RIDASCREEN. Total IgE. Art. Nr.: A0141

Transkript

1 RIDASCREEN Total IgE Art. Nr.: A0141 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Germany, Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 1. Anwendungsbereich Für die in vitro Diagnostik. Der RIDASCREEN Total IgE-Test ist ein Enzymimmunoassay (EIA) zum quantitativen Nachweis von IgE-Antikörpern in humanem Serum. Der Test sollte in Verbindung mit dem spezifischen IgE als Hinweis auf eine atopische Erkrankung eingesetzt werden. Er dient aber auch als Interpretationshilfe für die Beurteilung der Ergebnisse aus dem spezifischen IgE-Test. 2. Zusammenfassung und Erklärung des Tests Die Aufgabe des Immunsystems ist die Abwehr von pathogenen Bakterien, Viren und anderen Mikroorganismen. Die Abwehrreaktion dient zum Schutz des Organismus bei Erstkontakt mit den Krankheitserregern, aber auch der Immunisierung bei wiederholtem Kontakt. Allen allergischen Typ I-Reaktionen ist ebenfalls ein symptomfreier Erstkontakt vorausgegangen, bei dem bereits spezifische Antikörper der Klasse E (IgE-Antikörper) gebildet worden sind. Bei wiederholtem Kontakt mit dem auslösenden Allergen reagieren diese IgE-Antikörper mit dem Allergen und führen zur Ausschüttung von Mediatoren (aus Mastzellen) wie Histamin, Leucotrien, Prostaglandine etc., die ihrerseits zu der Symptomatik der Allergie führen. Der Nachweis von erhöhtem Total-IgE gibt im Rahmen der begründeten Allergiediagnostik einen Hinweis auf das Vorliegen einer Sensibilisierung bzw. Allergie. Die höchsten IgE-Werte werden bei atopischer Dermatitis gefunden und können bis > IU/ml erreichen. Erhöhte Total-IgE-Werte können auch durch andere Krankheiten wie Parasitosen, Infektionskrankheiten wie Mykoplasmeninfektionen, Pertussis, HIV, maligne Myelome aber auch durch Immundefekte verursacht sein. Sehr niedrige total IgE Werte sprechen eher gegen eine Allergie, schließen sie jedoch nicht aus. 3. Testprinzip Das Testprinzip entspricht einem Enzymimmunoassay (EIA) zum Nachweis von Antikörpern. Anti-human-IgE-Antikörper nicht humanen Ursprungs sind an die Innenflächen der Kavitäten einer Mikrotiterplatte gebunden. Vorhandene humane IgE- Antikörper aus den Standards, den Kontrollen und den Patientenproben werden durch diese Antikörper gebunden. In einem zweiten Schritt erfolgt die Zugabe eines mit alkalischer Phosphatase konjugierten anti-human-ige-antikörpers, der an die gebundenen humanen IgE-Antikörper bindet. In einem dritten Schritt wird ein Substrat zugegeben, das durch die alkalische Phosphatase dephosphoriliert wird. Der resultierende Farbumschlag von farblos nach gelb wird mittels Photometer bei 405 nm und der Refe- 2 RIDASCREEN Total IgE

