Sondenligation/-amplifikation. Der Assay enthält eine Internal Amplification Control (IAC) zur Unterscheidung von richtig negativen und falsch negativen Proben, verursacht durch Degradation der Nukleinsäure, PCR-Hemmung oder Handhabungsfehler. Die Targets können durch DNA-Fragmentlängenanalyse unter Verwendung der Kapillarelektrophorese detektiert werden. Weitere Informationen finden Sie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). Panel Detektierte Pathogene Anzahl der Target- Sondensets Längenbereich der Sonde TrueScience RespiFinder 15 Viral Identification Panel TrueScience RespiFinder 19 Pathogen Identification Panel 14 RNA-Viren und 1 DNA-Virus 15 plus IAC 163 bis 498 Nukleotide 14 RNA-Viren, 1 DNA-Virus und 4 Bakterien 19 plus IAC Verwendungszweck Bei den TrueScience RespiFinder Identification Panels handelt es sich um qualitative Multiparametertests zur gleichzeitigen Detektion und Identifikation verbreiteter Pathogene der Atemwege aus aufgereinigten Gesamtnukleinsäuren.

2 Als Eingangsprobe dienen Gesamtnukleinsäuren, die aus nasopharyngealen Abstrichen, Nasenaspiraten, Sputum und bronchoalveolären Lavagen (BAL) von Patienten mit Verdacht auf Atemwegsinfektionen extrahiert und aufgereinigt wurden. Die Vorbereitung von klinischen Proben erfolgt in einem separaten Verfahren, das nicht Bestandteil der Panels ist. Verwenden Sie geeignete Verfahren und Produkte zur Handhabung von Proben und der Extraktion und Aufreinigung von Nukleinsäuren. In Verbindung mit anderen klinischen Befunden und Laborergebnissen unterstützen die TrueScience RespiFinder Identification Panels die Diagnose von Atemwegsinfektionen. Negative Ergebnisse deuten nicht zwangsläufig auf die Abwesenheit einer viralen oder bakteriellen Atemwegsinfektion hin; negative Ergebnisse sollten nicht die alleinige Grundlage für eine Diagnose, Behandlung oder andere Therapieentscheidungen bilden. Positive Ergebnisse schließen keine Begleitinfektion mit anderen Pathogenen aus. Das bzw. die detektierten Pathogene sind unter Umständen nicht eindeutig als Ursache der Erkrankung auszumachen. Andere Laboruntersuchungen und eine Beurteilung der klinischen Präsentation müssen ebenfalls in die abschließende Diagnose einfließen. Die Leistungsmerkmale wurden mittels validierter EQA-Panels von ermittelt. Das Produkt ist zur Verwendung durch qualifiziertes Laborpersonal und in Verbindung mit bestimmten Geräten und spezieller Datenanalysesoftware von Life Technologies vorgesehen. Support-Anfragen Die aktuellen Service- und Supportinformationen für alle Standorte finden Sie auf unter der Rubrik Support, oder kontaktieren Sie Ihren zuständigen Ansprechpartner von Life Technologies. Vor Beginn: Einmalige Verfahren Vorbereiten der Arbeitsumgebung Um eine Kontamination zu vermeiden, wird dringend empfohlen, die Aktivitäten im Rahmen des Verfahrens in abgegrenzten Bereichen durchzuführen. Ausführliche Informationen hierzu finden Sie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). Programmieren des Thermocyclers Programmieren Sie den Thermocycler mit den folgenden drei Programmen: 1. Programm für Reverse Transkription und PCR 2. Programm für Sondenhybridisierung 3. Programm für Ligation und PCR Phase Temp. Zeit (mm:ss) Phase Temp. Zeit (mm:ss) Phase Temp. Zeit (mm:ss) Reverse Transkription Aktivierung Hot-Start-Taq Cycling: 30 Zyklen 50 C 30:00 DNA- Denaturierung 95 C 15:00 Sondenhybridisierung 98 C 10:00 Sondenligation 54 C 15:00 60 C 60:00 Initiale Denaturierung 95 C 2:00 94 C 00:30 Halten 60 C Direkt mit Cycling: 94 C 0:30 55 C 00:30 dem 33 Zyklen nächsten 60 C 0:30 72 C 01:00 Schritt 72 C 1:00 fortfahren Halten 20 C Direkt mit der Kapillarelektrophorese fortfahren oder lagern Halten 20 C Direkt mit dem nächsten Schritt fortfahren oder lagern Lagerung bei 4 C für bis zu 1 Woche oder bei 20 C für längere Zeiträume. Einrichten der Datenerfassungssoftware Vor der ersten Verwendung der TrueScience RespiFinder Identification Panels ist die 3130/3130xl Data Collection Software v3.0 oder v3.1 oder die 3500 Data Collection Software v1.0 einzurichten. Hinweise zum Einrichten der Software finden Sie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide (PN ). Das Benutzerhandbuch können Sie auf unter der Rubrik Literature/Support herunterladen. 2

3 Verfahrensweise 1 Gesamtnukleinsäuren extrahieren und Internal Amplification Control (IAC) zu den lysierten Proben geben a. Klinische Proben entnehmen. Die Richtlinien hierzu finden Sie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). b. (Empfohlen:) Bei Proben, die viskos sind und/oder feste zelluläre Bestandteile aufweisen, eine Vorbehandlung durchführen. Ausführliche Informationen hierzu finden Sie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). c. Gesamtnukleinsäuren (RNA und DNA) mittels eines geeigneten Extraktionsverfahrens und gemäß der Anleitung des Herstellers extrahieren. Validierte Extraktionsverfahren finden Sie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol (PN ). Bei den meisten Extraktionsverfahren wird die Verwendung von 200 µl Probenmaterial und eine Elution in 100 µl Elutionspuffer empfohlen. d. Nach der Inkubation der Proben mit dem Lysepuffer die Internal Amplification Control (IAC) hinzufügen und gut durchmischen. 5 µl IAC für jeweils 100 µl Elutionspuffer hinzufügen. WICHTIG! Bei allen Extraktionsverfahren darf die IAC erst nach Abschluss der Inkubation der Probe mit dem Lysepuffer hinzugefügt werden. Wenn die IAC vor Abschluss der Inkubation zu der Mischung aus Probe und Lysepuffer gegeben wird, können die in der Probe vorhandenen RNasen und DNasen die IAC abbauen und somit zu falsch negativen Ergebnissen führen. Der Lysepuffer hemmt die RNasen und DNasen und verhindert die Degradation der IAC. 2 RT/PCR Mix ansetzen und pipettieren a. Die folgenden Artikel auftauen und anschließend auf Eis legen. Gesamtnukleinsäure- (RNA- und DNA-) Template Dilution Buffer 5 RT-PCR Buffer Pre-Amplification Primer Mix dntp Mix b. Ene ausreichende Menge an RT/PCR Mix vorbereiten, gemäß der Anzahl der zu verarbeitenden Proben zuzüglich einer Zusatzmenge für eventuelle Verluste beim Pipettieren. Bei der Vorbereitung der Mischung sind die folgenden Hinweise zum Umgang mit Reagenzien zu beachten: RT-PCR Enzyme Mix: Den Mix erst unmittelbar vor dem Pipettieren aus dem Lager nehmen. Den Mix 5 Sekunden lang zentrifugieren und anschließend durch vorsichtiges Auf- und Abziehen mit einer Pipette durchmischen. Zur Handhabung des Mixes Low-Retention- Pipettenspitzen verwenden. Den Mix sofort nach der Verwendung zurück in das Lager legen. Alle anderen Reagenzien und das Gesamtnukleinsäure-Template: Die Röhrchen unmittelbar vor Verwendung vortexen und kurz zentrifugieren. RT/PCR Mix-Komponente Volumen pro Reaktion Dilution Buffer 5,5 µl 5 RT-PCR Buffer 5,0 µl Pre-Amplification Primer Mix 2,5 µl dntp Mix 1,0 µl RT-PCR Enzyme Mix 1,0 µl Gesamtvolumen RT/PCR Mix pro 15 µl Reaktion c. Den RT/PCR Mix kurz vortexen, 15 µl in 0,2-ml-PCR-Röhrchen dispensieren und die Röhrchen anschließend verschließen. Die PCR-Röhrchen auf Eis legen. 3

4 3 Probe Hybridization Mix ansetzen und pipettieren a. Den Dilution Buffer, Hybridization Buffer und Probe Mix auftauen und dann auf Eis legen. b. Eine ausreichende Menge an Probe Hybridization Mix vorbereiten, gemäß der Anzahl der zu verarbeitenden Proben zuzüglich einer Zusatzmenge für eventuelle Verluste beim Pipettieren. Hinweis: Jedes Reagenz unmittelbar vor Verwendung vortexen und kurz zentrifugieren. Probe Hybridization Mix-Komponente Volumen pro Reaktion Dilution Buffer 3,0 µl Hybridization Buffer 1,5 µl Probe Mix 1,5 µl Gesamtvolumen Probe Hybridization Mix pro Reaktion 6,0 µl c. 6 µl Probe Hybridization Mix in neue 0,2-ml-PCR-Röhrchen pipettieren. Die PCR-Röhrchen anschließend verschließen und bis zur Verwendung bei 4 C aufbewahren. 4 Reverse Transkription und PCR vorbereiten und durchführen a. 10 µl Gesamtnukleinsäure-Template in jedes PCR-Röhren mit 15 µl RT/PCR Mix geben. Die Inhalte durch vorsichtiges Auf- und Abziehen mit einer Pipette gut durchmischen; anschließend kurz zentrifugieren. Die PCR-Röhrchen auf Eis legen, bis der Thermocycler vorgeheizt ist. Hinweis: Wenn Ihre internen Laborabläufe das Mitführen einer Negativkontrolle verlangen, 0,25 µl Internal Amplification Control in 10 µl DNase-/RNase-freies Wasser geben und diese Mischung anschließend in ein PCR-Röhrchen mit 15 µl RT/PCR Mix pipettieren. b. Das Thermocycler-Programm für die Reverse Transkription/PCR starten. Sobald die Temperatur 50 C erreicht hat, die PCR-Röhrchen in den Thermocycler setzen. 5 Sondenhybridisierung vorbereiten und durchführen a. 100 µl steriles Wasser (nicht mitgeliefert) zu jeder Reverse Transkription-/PCR-Reaktion hinzufügen. Anschließend durch vorsichtiges Auf- und Abziehen mit einer Pipette gut durchmischen. b. 2 µl der verdünnten Reverse Transkription-/PCR-Reaktion in alle Röhrchen mit 6 µl Probe Hybridization Mix geben; anschließend kurz zentrifugieren. c. Die PCR-Röhrchen in den Thermocycler setzen und das Programm für die Sondenhybridisierung laufen lassen. WICHTIG! Setzen Sie den TwoStep Mix während der letzten 60 Minuten der Sondenhybridisierung an. Fahren Sie nach der Sondenhybridisierung sofort mit dem Ligationsund PCR-Lauf fort. Belassen Sie die PCR-Röhrchen bei 60 C im Thermocycler, bis Sie soweit sind, mit dem Ligations- und PCR-Lauf fortzufahren. 6 (Während der Sondenhybridisierung:) TwoStep Mix ansetzen Den TwoStep Mix während der letzten 60 Minuten des Sondenhybridisierungslaufs vorbereiten: a. Den TwoStep Buffer auftauen und anschließend auf Eis legen. b. Eine ausreichende Menge an TwoStep Mix vorbereiten, gemäß der Anzahl der zu verarbeitenden Proben zuzüglich einer Zusatzmenge für eventuelle Verluste beim Pipettieren. Den Mix bis zur Verwendung auf Eis legen. Bei der Vorbereitung der Mischung sind die folgenden Hinweise zum Umgang mit Reagenzien zu beachten: Ligase Enzyme und Taq Polymerase: Das jeweilige Reagenz erst unmittelbar vor dem Pipettieren aus dem Lager nehmen. Jedes Reagenz 5 Sekunden lang zentrifugieren und anschließend durch vorsichtiges Auf- und Abziehen mit einer Pipette durchmischen. Zur Handhabung dieser Reagenzien Low-Retention-Spitzen verwenden. Die Reagenzien sofort nach Verwendung zurück in das Lager legen. 4

