Grundlagen der Immunologie

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1 Grundlagen der Immunologie

2 Geschichtliche Entwicklung Antike: Überstandene Pesterkrankung schützt vor Pest Mittelalter: für Pocken gilt das gleiche Erste Immunisierungsversuche mit Eiter aus Pocken brachten nicht den gewünschten Erfolg. 1798: Edward Jenner erkennt, dass überstandene Kuhpocken vor echten Pocken schützen. => erste erfolgreiche Impfung 1889: Louis Pasteur entdeckt die Entstehung avirulenter Bakterienstämme. Impfungen mit abgeschwächten Erregern gegen Tollwut, Milzbrand (Vakzination) Ende 19. Jahrhundert: Entdeckung der Antikörper (humorale Immunität) Entdeckung beweglicher Zellen, die Fremdkörper beseitigen (zelluläre Immunität) 20. Jahrhundert: Struktur und Wirkungsweise der Antikörper Komplementsystem... Inge Vonnieda 2

3 Angeborene Immunität Unspezifische Immunität Granulozyten, Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, NK-Zellen (Leukozyten) erkennen Mikroorganismen, phagozytieren und zerstören sie. Komplement (ca. 20 Proteine) kann auf verschiedenen Wegen aktiviert werden. Dies führt zur Markierung oder Lyse der Zelle. Inge Vonnieda 3

4 Granulozyten Neutrophile: Phagozytose in intrazelluläre Vesikel, Abtötung der Erreger durch Sekretion von Sauerstoffradikalen u.a. toxische Substanzen Eosinophile: Abwehr von Parasiten durch toxische Substanzen, Beteiligung bei Allergien Basophile: Sekretion von Histamin, Heparin und Serotonin und Zytokinen nach Aktivierung - Anlocken weiterer Leukozyten, Entzündngsreaktion Inge Vonnieda 4

5 Makrophagen,, NK-Zellen Makrophagen, Dendritische Zellen Phagozytose und Zerlegung der aufgenommene Substanzen in kleine Proteine (Antigene) Einwanderung in das Lymphsystem und die Lymphknoten Präsentation der Antigene über MHC-Moleküle Induktion der spezifischen Immunantwort NK-Zellen Spezielle Lymphozyten, die durch direkte Zellzu-Zell-Interaktion Tumorzellen und virusinfizierte Zellen abtöten Inge Vonnieda 5

6 Komplementsystem Aktivierung Klassischer Weg: Antigen-Antikörper- Komplexe MB-Lektin-Weg: mannanbindendes Lektin (normaler Bestandteil im Serum) bindet an eingekapselte Bakterien Alternativer Weg: direkte Aktivierung an Oberflächen von Mikroorganismen Inge Vonnieda 6

7 Komplementsystem Inge Vonnieda 7

8 Komplement - Aktivierung Inge Vonnieda 8

9 Komplement terminale Lyse Inge Vonnieda 9

10 Komplement Spaltprodukte Spaltprodukte wirken als Anaphylatoxine Inge Vonnieda 10

11 Erworbene Immunität Spezifische Immunität Lymphozyten B-Lymphozyten (Antikörperproduktion) T-Lymphozyten (Zytokinproduktion) Kontrolle der Antikörperproduktion Immunität gegen virusbefallene Zellen Regulierung der Immunantwort Interaktion mit Phagozyten Phagozyten (Monozyten, Makrophagen) Phagozytose von Eindringlingen und Präsentation der Antigene Antikörper Inge Vonnieda 11

12 Lymphatische Organe Primäre lymphatische Organe Knochenmark Thymus Sekundäre lymphatische Organe Lymphknoten Milz Knochenmark Inge Vonnieda 12

13 Primäre re lymphatische Organe Knochenmark Aus Stammzellen entwickeln sich Vorläuferzellen der Lymphozyten Reifung und Prägung der B-Lymphozyten (lebenslang) Thymus Aus dem Knochenmark eingewanderte Vorläuferzellen entwickeln sich zu unreifen T- Lymphozyten Reifung und Prägung der T-Lymphozyten, Absterben autoaggressiver Lymphozyten (vor allem bis zur Pubertät, danach abnehmend) Inge Vonnieda 13