3 renzwellenlänge von 620 nm gemessen. Die Intensität der Gelbfärbung ist proportional der Menge an IgE-Antikörpern im Serum. Die Ergebnisse werden in IU/ml angegeben. 4. Packungsinhalt Tab.1: Packungsinhalt RIDASCREEN Total IgE (Art. No. A0141) Plate AllergySB AllergyWB 1-96 Best. 15 ml 60 ml Mikrotiterplatte, 12 Mikrotiterstreifen, teilbar, im Halterahmen, mit anti-human-ige-antikörpern beschichtet Probenpuffer, gebrauchsfertig, Deckelfarbe: weiß Waschpuffer, 16-fach konzentriert, 0,9% NaN 3, Deckelfarbe: transparent Standard µl Standard µl Standard µl Standard µl Standard µl Standard µl Standard µl Control high 130 µl Control low 130 µl Conjugate 12 ml Standardserum 1, verd. Humanserum; Konzentration (in IU IgE/ml): 0 ; in stabilisierter Proteinlösung Standardserum 2, verd. Humanserum; Konzentration (in IU IgE/ml): 5; in stabilisierter Proteinlösung Standardserum 3, verd. Humanserum; Konzentration (in IU IgE/ml): 25; in stabilisierter Proteinlösung Standardserum 4, verd. Humanserum; Konzentration (in IU IgE/ml): 100; in stabilisierter Proteinlösung Standardserum 5, verd. Humanserum; Konzentration (in IU IgE/ml): 250; in stabilisierter Proteinlösung Standardserum 6, verd. Humanserum; Konzentration (in IU IgE/ml): 500; in stabilisierter Proteinlösung Standardserum 7, verd. Humanserum; Konzentration (in IU IgE/ml): 1000; in stabilisierter Proteinlösung Hohe Kontrolle IgE, verd. Humanserum, gebrauchsfertig, Konzentration: siehe Zertifikat; in stabilisierter Proteinlösung, Deckelfarbe: kleiner grüner Deckel niedrige Kontrolle IgE, verd. Humanserum, gebrauchsfertig, Konzentration: siehe Zertifikat; in stabilisierter Proteinlösung, Deckelfarbe: kleiner gelber Deckel anti-human-ige-konjugat, (Kaninchen); gebrauchsfertig; alkalische Phosphatase-konj. Antikörper in stabilisierter Proteinlösung, Deckelfarbe: rot RIDASCREEN Total IgE

4 AllergySub AllergyStop 12 ml 12 ml Substratlösung, pnpp-lösung in Diethanolamin, gebrauchsfertig, Deckelfarbe: schwarz Stopplösung, 7,4% EDTA, gebrauchsfertig Deckelfarbe: grün 5. Reagenzien und ihre Lagerung Der Testkit ist bei 2-8 C zu lagern und ist auch nach dem Öffnen bis zu dem auf dem Etikett aufgedruckten Verfallsdatum verwendbar. Der verdünnte Waschpuffer ist bei einer Lagerung von 2-8 C maximal 4 Wochen haltbar. Mikrobielle Kontamination ist zu vermeiden. Nach Erreichen des Verfalldatums kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Der Alu-Beutel, in dem sich die Mikrotiterplatte befindet, ist mit einer Schere so zu öffnen, dass der Klippverschluss nicht abgetrennt wird. Nicht benötigte Mikrotiterstreifen sind im verschlossenen Alu-Beutel bei 2-8 C zu lagern. Eine Kontamination der Substratlösung mit Konjugat ist unbedingt zu vermeiden, da dies eine Verfärbung des Substrats zur Folge hat. Ebenso ist eine direkte Lichteinwirkung auf das Substrat zu vermeiden, um einer Zersetzung bzw. Verfärbung durch Hydrolyse vorzubeugen. Bei aufgetretener Verfärbung darf das Substrat nicht mehr verwendet werden. Siehe auch Punkt 10. Qualitätskontrolle Anzeichen für Reagenzienverfall. 6. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör 6.1. Reagenzien Destilliertes oder deionisiertes Wasser 6.2. Zubehör Photometer für Mikrotiterplatten (mit 405 nm und 620 nm-filter) Waschautomat für Mikrotiterplatten oder Handwaschsystem (Kamm, Pumpe, Puffervorrats- und Abfallbehälter) 37 C-Inkubator Mikropipette µl 8-Kanal- oder Multi-Step-Pipette Messzylinder (1000 ml) 4 RIDASCREEN Total IgE

5 7. Vorsichtsmaßnahmen Nur für die in vitro Diagnostik. Dieser Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Richtlinien zur Arbeit in medizinischen Laboratorien sind zu beachten. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Proben oder Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren, Kontakt mit verletzter Haut oder Schleimhaut vermeiden. Während des Umgangs mit Proben Einmalhandschuhe tragen und nach Abschluss des Tests die Hände waschen. In den Bereichen, in denen mit den Proben oder den Test-Reagenzien gearbeitet wird, nicht rauchen, essen oder trinken. Die im Kit befindlichen Kontrollseren (Standardseren, hohe und niedrige Kontrolle) wurden auf HIV- und HCV-Ak sowie HbsAg und Syphilis CFR untersucht und für negativ befunden. Dennoch sollten sie, ebenso wie die Patientenseren und alle Materialien, die mit ihnen in Berührung kommen, als potentiell infektiös behandelt und entsprechend den jeweiligen nationalen Sicherheitsbestimmungen gehandhabt werden. Das Waschpufferkonzentrat enthält als Konservierungsmittel Natriumazid. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist zu vermeiden. Bei Kontakt mit Blei- oder Kupferrohren können explosive Metallazide entstehen. Alle Bestandteile des Kits müssen nach Gebrauch sachgerecht und eigenverantwortlich entsorgt werden. Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in Berührung kommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder für mindestens 1 Stunde bei 121 C autoklaviert werden. 8. Sammlung und Lagerung der Proben Der Test ist für die Untersuchung von humanem Serum entwickelt worden. Nach der Blutentnahme sollte zur Vermeidung einer Hämolyse das Serum möglichst schnell vom Blutkuchen getrennt werden. Die Proben sind bis zur Testung kühl oder gefroren zu lagern. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Serums ist unbedingt zu vermeiden, ebenso mikrobielle Kontamination. Die Verwendung von Hitzeinaktivierten, lipämischen, hämolytischen, ikterischen oder trüben Seren kann zu verfälschten Ergebnissen führen. RIDASCREEN Total IgE

6 Tab. 2: Probenlagerung unverdünntes Serum 2 8 C -20 C 1 Woche > 1 Woche 9. Testdurchführung 9.1. Allgemeines Vor Verwendung sind alle Reagenzien, Patientenseren und die Mikrotiterplatte auf Raumtemperatur (20-25 C) zu bringen. Die Reagenzien sind unmittelbar vor der Verwendung gut zu mischen. Nach dem Gebrauch ist das Kit sofort wieder bei 2-8 C zu lagern. Die Mikrotiterstreifen können nicht mehrfach verwendet werden. Reagenzien und Mikrotiterstreifen dürfen nicht verwendet werden, wenn die Verpackung beschädigt ist oder die Gefäße undicht sind. Ein Austausch oder Kombinieren von Kitkomponenten aus Kits verschiedener Chargennummern ist nicht zulässig. Eine Abweichung von vorgegebenen Inkubationszeiten und -temperaturen führt zu einer Verschiebung der Standardkurve im Vergleich zum Zertifikat. Starke Verschiebung der Standardkurvenwerte führt zu invaliden Testergebnissen. Direkte Sonneneinstrahlung ist während der Durchführung des Testes zu vermeiden. Es wird empfohlen, die Mikrotiterplatte abzudecken. Für die Inkubationen der Mikrotiterplatte darf keine feuchte Kammer verwendet werden! 9.2. Herstellung des Waschpuffers Der Inhalt der Flasche mit Waschpufferkonzentrat AllergyWB wird mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Eventuell im Konzentrat vorhandene Kristalle vorher durch Erwärmen (Wasserbad bei 37 C) lösen Erste Inkubation Nach dem Einstecken einer ausreichenden Zahl von Kavitäten in den Halterahmen werden jeweils 20 µl der Standards, Standard 1, Standard 2, Standard 3, Standard 4, Standard 5, Standard 6 und Standard 7 in Doppelbestimmung, der Kontrollen Control high und Control low und der Patientenseren pipettiert. Anschließend werden in alle Kavitäten mit Standards, Kontrollen und Patientenseren jeweils 100 µl Probenpuffer AllergySB dazu pipettiert und gut gemischt. Die Platte Plate wird 6 RIDASCREEN Total IgE