5 Den TwoStep Buffer vor dem Pipettieren vortexen und kurz zentrifugieren. TwoStep Mix-Komponente Volumen pro Reaktion TwoStep Buffer 30,6 µl Ligase Enzyme 1,0 µl Taq Polymerase 0,4 µl Gesamtvolumen TwoStep Mix pro Reaktion 32,0 µl 7 (Sofort nach Sondenhybridisierung:) Ligation und PCR vorbereiten und durchführen Sofort nach dem Sondenhybridisierungslauf: a. Das Programm für die Sondenhybridisierung stoppen und sofort das Programm für die Ligation und PCR starten. b. Sobald die Temperatur des Thermocyclers 54 C erreicht hat auf Pause drücken, um die Temperatur des Thermocyclerblocks bei 54 C zu halten. c. Die Sondenhybridisierungsreaktionen für die Ligation und PCR vorbereiten: 1. Die Sondenhybridisierungsreaktionen aus dem Thermocycler nehmen µl TwoStep Mix zu der 8 µl Sondenhybridisierungsreaktion geben. 3. Die Röhrchen wieder in den Thermocycler setzen. Hinweis: Wenn Sie eine große Anzahl an Reaktionen laufen lassen, führen Sie den Schritt 7c schubweise durch. Wenn Sie beispielsweise 8er-Röhrchenstreifen verwenden, entfernen Sie 8 Reaktionen, fügen Sie den TwoStep Mix hinzu und setzen Sie die Röhrchen anschließend wieder in den Thermocycler, bevor Sie die nächsten 8 Reaktionen entnehmen. d. Sofort das pausierte Programm für die Ligation und PCR wieder starten. 8 Kapillarelektrophorese durchführen a. Den Size Standard, Formamid und das PCR-Produkt zusammengeben: 1. Die folgenden Komponenten zusammengeben und gründlich durchmischen. Eine ausreichende Menge vorbereiten, gemäß der Anzahl der zu verarbeitenden Proben zuzüglich einer Zusatzmenge für eventuelle Verluste beim Pipettieren: Size Standard Mix-Komponente Volumen pro Reaktion (PCR- Produkt oder Reference Marker) GeneScan 600 LIZ Size Standard (PN ) 0,5 µl Hi-Di Formamide (PN ) 10,0 µl Gesamtvolumen Size Standard Mix pro Reaktion 10,5 µl 2. Jeweils 10,5 µl des Size Standard Mix in die benötigte Anzahl an Wells einer optischen 96-Well-Platte pipettieren. 3. (Empfohlen:) 1 µl Reference Marker (FAM ) in eines der Wells mit dem Size Standard Mix pipettieren. Zum Durchmischen die Pipette nutzen. 4. Für jedes Proben-PCR-Produkt wie folgt vorgehen: 5 µl des Proben-PCR-Produkts in 45 µl deionisiertem Wasser verdünnen. 1 µl des verdünnten Proben-PCR-Produkts in ein Well mit dem Size Standard Mix pipettieren; anschließend zum Durchmischen die Pipette nutzen. Hinweis: In einigen Fällen (wie beispielweise einer hohen Viruslast) kann es notwendig sein, das PCR-Produkt weiter zu verdünnen, um Spitzenwerte außerhalb des Messbereichs zu vermeiden. Weitere Informationen hierzu finden Sie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Protocol. 5. Die Platte mit einer geeigneten Abdeckung versiegeln. 5

6 9 Daten analysieren und interpretieren b. Mit der Probenplatte wie folgt verfahren: 1. Die Platte 10 Sekunden lang bei 1000 g zentrifugieren, um die Flüssigkeit bis auf den Boden der Wells zu bringen und Luftblasen zu entfernen. 2. Die Platte in das Genanalysegerät laden und die Datenerfassungssoftware wie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide (PN ) beschrieben einrichten. Die Platte anschließend zuweisen und den Lauf starten. Eine Statusbestimmung für die Pathogenkandidaten durchführen; dazu die Daten mit den empfohlenen Analyseeinstellungen, Panels und BinSets analysieren. Hinweise hierzu finden Sie im TrueScience RespiFinder Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide (PN ). Life Technologies empfiehlt, dass jedes Labor eigene Verfahren und Kriterien zur Interpretation und Berichtserstellung entwickelt. 6

7 7

8 Not for sale in U.S.A. Haftungsausschluss Die mit diesen oder anderen diagnostischen Panels erzielten Ergebnisse sollten nur im Zusammenhang mit dem klinischen Gesamtbild verwendet und interpretiert werden. Life Technologies übernimmt keine Haftung für die getroffenen klinischen Entscheidungen. Life Technologies betrachtet diese Anleitung nicht als umfassende Zusammenstellung aller möglichen Ergebnisse infolge der Verwendung der TrueScience RespiFinder Identification Panels. Diese Anleitung ist lediglich als Gedächtnisstütze vorgesehen. Sie dient in keinerlei Weise der klinischen Interpretation der Ergebnisse dieses Assays. Laboratorien müssen die Ergebnisse dieses Assays gemäß ihrer eigenen, lokal entwickelten Verfahren interpretieren und berichten. Information in this document is subject to change without notice. APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. TO THE FULLEST EXTENT ALLOWED BY LAW, IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF, WHETHER OR NOT FORESEEABLE AND WHETHER OR NOT APPLIED BIOSYSTEMS IS ADVISED OF THE POSSIBILITY OF SUCH DAMAGES. Auf Etiketten und Verpackungen verwendete Symbole: HERSTELLER ANZAHL DER TESTS GEBRAUCHSANWEISUNG BEACHTEN BEI ANGEGEBENER TEMPERATUR LAGERN VOR ANGEGEBENEM DATUM VERWENDEN BESTELLCODE LOT- ODER CHARGENNUMMER Life Technologies Ltd. 7 Kingsland Grange Woolston, Warrington, WA1 4SR, United Kingdom NOTICE TO PURCHASER: This product is a RespiFinder product manufactured by PathoFinder B.V. in Maastricht, The Netherlands within quality systems accredited to ISO13485:2003. These products are sold for use by the end-user only and may not be re-sold, distributed or re-packaged. LIMITED USE LABEL LICENSE: No right to resell this product or any of its components is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. For information on obtaining additional rights, please contact or Out Licensing, Life Technologies, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California Trademarks: The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. RespiFinder is a registered trademark of PathoFinder B.V. DIE TRUESCIENCE RESPIFINDER IDENTIFICATION PANELS WERDEN FÜR TESTS IN DER PROFESSIONELLEN IN-VITRO-DIAGNOSTIK BEREITGESTELLT. DIESES PRODUKT BEINHALTET KEINE LIZENZ ZUR DURCHFÜHRUNG VON PCR-VERFAHREN UNTER VON DRITTEN GEHALTENEN PATENTEN DARUNTER HOFFMANN-LA ROCHE (HOFFMANN-LA ROCHE LTD, DIAGNOSTICS, CH-4070 BASEL, SWITZERLAND) UND ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, INC (ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, INC., 1145 ATLANTIC AVENUE, ALAMEDA, CALIFORNIA 94501). Der Kunde ist für die Validierung der Assays und die Einhaltung der regulatorischen Vorschriften in Bezug auf die jeweiligen Verfahrensweisen und die Verwendung der RespiFinder-Produkte verantwortlich Life Technologies Corporation. All rights reserved. Part Number Rev. B 07/2011 Translated from the English PN Rev. A Headquarters 5791 Van Allen Way Carlsbad, CA USA Phone Technical Resources and Support For the latest technical resources and support information for all locations, please refer to our Web site at

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