Anti- Nukleosomen ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Nukleosomen
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- Susanne Weiner
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1 ORGENTEC Diagnostika GmbH Carl-Zeiss-Straße Mainz Tel.: Fax: Anti- Nukleosomen ORG Tests Immunometrischer Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Nukleosomen Gebrauchsanweisung
2 INHALTSVERZEICHNIS Einleitung... 4 Methodik... 6 Lieferumfang des Tests... 6 Technische Daten... 7 Erforderliche Laborgeräte... 8 Vorbereitung der Reagenzien... 8 Probenentnahme und Probenvorbereitung... 9 Assaydurchführung Auswertung der Ergebnisse Normalwerte Sensitivität Spezifität Kalibrierung Linearität Reproduzierbarkeit Literatur Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
3 EINLEITUNG Antikörper gegen Nukleosome, damals bekannt unter dem Begriff "LE Zellfaktor, wurden erstmalig in Assoziation mit dem systemischen Lupus erythematodes (SLE) im Jahr 1957 beschrieben äußerte Hardin die Vermutung, daß Nukleosome als Antigen bei der Entstehung von Antinukleären-Antikörpern bei SLE-Patienten agieren könnten. Erst 1995 wurden Nukleosome als Autoantigene bei systemischen Autoimmunerkrankungen beschrieben. Heutzutage ist das Vorkommen von Anti-Nukleosom-Antikörpern bei systemischen Lupus erythematodes und Medikamenten-induziertem Lupus bekannt. Nukleosome bestehen hauptsächlich aus einem Histon-Oktamer (vier Homodimere aus H2A, H2B, H3, H4) das von 146 DNA-Basenpaaren doppelt umwunden ist. Histon H1 interagiert mit dem Nukleosom und verbindet benachbarte Nukleosome über eine "Linker-DNA". Die daraus entstehende Nukleosomenstruktur spielt eine wichtige Rolle bei der Komprimierung der DNA im Zellkern. Antikörper die spezifisch gegen Nukleosome gerichtet sind, gemeinsam mit Lupus Anti-dsDNAund Anti-Histon-Antikörpern, die gegen Nukleosome gerichtet sind, gehören zur großen Familie der Anti-Nukleosom-Antikörper. Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist eine chronische Multisystemerkrankung unbekannter Ätiologie, die durch einen vaskulitischen Organbefall charakterisiert ist. Im Vordergrund des Krankheitsbildes stehen Nierenbeteiligungen (50%, Hautausschläge (70%), Arthralgie (90%), Beteiligung des ZNS (30%), Polyserositis und Zytopenien. Anbetracht der Schwierigkeiten einer Diagnose "systemischer Lupus erythematodes" wurde im Jahre 1982 vom American College of Rheumatology (ACR) ein Schema mit insgesamt 11 Diagnosekriterien für den SLE herausgegeben: - Schmetterlingserythem auf beiden Wangen - Diskoider Lupuserythematöse, erhabene Flecken - Photosensitivität nach Sonnenexposition rasch auftretender Hautausschlag - Schleimhautulzerationen schmerzlose orale oder nasopharyngeale Ulzerationen - Arthritis nicht-erosive Arthritis an mehr als zwei peripheren Gelenken - Serositis dokumentierte Pleuritis oder Perikarditis - Glomerulonephritis anhaltende Proteinurie > 0,5g/Tag oder Zylindrurie - neurologische Symptome Krampfanfälle oder Psychosen - Hämatologische Befunde immunhämolytische Anämie oder Leukopenie oder Lymphopenie oder Thrombozytopenie - Immunologische Befunde positiver LE-Zell-Test oder dsdna-antikörper-nachweis oder Sm-Antikörper-Nachweis oder falsch positive Luesreaktion - Antinukleäre Antikörper abnorm hoher ANA-Titer bei fehlender Einnahme von Medikamenten, die zu einem medikamenteninduzierten SLE führen können. Mindestens vier dieser Kriterien müssen gleichzeitig oder im Verlauf eines beliebigen Zeitraums vorhanden sein, um mit einer etwa 95%igen Wahrscheinlichkeit die Diagnose eines SLE stellen zu können. Unter den labordiagnostischen Parametern bildet der Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) auf der HEp-2 Zelle als serologische Eingangsdiagnostik einen der Grundpfeiler in der Diagnose des SLE. 3
4 Es konnte gezeigt werden, daß Anti-Nukleosom-Antikörper bei % der SLE-Patienten diagnostiziert werden. Auch wurden % der Lupus-Patienten mit Anti-Nukleosom- Antikörpern unter Abwesenheit von Anti-dsDNA- und Anti-Histon-Antikörpern beschrieben. Verglichen mit Anti-dsDNA-Antikörpern werden Anti-Nukleosom-Immunglobulin-G-Antikörper als sensitiverer Marker für SLE vermutet. Anti-Nukleosom-Antikörper werden fast ausnahmslos bei Lupus, Sklerodermie und Mischkollagenosen diagnostiziert. Bei SLE-Nephritiden wurde kürzlich gezeigt, daß Anti-nukleäre-Antikörper komplexiert mit Nukleosomen an Heparansulphat in der glomerulären Basalmembran (GBM) über Histonstrukturen der Nukleosomen binden können. METHODIK Das vorliegende Testbesteck ist ein indirekter Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von Autoantikörpern gegen Nukleosomen. Die Kavitäten der Mikrotiterplatte sind mit humanen Nukleosomen beschichtet. Auf einer Mikrotiterplatte können 96 Bestimmungen durchgeführt werden. Jede Mikrotiterplatte setzt sich aus 12 einzelnen Streifen mit jeweils 8 Kavitäten zusammen. Bei Bedarf können die Streifen in einzelne Kavitäten zerteilt werden. Die drei Reaktionsschritte stellen sich wie folgt dar: 1. Reaktionsschritt Die Antikörper in Standards, Kontrollen und Patientenproben werden an die immobilisierten Antigene in den Kavitäten gebunden. 2. Reaktionsschritt Das zugegebene Enzymkonjugat (anti-human-igg Meerrettich-Peroxidase) erkennt spezifisch die gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexe. 3. Reaktionsschritt Die gebundene Peroxidase setzt ein zugegebenes Substrat (TMB) in ein gefärbtes Produkt um. Auswertung Die optische Dichte der Proben wird in einem ELISA-Photometer bei 450 nm gemessen. Die Farbentwicklung ist direkt proportional zur gesuchten Autoantikörper-Konzentration. LIEFERUMFANG DES TESTES Eine Mikrotiterplatte mit mit 96 abbrechbaren Kavitäten, die mit humanen Nukleosomen beschichtet sind. Probenpuffer Konzentrat, (gelb)...1 Fläschchen, 20 ml, Waschpuffer Konzentrat...1 Fläschchen, 20 ml, Konjugat...1 Fläschchen, 15 ml, anti-human IgG, Peroxidase konjugiert, gebrauchsfertig, (rosa) TMB Substratlösung...1 Fläschchen, 3,3`, 5,5`- Tetramethylbenzidin, 15 ml, gebrauchsfertig Stopplösung, gebrauchsfertig...1 Fläschchen, 1M HCl, 15 ml Kontrollen, gebrauchsfertig...jeweils 1 Fläschchen, 1,5 ml, Kontrolle 1, Positivkontrolle Kontrolle 2, Negativkontrolle Standards A F, gebrauchsfertig...jeweils 1 Fläschchen, 1,5 ml, mit den Konzentrationen: 0-12, U/ml Arbeitsanleitung/Qualitätskontroll-Zertifikat 4
5 TECHNISCHE DATEN Untersuchungsmaterial: Erforderliche Probenmenge: Gesamt-Inkubationszeit Meßbereich: Meßwellenlänge: Empfindlichkeit: Lagerung: Serum oder Plasma 10 µl Probe für eine 1 : 100 Probenvorverdünnung 100 µl verdünnte Probe pro Einzelbestimmung 60 Min. bei Raumtemperatur (20-28 C) U/ml 450 nm 0,5 U/ml bei 2-8 C im Kühlschrank ERFORDERLICHE LABORGERÄTE Geräte/Reagenzienvorbereitung Plattenphotometer mit einem optischen Filter der Meßwellenlänge 450 nm (ggf. Referenzwellenlänge von 620 nm) Wirbelmischer (Vortex) Mikropipetten mit Einmalspitzen für 10 µl, 100 µl und 1000 µl, evtl. Multipette destilliertes Wasser Meßzylinder für 100 ml und 1000 ml Gefäß zur Aufbewahrung der Waschlösung VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Komponenten dieses Testbesteckes liegen bis auf den Probenpuffer und den Waschpuffer ge-brauchsfertig vor. Die Lösungen sind nach dem Öffnen der Fläschchen und bei Lagerung im Kühlschrank bei 2-8 C bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Waschlösung Jede Flasche des Waschpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml (1 Liter) zu verdünnen. Die verdünnte Waschlösung ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Probenpuffer Jede Flasche des Probenpuffer-Konzentrates (20 ml) ist vor Gebrauch durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml zu verdünnen. Der verdünnte Probenpuffer ist bei einer Lagerung bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Mikrotiterplatte Es werden je nach Probenaufkommen die nötige Anzahl von Streifen oder Einzelkavitäten in den Rahmen der Mikrotiterplatte eingesetzt. Es sollte unbedingt darauf geachtet werden, daß die verpackte Mikrotiterplatte bereits Raumtemperatur angenommen hat, ehe die Folienverpackung geöffnet wird. Die nicht benötigten Streifen bzw. Kavitäten werden in dem wiederverschließbaren Beutel bei 2-8 C aufbewahrt. 5
6 Achtung: Werden bei einem Assayansatz nicht alle Streifen bzw. Kavitäten benötigt, muß der Rahmen der Mikrotiterplatte aufbewahrt werden. Nach Beendigung eines Testansatzes sollten die verbrauchten Kavitäten verworfen und der Rahmen der Mikrotiterplatte in den Kit zurück gelegt werden. PROBENENTNAHME UND PROBENVORBEREITUNG Die Bestimmung der Nukleosomen Antikörper wird im Serum oder Plasma durchgeführt. Die Serum- bzw. Plasmaproben werden vor der Messung 1 : 100 mit Probenpuffer verdünnt. 10 µl Probe plus 990 µl Probenpuffer Serum- und Plasmaproben können gekühlt bei 2-8 C bis zu 5 Tage aufbewahrt werden. Ist eine längere Lagerung beabsichtigt, sollten die Proben aliquotiert und bei -20 C tiefgefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. Seren und Plasmen mit erhöhten Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht. Seren und Plasmen mit erhöhten Bilirubinwerten, hämolytische oder lipämische Proben stören die Bestimmung nicht. TECHNISCHE HINWEISE Zur laufenden Kontrolle der Richtigkeit wird empfohlen, jeden Ansatz anhand von Kontrollseren zu überprüfen. ASSAYDURCHFÜHRUNG Vor Testbeginn müssen alle Reagenzien sowie die Patientenseren Raumtemperatur angenommen haben. 1. Eine ausreichende Anzahl von Kavitäten bzw. Mkrotiterplatten-Module zum Ansatz von Standards, Kontrollen und Patientenproben vorbereiten. Doppelbestimmungen werden empfohlen. 2. Für die Bestimmung von IgG- oder IgM-Autoantikörpern werden jeweils 100 µl Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben entsprechend der Plattenbelegung in die Mikrotiterplatte pipettieren. Sollen IgG- und IgM-Antikörper bestimmt werden, so müssen Standards, Kontrollen und vorverdünnte Patientenproben in doppeltem Ansatz pipettiert werden. 6
7 Vorschlag für ein Pipettierschema: A SA SE P1 P5 B SA SE P1 P5 C SB SF P2 P.. SA bis SF: Standards A bis F D SB SF P2 P.. P1, P2... Patientenproben 1, 2... E SC K1 P3 K1: Positivkontrolle F SC K1 P3 K2: Negativkontrolle G SD K2 P4 H SD K2 P4 1. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 3. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 4. Jeweils 100 µl Enzymkonjugatlösung in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) 5. Kavitäten entleeren und insgesamt 3 mal mit jeweils 300 µl Waschpuffer waschen. Einwirkzeit des Waschpuffers: mindestens 25 sec. Waschpufferreste müssen vollständig aus den Kavitäten entfernt werden. Hierzu sollte die Mikrotiterplatte mehrere Male kräftig mit der Öffnung nach unten auf eine saugfähige Unterlage ausgeschlagen werden. 6. Jeweils 100 µl TMB Substratlösung in die Kavitäten pipettieren. 3. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-28 C) µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren und die Platte ca. 5 Minuten stehen lassen. 8. Messung der optischen Dichte aller Proben im Plattenphotometer innerhalb von 30 Minuten bei einer Wellenlänge von 450 nm. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Eine Standardkurve erhält man durch Auftragen der gemessenen optischen Dichte gegen die vorgegebene Standardkonzentration. 7
8 NORMALWERTE Im Rahmen einer umfangreichen Normbereichsstudie wurde anhand von Blutspender-Seren mit dem Anti-Nukleosomen ELISA der folgende Wert ermittelt: Cut-off: 20 U/ml SENSITIVITÄT Die untere Nachweisgrenze für Anti-Nukleosomen beträgt 0,5 U/ml. SPEZIFITÄT Die Mikrotiterplatte ist mit humanen Nukleosomen beschichtet. Der Anti-Nukleosomen Kit erfaßt daher nur spezifisch Autoantikörper, die gegen Nukleosomen gerichtet sind. KALIBRIERUNG Das quantitative Meßsystem für Anti-Nukleosomen Antikörper ist in relativen Einheiten Kalibriert. LINEARITÄT Für die Verdünnungsexperimente wurden Seren/Plasmen mit hohen Antikörperkonzentrationen in steigenden Verdünnungsstufen (Verdünnung im Probenpuffer) im Assay eingesetzt. Die Ergebnisse sind über den gesamten Meßbereich linear. REPRODUZIERBARKEIT In der untenstehenden Tabelle sind die Variationskoeffizienten (VK %), die für die Intra- und die Inter-Assay-Varianz des Anti-Nukleosomen Kits ermittelt wurden, aufgeführt. Zur Ermittlung der Intra-Assay-Varianz wurden drei Seren mit unterschiedlichen anti- