Erythrozytenzählung. Themen. Prinzip. Material TEAS Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten.

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1 Erythrozytenzählung TEAS Themen Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten. Prinzip In diesem Versuch werden Erythrozyten manuell mit einer Zählkammer unter dem Mikroskop gezählt. Diagnostisch ist die Erythrozytenzahl als Einzelparameter nicht von großer Bedeutung, sie bildet aber die Basis für die Berechnung der Erythrozytenindizes (s. u.). Material Studenten-Basis-Set 1 Einweghandschuhe, M, Latex, 1 Stk Mikroliterpipette 10 1 µl Mikroliterpipette 1 10 µl Pipettenspitzen 2-2 μl im Halter, 96 Stk Pipettenspitzen μl im Halter, 1 Stk Einmalreaktionsgefäß Kuvettenständer, 16plätzig Zählkammer nach Neubauer mit Deckglas Mikroskop Chemikalien 1 Hayem sche Lösung Achtung: Das Reagenz enthält Quecksilber. Aktuelle Hinweise zu Risiken, Gefahren und Vorsichtsmaßnahmen entnehmen Sie dem Sicherheitsdatenblatt aus der Reagenzpackung. Beachten Sie stets die Vorbemerkungen, wenn Sie diesen Versuch durchführen. Abb. 1: P59213 P59213 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1

2 TEAS Erythrozytenzählung Aufgaben Bestimmen Sie die Erythrozytenzahl einer Probe. Untersuchungsmaterial Untersuchungsmaterial EDTA-Blut nach venöser Entnahme siehe Vorbemerkungen. Durchführung In ein Einmalreaktionsgefäß werden 1990 µl Hayem sche Lösung und 10 µl gut gemischtes EDTA-Blut pipettiert. Es entsteht eine Verdünnung von 1 : 2. Gut vermischen. Das optisch plan geschliffene Deckglas wird nun mit leichtem Druck beider Daumen auf die mit etwas Wasser angefeuchteten seitlichen Trägerschienen der Neubauer-Kammer aufgeschoben. Auf beiden Flächen sollten dann sogenannte Newton sche Ringe sichtbar sein. Sie entstehen durch Interferenz des Lichts an der oberen und unteren Grenzfläche des Luftkeils zwischen Deckglas und Steg. Sind sie zu sehen, so liegt die Höhe des Zwischenraums zwischen den Trägerstegen und dem Deckglas in der Größenordnung der Lichtwellenlängen, ist also zu vernachlässigen. In diesem Zustand verrutscht das Deckglas beim Kippen der Zählkammer nicht. Innerhalb einer Stunde nach Probennahme muss die Zählkammer gefüllt werden. Im Anschluss lässt man die Zellen 2 Minuten sedimentieren. Mit dem Objektiv 10:1 wird am Mikroskop die Ebene eingestellt, gezählt wird mit dem 40-er Objektiv. Ausgezählt werden im inneren Zählkreuz der Neubauerkammer die Erythrozyten, die sich innerhalb der unten markierten 5 Gruppenquadrate mit jeweils 16 Grundquadraten (Bild 3) befinden und ebenfalls die Erythrozyten, die sich auf jeweils zwei aneinanderstoßenden Begrenzungslinien der Quadrate des Zählnetzes (z. B. L-förmig) befinden; die Anzahl jeweils notieren. Abb. 2: beide Zählkreuze der Kammer sind gefüllt, im oberen kann man eine größere Luftblase und ein seitliches Überfließen der Lösung erkennen. Abb. 3: Neubauer-Kammer, inneres Zählkreuz. Die 5 Gruppenquadrate mit den 16 Grundquadraten, die ausgezählt werden sollen, sind grau hinterlegt. 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59213

3 Erythrozytenzählung TEAS Grundlagen Mit ca. 96 % bilden die Erythrozyten den Hauptanteil der Zellen des peripheren Blutes. Die kernlosen Erythrozyten enthalten Hämoglobin, ihre Hauptaufgabe ist der Sauerstofftransport in die Gewebe und der Abtransport von Kohlendioxid in die Lunge, außerdem haben sie eine Pufferfunktion im Blut. Sie haben einen Durchmesser von 7 8 µm, einen Randwulst und zur Mitte eine konkave Form. Ihre Lebenszeit beträgt durchschnittlich 120 Tage, abgebaut werden sie in den Organen des retikuloendothelialen Systems, hauptsächlich in der Milz. Diagnostisch ist die Erythrozytenzahl als Einzelparameter nicht von großer Bedeutung (bei einer Anämie muss nicht unbedingt die Anzahl der Erythrozyten vermindert sein!), sie bildet aber die Basis für die Berechnung der Erythrozytenindizes (s. u.). Verminderte Erythrozytenzahlen finden sich bei verminderter Erythropoese, bei verkürzter Lebenszeit der Erythrozyten, bei Blutverlusten und schließlich bei Erhöhung der Plasmawassermenge. Sie sind in der Regel gleichbedeutend mit einer Anämie. Eine Erhöhung der Erythrozytenzahl wird als Polygloblie bzw. Polycythämie bezeichnet. Entweder ist hier die Erythropoetin-induzierte Erythropoese gesteigert (Polyglobulie; entsteht durch verminderten O 2 -Gehalt im Gewebe, durch Tumoren oder auf genetischer Grundlage), oder alle Zellen werden im Knochenmark vermehrt gebildet (Polycythaemia vera; autonome Proliferation eines pluripotenten Stammzellklons). Erythrozyten werden heutzutage zunehmend automatisch gezählt. Die höhere Präzision der Zählautomaten im Vergleich mit der Zählkammermethode ist technisch und statistisch begründet, ein Automat zählt etwa 5 Zellen, die den 5 in der Zählkammer gegenüber stehen. Auswertung Aus der Fläche (1/4 mm 2 ) und der Höhe (1/10 mm) eines Kleinstquadrats lässt sich dessen Volumen als 1/40 µl bestimmen. Da ein Gruppenquadrat aus 16 kleinen besteht, hat es ein Volumen von 1/250 µl, und fünf Gruppenquadrate beinhalten 1/50 µl, was 0.02 µl entspricht. In diesem Versuch zählt man die Erythrozyten in den 5 Grundquadraten also in 0.02 µl Blut. Durch folgende Umrechnung mit dem Verdünnungsfaktor 2 erhält man die Anzahl Erythrozyten pro µl Blut N: n 2 = N 0.02 µl n 1 = N n ist die gezählte Anzahl in 0,02 µl 1:2 verdünntem Blut und N die Anzahl Erythrozyten pro µl Blut. Referenzwerte: Alter Erythrozytenzahl (10 6 /µl) Neugeborene Tag Woche Woche Säuglinge Ältere Kinder Frauen Männer Achtung: Die angegebenen Normalwerte beziehen sich auf die westeuropäische Bevölkerung! P59213 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3