7 abgedeckt und bei 37 C für 60 min in einem geschlossenen Inkubator (empfohlen) inkubiert Waschen Die Kavitäten werden 5-mal durch Füllen mit Waschpuffer und folgendem Absaugen gewaschen. Das letzte Absaugen sollte möglichst quantitativ erfolgen. Anschließend muss die Platte durch sorgfältiges Ausklopfen auf einer saugfähigen Unterlage komplett entleert werden. Bei Verwendung eines Waschautomaten (empfohlen) wird mit jeweils 300 µl Waschpuffer bei gleichzeitigem Absaugen (geeignete Overflow-Einstellung) gewaschen. Die korrekte Einstellung des Gerätes auf die Abmessungen des verwendeten Plattentyps muss zuvor sichergestellt werden. Bei Verwendung eines manuellen Waschsystems muss ebenfalls 5 mal mit µl Waschpuffer gewaschen werden. Pipetten sind zum Waschen ungeeignet Zweite Inkubation Zugabe von 100 µl Konjugat Conjugate in alle Kavitäten. Anschließend wird die Platte abgedeckt und für 60 min bei 37 C inkubiert Waschen Waschen gemäß Pkt Dritte Inkubation und Messung 100 µl Substrat AllergySub zügig in alle Kavitäten pipettieren. Anschließend die Platte für 15 min bei 37 C inkubieren. Durch Zugabe von 50 µl Stopplösung AllergyStop in jede Kavität wird die Reaktion beendet. Die Messung der Extinktion erfolgt bei 405 nm gegen die Referenzwellenlänge von 620 nm. Die Platte kann innerhalb von 24 Stunden erneut gemessen werden, wenn sie kühl und zugedeckt gelagert wird. 10. Qualitätskontrolle Anzeichen für Reagenzienverfall Bei jeder Testdurchführung sind auf jeder Platte die Standards 1-7 in Doppelbestimmung (empfohlen) sowie für die Qualitätskontrolle eine hohe und eine niedrige Kontrolle mitzuführen. Der Test ist korrekt verlaufen, wenn die Konzentrationen der Kontrollen innerhalb der im Zertifikat angegebenen Bereiche liegen. RIDASCREEN Total IgE

8 Eine Abweichung von den geforderten Werten sowie eine Reagenzientrübung oder Gelbfärbung des Substrates vor Zugabe in die Kavitäten können ein Hinweis auf einen Reagenzienverfall sein. Sollten die vorgegebenen Werte nicht erfüllt sein, ist vor einer Testwiederholung folgendes zu überprüfen: Haltbarkeit der verwendeten Reagenzien Funktionsfähigkeit der eingesetzten Geräte (z. B. Kalibrierung) Korrekte Testdurchführung Visuelle Kontrolle der Kitkomponenten auf Kontamination oder Undichtigkeit; eine gelblich gefärbte Substratlösung darf nicht mehr verwendet werden Sind nach Testwiederholung die Bedingungen wiederum nicht erfüllt, wenden Sie sich bitte an den Hersteller. 11. Auswertung und Interpretation Serenbefundung Berechnungsgrundlagen Für die Testauswertung ist die Erstellung der Referenzkurve notwendig. Dazu werden die Standards in Doppelbestimmung auf jeder Platte mitgeführt. Zur Erstellung der Referenzkurve werden die Mittelwerte der Extinktionen aus den Doppelbestimmungen der Standards als Funktion der zugehörigen Konzentrationen (IU/ml) halblogarithmisch (y-lin/x-log-darstellung) in einer point-to-point-darstellung aufgetragen. Die Konzentration der IgE-Antikörper kann anhand der Standardkurve aus dem gemessenen OD-Wert ermittelt werden. Die Auswertung kann auch durch eine entsprechende Software durchgeführt werden. Die Kalibrierung der Standardkurve des RIDASCREEN Total IgE erfolgt an der internationalen Referenzpräparation 2nd WHO IRP 75/502 for human IgE. 8 RIDASCREEN Total IgE