14 Sekundäre lymphatische Organe B-Lymphozyten Kontakt mit Antigen Produktion von Antikörpern Gedächtniszellen T-Lymphozyten Nach Antigenkontakt Produktion von Zytokinen zur Unterstützung der B-Zell- Proliferation Inge Vonnieda 14

15 Sekundäre lymphatische Organe Inge Vonnieda 15

16 Antikörper Proteine der γ-globulinfraktion => Immunglobuline (Ig) Mindestens zwei spezifische Bindungsstellen für Antigene 5 Antikörperklassen (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD) Bildung durch B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen Inge Vonnieda 16

17 Grundstruktur der Antikörper Zwei identische schwere Ketten (H) Zwei identische leichte Ketten (L) Disulfidbrücken, die für die Entstehung von Peptidschleifen (Domänen) verantwortlich sind Konstante Domänen Variable Domänen (= Antigenbindungsstelle) Hinge-Region (nicht bei jeder Immunglobulinklasse) Komplementbindungsstellen (nicht überall) Konstant Fc-Teil Variabel Fab-Teil Hinge- Region Inge Vonnieda 17

18 Struktur der Antikörper Schwere Ketten (Anzahl konstanter Domänen) IgG: γ-kette (3) IgM: µ-kette (4) IgA: α-kette (3) IgE: ε-kette (4) IgD: δ-kette (3) Leichte Ketten κ-kette λ -Kette Inge Vonnieda 18

19 Immunglobulinklassen IgG 80 % aller Immunglobuline 8 18 g/l im Serum, die gleiche Menge im extravasalen Raum 4 Subklassen (IgG1 4) Komplementbindungsstelle am C H2 bei IgG1, 2, 3 Bindung an die Fc-Rezeptoren der Makrophagen (IgG1, 3) Erscheint bei einer primären Immunreaktion nach einigen Tagen IgG1: 65 70% IgG2: 20 28% IgG3: 4 8% IgG4: 2 4% Inge Vonnieda 19

20 Immunglobulinklassen IgM Pentamer aus 5 Untereinheiten (manchmal auch Hexamer) 4 konstante Domänen J-Kette (joining), die für die Bildung des Pentamers zuständig ist. (ohne J-Kette entstehen Hexamere) Komplementbindungsstelle Zuerst produziertes Immunglobulin nach Antigenkontakt Inge Vonnieda 20

21 Immunglobulinklassen IgA Dimer oder Monomer J-Kette bei Dimeren Sekretorische Komponente, die erst sekundär an das dimere Molekül bindet und in Sekreten den Transport begünstigt und vor Proteolyse schützt. Zwei Subklassen: IgA1(Serum) und IgA2 (Sekret) Sekretorische Komponente Inge Vonnieda 21

22 Immunglobulinklassen IgD Im Serum nur in Spuren vorhanden (< 1%) Rezeptormolekül auf nicht aktivierten B- Lymphozyten Funktion unbekannt Inge Vonnieda 22

23 Immunglobulinklassen IgE Monomer mit 4 konstanten Domänen Im Plasma nur in geringer Konzentration Bindung mit dem Fc-Teil an Rezeptoren von basophilen Granulozyten und Mastzellen Bei Allergikern erhöhte IgE- Spiegel Inge Vonnieda 23

24 Entstehung der Diversität Ein Gen ein Antikörper? Sehr viele Gene notwendig (mehr als im Genom vorhanden sind) ( verschiedene AK) Große Teile der AK-Moleküle sind in einer Klasse konstant Zusammensetzen des Moleküls aus verschiedenen Genabschnitten??? Zusammenfügen des Gens im Laufe der Reifung der antikörperproduzierenden B-Lymphozyten!!! Inge Vonnieda 24

25 Entstehung der Diversität Beispiel: Leichte Kette (Maus) Während der Reifung werden aus der Keimbahn-DNA V- und J-Segment gekoppelt. C- und L-Segment bleiben noch abgetrennt. Bildung langer m-rna und Ausspleißen der nicht benötigten Teile Abtrennung von L und Translation (Proteinbildung) Inge Vonnieda 25

26 Entstehung der Diversität Kombinationsmöglichkeiten beim Mensch (H-Kette, Chromosom 14) Ca. 50 V-Gene (AA 1 95) Ca D-Gene (AA ) 6 J-Gene (AA ) 9 C-Gene für den konstanten Teil (µ, γ1, γ2, γ3, γ4, ε, δ, α1, α2) L-Gene (leader) vor jedem V-Segment Zusätzliche Variabilität durch Punktmutation vor allem der V-Gene Inge Vonnieda 26

27 Entstehung der Diversität Kombinationsmöglichkeiten beim Mensch (κ-kette, Chromosom 2) Ca V-Gene (AA 1 95) 5 J-Gene (AA ) Cκ-Gen für den konstanten Teil Zusätzliche Variabilität durch Punktmutation Kombinationsmöglichkeiten beim Mensch (λ-kette, Chromosom 22) Verschiedene V-Gene J-Gene liegen direkt vor den C-Genen Mehrere Gene für den konstanten Teil Zusätzliche Variabilität durch Punktmutation Inge Vonnieda 27

28 Klassen-Switch Reifende B-Lymphozyten produzieren zuerst IgM, später IgG S-(switch)-Sequenzen steuern die Umlagerung der C- Gene der mrna Antigenbindungsstelle (variable Region) bleibt beim Klassen-Switch erhalten Inge Vonnieda 28

29 Antigenbindungsstelle Bestimmt die Spezifität Zusammengesetzt aus den variablen Regionen der H- und L-Ketten Hypervariable Regionen bei: (CDR = komplementaritäts determinierende Regionen) Leichtkette: AA AA AA Schwere Kette AA AA AA Inge Vonnieda 29

30 Antigen (aus Antigene (kurz für Antisomatogene) sind Moleküle, die vom Immunsystem bekämpft werden, weil sie vom Körper als körperfremd erkannt werden. Sie lösen eine Immunreaktion oder Immunantwort aus. Sie heißen Antigene, weil sie die Bildung von spezifisch gegen sie gerichteten Antikörpern hervorrufen können. (Sie haben nichts mit Genen zu tun). Antigene können aus ganz verschiedenen Molekülen bestehen: Die meisten sind Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und Komplexe aus diesen Molekülklassen. Auch körpereigene Strukturen können als Antigene wirken, wenn sie fälschlicherweise als fremd angesehen werden. Dadurch wird eine Autoimmunreaktion ausgelöst. Kleine Moleküle wie einzelne Kohlenhydrate, Amino- oder Fettsäuren können keine Immunreaktion bewirken. Verschiedene niedermolekulare Stoffe, die alleine keine Antikörperreaktion hervorrufen können, sondern nur, wenn sie an ein Trägerprotein gebunden sind, heißen Haptene. Inge Vonnieda 30

31 Antigen Antikörper Bindung Ausbildung nicht kovalenter Bindungen zwischen Antigen und Aminosäuren der hypervariablen Regionen des Antikörpers Wasserstoffbrücken Elektrostatische Anziehung Van-der-Waals-Bindung Hydrophobe Bindung In der Summe beachtliche Bindungsenergie Abhängig vom Abstand zwischen den reagierenden Gruppen Inge Vonnieda 31

32 Antigen Antikörper Bindung Überlappende Elektronenwolken nicht genau passender Antigene erhöhen sehr stark die Abstoßung zwischen Antigen und Antikörper Schlechte Passform des Antigens vermindert die Anziehungskräfte Inge Vonnieda 32

33 Antikörperaffinit rperaffinität Affinität = Kraft einer einzelnen (monovalenten) Antigen-Antikörper-Bindung (Summe aller anziehenden und abstoßenden Kräfte) Hohe Affinität = hohe Passform Niedrige Affinität = schlechte Passform Inge Vonnieda 33

34 Avidität (=funktionelle Affinität) t) Multivalente Bindung (mind. 2 Bindungsstellen) erhöht die Stabilität der Bindung Antigene besitzen i.d.r. viele Bindungsstellen => multivalente Bindung auch mit IgG Haptene besitzen nur eine antigene Determinante => monovalente Bindung Inge Vonnieda 34

35 Kreuzreaktivität Ein Antigen kann verschiedene Determinanten haben. Verschiedene Antigene können gleiche Determinanten haben. Ein Antiserum enthält eine Antikörpergemisch aus Antikörpern gegen alle Determinanten eines Antigens. Ein Antiserum, das durch Immunisierung mit Antigen A gebildet wurde, kann mit Antigen B kreuzreagieren. Inge Vonnieda 35

36 Antikörperbildung Bakterium oder Virus o.ä. gelangt in den Körper Makrophagen nehmen es auf, lysieren es und präsentieren Antigene. Passende T-Lymphozyten werden aktiviert. Proliferation passender B-Lymphoyzten zu Plasmazellklonen Antikörperbildung in Plasmazellen Gleichzeitig Bildung von Gedächtniszellen Inge Vonnieda 36

37 Polyklonale Antikörper Antiserum stammt aus Mensch oder Tier Werden nach Immunisierung aus verschiedenen Plasmazellklonen gebildet Verschiedene Antikörper (Mischung) gegen verschiedene Determinanten des Antigens mit unterschiedlicher Affinität zum Antigen Kreuzreaktionen möglich Inge Vonnieda 37

38 Monoklonale Antikörper Nach Immunisierung werden Plasmazellen eines Versuchstiers (Maus) mit Myelomzellen fusioniert. Anlegen von Zellkulturen (Zellklone) einzelner Hybridzellen, die die gewünschten Antikörper produzieren. Trennung und weitere Zellkultur der gewünschten Hybridzellen => Zellklone, die monoklonale Antikörper produzieren Groß angelegte Produktion monoklonaler Antikörper möglich Inge Vonnieda 38

39 Monoklonale Antikörper Alle Antikörper haben gleiche Spezifität. gleiche Affinität gleiche Avidität Chimärenbildung möglich Einsatzgebiete in Diagnostik und Therapie Inge Vonnieda 39

40 Designer-Antik Antikörper Chimäre Maus-Mensch-Antikörper Murine V-Domänen und human C-Domänen => geringere Antigenität beim Mensch, Anwendung in vivo möglich Übertragung der hypervariablen Domänen von einer Spezies in die Grundgerüst-Regionen der V- Domänen einer anderen Spezies Änderunge einzelner Aminosäuren der Bindungsstelle zur Erhöhung der Affinität Aus: Inge Vonnieda 40

41 Grundlagen der Immunologie Methoden

42 Heidelberger Kurve AG-Überschuss lösliche Immunkomplexe proportional zur AK- Konzentration Äquivalenzbereich unlösliche Immunkomplexe Immunkomplexe können sichtbar gemacht werden AK-Überschuss lösliche Immunkomplexe proportional zur AG- Konzentration Inge Vonnieda 42

43 Präzipitation zipitation,, Agglutination Präzipitation Ein molekulares AG wird bei bekannter AK-Konzentration durch Diffusion (meist Gel) so verdünnt, dass sich Präzipitate bilden (Äquivalenzbereich). Agglutination Großes Antigen (Erythrozyten, Bakterien, Latexpartikel) Sichtbare Agglutination Mit Antigen oder Antikörper beschichtete Latexpartikel möglich. (z.b. Tinaquant ) Inge Vonnieda 43

44 Turbidimetrie, Nephelometrie Turbidimetrie Die Trübungsänderung einer Lösung, die durch Immunkomplexbildung entsteht, wird photometrisch gemessen. Nephelometrie Das Streulicht, das durch Immunkomplexbildung entsteht, wird gemessen. Inge Vonnieda 44

45 Immunelektrophorese Eiweiß-Elektrophorese Antiserum mit AK gegen alle Eiweißfraktionen diffundiert senkrecht zur Trennrichtung Bildung scharfer Präzipitationslinien im Äquivalenzbereich Inge Vonnieda 45

46 Durchflusszytometrie (FACS) Fluoreszenzmarkierte Antikörper werden an Zellen (z.b. Lymphozyten) gebunden. Die Zellen werden in einer Durchflusszelle (Kapillare) von einem Laser erfasst. Fotodetektoren erfassen Vorwärtsund Seitwärtsstreulicht und Fluoreszenz. Inge Vonnieda 46

47 Durchflusszytometrie (FACS) Durch verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe sind parallel mehrere Antigene (Zellpopulationen) nachweisbar. Inge Vonnieda 47

48 Anti-Immunglobulin Immunglobulin-Antikörper Immunglobuline sind für andere Spezies immunogen Die gebildeten Antikörper erkennen konservierte Merkmale der Immunglobuline (z.b. Fc-Teil des IgG) Verschiedene Einsatzmöglichkeiten Coombstest in der Blutgruppenserologie (direkt, indirekt) Westernblot Immunoassay (z.b. ELISA) Inge Vonnieda 48

49 Coombstest Direkt Antikörper der Mutter gehen durch die Plazenta und binden an kindliche Erythrozyten. (direkte Agglutination nicht möglich) Durch Zugabe eines Anti-Human- Globulins werden die Erythrozyten agglutiniert. Indirekt Im Serum der Mutter sind Antikörper, die mit Rhesuspositiven Erythrozyten inkubiert werden Beladung der Erys mit AK Zugabe von AHG Agglutination Inge Vonnieda 49

50 Western Blot Zerlegung der Proteine, z.b. Viren durch SDS-PAGE SDS = Natriumdodecylsulfat PAGE = Polyacrylamidelektrophorese Übertragen der Proteine auf Nitrocellulose und Markierung der gewünschten Proteine durch Antikörper Nachweis der AK-Bindung durch enzymgekoppelte Antikörper Inge Vonnieda 50

51 Immunoassay Nachweis von AG oder AK mit Hilfe des markierten Reaktionspartners. Enzyme (die meisten klinischchemischen immunologischen Untersuchungen) (ELISA) Fluoreszenz (z.b. an Gewebeschnitten, Durchflusszytometrie) ( Radioaktivität (nur noch selten angewandt) Licht (bei Elecsys) Inge Vonnieda 51

52 Immunoassay Homogen AG-AK-Reaktion und Messung läuft in flüssiger Phase ab. Keine Waschschritte notwendig Marker meist Einzym Antikörperbindung inhibiert oder stimuliert die Enzymaktivität Inge Vonnieda 52

53 Immunoassay Heterogen Ein Reaktionspartner ist an eine Festphase gebunden (Röhrchen, Mikrotiterplatten, Mikropartikel) Unterschiedliche Marker möglich: Radioaktive Isotope: Radio-Immunoassay RIA Enzyme: Enzym linked immunosorbent assay ELISA Fluorogene: Fluoreszenz Immunoassay FIA Luminogene: Lumineszenz Immunoassay LIA Inge Vonnieda 53

54 Immunoassay Heterogen Sandwichtest Bindung eines hochmolekularen Moleküls an die Festphase und den markierten Reaktionspartner Auswaschen der nicht gebundenen, markierten Moleküle Nachweis des gebundenen Labels Sehr hohe Sensitivität Inge Vonnieda 54

55 Immunoassay Heterogen Kompetitiv Geeignet für kleine Moleküle (AG), die nur einen AK binden können. Die AG aus der Probe konkurrieren mit zugegebenen AG (evtl. markiert) um den AK (evtl. markiert) Nach Waschen Nachweis des gebundenen Labels Hohe Sensitivität Inge Vonnieda 55

56 ECL-Technologie Elektro-Chemi-Lumineszenz Universelle Festphase: paramagnetischer, mit Streptavidin beschichteter Mikropartikel Je nach Test können Biotin-beschichtete Antigene oder Antikörper verwendet werden, die über Biotin an Streptavidin binden. Zum Nachweis dienen Ruthenium-Komplex-markierte Antigene oder Antikörper. Inge Vonnieda 56

57 ECL-Technologie Nachweis eines Antigens Bindung von Biotin-markiertem AK und Ruthenium-markiertem AK an das AG Bindung an Streptavidin auf Mikropartikeln Messung Inge Vonnieda 57

58 ECL-Technologie Nachweis eines Antikörpers Bindung von Biotin-markiertem AG und Ruthenium-markiertem AG an den AK Bindung an Streptavidin auf Mikropartikeln Messung Inge Vonnieda 58

59 ECL-Technologie Nachweis von IgM-AK IgG_AK aus der probe werden durch Fab-Fragment (AG- Bindungsstellen) gegen γ Ketten blockiert. Ruthenium-markiertes Antigen regiert mit dem IgM-AK. Biotin-markiertes Anti-IgM bindet an Streptavidin Anti-IgM bindet an IgM, das das markierte AG gebunden hat. Messung Inge Vonnieda 59