4 TEAS Erythrozytenzählung Hinweis Bei dieser Methode kann es durch diverse Fehlerquellen zu Fehlinterpretationen kommen: Blut angeronnen falsches Verdünnungsvolumen Benutzung von ungeeichten, defekten, spülfeuchten, ungereinigten Gerätschaften mangelhafte Durchmischung Deckglas falsch auf die Kammer aufgelegt Kammer nicht luftblasenfrei gefüllt Kammer überfüllt Sedimentationszeit zu kurz Zählung in der Kammer falsch durchgeführt Falscher Verdünnungsfaktor zur Berechnung benutzt Die sogenannte Dreierregel dient der Plausibilitätskontrolle von Ergebnissen des roten Blutbildes. Sie lautet: Erythrozytenzahl x 3 = Hämatokritwert Hämoglobinwert x 3 = Hämatokritwert Der Hämatokritwert und der Hämoglobinwert werden in P59211 und P59212 ermittelt. Fragen: - Welche Inhaltsstoffe enthält die Hayem sche Lösung und was bewirken sie? Hayem sche Lösung enthält unter anderem Natriumsulfat. Die solvatisierten SO 4 2 Ionen sorgen durch ihre negative Ladung für eine verminderte Aggregation der Erythrozyten. Das Reagenz enthält auch Natriumchlorid, dessen hohe Konzentration über Osmose die Erythrozyten schrumpfen lässt. So sind sie leichter zu detektieren. Das Quecksilberchlorid dient der Konservierung. - Wo werden die Erythrozyten in der Neubauerkammer gezählt? In 5 Gruppenquadraten des inneren Zählkreuzes, die 16 Grundquadrate enthalten - Wie hoch ist die durchschnittlichelebensdauer von Erythrozyten im pheripheren Blut? Ca. 120 Tage - Was passiert mit alten Erythrozyten im Blut? Sie werden von Makrophagen des RES (Retiko-Endotheliales System) phagozytiert. Anhang Das kleine Blutbild Das kleine Blutbild bildet die Basis der hämatologischen Diagnostik. Zu den Parametern gehören: Anzahl der Leukozyten, Anzahl der Erythrozyten, Konzentrationen von Hämoglobin und Hämatokrit, die (bei den manuellen Methoden errechneten) Parameter MCH (mean corpuscular hemoglobin), MCV (mean corpuscular volume), MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration) und die Anzahl der Thrombozyten. Die Erythrozytenindizes 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59213

5 Erythrozytenzählung TEAS Aus den in P59211, P59212 und P59213 ermittelten Blutwerten lassen sich noch weitere für die Diagnostik der Anämien wichtige Parameter berechnen. Der MCH Wert (mean corpuscular hemoglobin) ist der mittlere Hämoglobingehalt des Einzelerythrozyten MCH (pg) = Hämoglobin (g/dl) 10 Erythrozytenzahl (10 6 /µl) Der MCV Wert (mean corpuscular volume) beschreibt das durchschnittliche Volumen des Einzelerythrozyten. Hämatokrit (Vol. %) 10 MCV (pflg) = Erythrozytenzahl (10 6 /µl) Der MCHC Wert (mean corpuscular hemoglobin concentration) beschreibt die mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration. MCHC (g/dl) = Hämoglobin (g/dl) 1 Hämatokrit (Vol.%) Referenzwerte: Alter MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) Neugeborene Tag Woche Woche Säuglinge Ältere Kinder Frauen Männer Weitere Informationen zu den Referenzwerten: siehe Vorbemerkungen, S. x. Achtung: Die angegebenen Normalwerte beziehen sich auf die westeuropäische Bevölkerung! Praktische Beispiele für die Anämiediagnostik: Definition: Eine Verminderung der Hämoglobinkonzentration auf Werte unterhalb des Normbereichs wird als Anämie bezeichnet. P59213 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5

6 TEAS Erythrozytenzählung Typ Manifeste Eisenmangelanämie hypochrom hyperchrom Normo- chrom normozytär Blutbild Mikrozytär Makrozytär MCH MCV Retikulozyten X X N Anämie bei Infekten, Tumoren, chron. Dialyse, ACD Vitamin B 12 /Folsäuremangelanämie X X N N N X X N Hämolytische Anämie X X N N Thalassaemia minima X X N Akuter Blutverlust X X N N = erniedrigt, = erhöht, N = normal 6 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59213

7 Erythrozytenzählung TEAS Protokoll Sie können Ihre Ergebnisse in der folgenden Tabelle notieren: 1. Bestimmung Kammer Anzahl Erythrozyten Gesamtzahl: 2. Bestimmung Kammer Anzahl Erythrozyten Gesamtzahl: Fragen - Welche Inhaltsstoffe enthält die Hayem sche Lösung und was bewirken sie? - Wo werden die Erythrozyten in der Neubauerkammer gezählt? - Wie hoch ist die durchschnittlichelebensdauer von Erythrozyten im pheripheren Blut? P59213 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 7

8 TEAS Erythrozytenzählung - Was passiert mit alten Erythrozyten im Blut? 8 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P59213