9 11.2. Konzentrationen und Bewertung der ermittelten Werte Die folgende Tabelle gibt die Normalwerte der Total-IgE-Werte altersabhängig an. Tab. 3: IgE-Normalwerte in IU/ml, altersabhängig, 95 % Percentile Neugeborene < 2 1. Jahr Jahr Jahr Jahr Jahr 150 > 16 Jahre 120 Oben genannte Werte sind nur Richtwerte. Genaue Angaben sind nicht möglich, da der Überlappungsbereich der Gesamt-IgE-Konzentrationen von Allergikern und nicht Allergikern sehr groß ist. 12. Grenzen der Methode Ein Zusammenhang zwischen der Höhe der ermittelten Total-IgE-Konzentration und dem Auftreten oder der Schwere der klinischen Symptome kann hieraus nicht abgeleitet werden. Wegen der hohen individuellen Schwankungen des Total-IgE-Wertes, sowohl bei gesunden Kontrollpersonen wie auch bei Atopikern, ist die Festsetzung eines Normbereiches relativ unzuverlässig. Ein normaler Total-IgE-Wert schließt im Einzelfall eine Allergie nicht aus, andererseits ist eine erhöhte IgE-Konzentration für das Vorliegen einer atopischen Erkrankung nicht beweisend. Weitere Ursachen von erhöhten IgE-Konzentrationen können sein: Parasitosen (oft durch hohe Eosinophilenzahl gekennzeichnet) angeborene Immundefekte bestimmte Autoimmunerkrankungen Churg-Strauss-Syndrom einige maligne Erkrankungen Wiskott-Aldrich-Syndrom Lymphome Daher sind die erzielten Ergebnisse immer in Verbindung mit der Anamnese, dem klinischen Bild und den Ergebnissen der spezifischen IgE-Testung zu interpretieren. RIDASCREEN Total IgE

10 13. Leistungsmerkmale Tab. 4: Inter-Assay-Varianz, alle Berechnungen haben Ergebnisse in IU/ml zur Grundlage Inter-Assay Probe Konzentration in IU/ml 3,5 20,6 77,7 162,3 1092,3 Anz. Assays 8x3 8x3 8x3 8x3 8x3 VK 31,6 26,2 6,6 5,9 23,1 Tab. 5: Intra-Assay-Varianz, alle Berechnungen haben Ergebnisse in IU/ml zur Grundlage Intra-Assay Probe Konzentration in IU/ml 6,3 16,3 78,5 150,4 470,1 Anz. Repl VK 11,7 8,2 8,2 9,7 12,5 10 RIDASCREEN Total IgE

11 Literatur 1. Renz, H., Becker, W.-M., Bufe, A., et al.: Positionspapier der Deutschen Gesellschaft für Allergologie und klinische Immunologie (DGAI). Allergo J 2002;11; Kjellman, N.I.M.: Prediction and prevention of atopic allergy, Allergy 37, (1982) 3. Debelic, M.: Die klinische Bedeutung der Bestimmung von Serum-Gesamt IgE und spezifischem IgE für die Diagnostik und Verlaufsbeobachtung allergischer Krankheitsbilder. Therapiewoche 29, (1979) 4. Kjellman, N.I.M., et al.: Serum IgE levels in healthy children quantified by a Sandwich technique (PRIST), Clin. Allergy 6, (1976) 5. Turner, K.J.: IgE globulins and immunity. Medical Journal of Australia 2, 846 (1974) 6. Johannson, S.G.O.: Raised levels of a new immunoglobulin class (IgND) in asthma. Lancet II, (1967) 7. Ishizaka, K., Ishizaka, T., Hornbook, M.M.: Physico-chemical properties of human reaginic antibody. IV. Presence of a unique immunoglobulin as a carrier of reaginic activity. Journal of Immunology 97, 75 (1966) 8. Bennich, H.H., et al.: Immunoglobulin E, a new class of human immunoglobulin. Bulletin World Health Organisation 38, 151 (1964) RIDASCREEN Total IgE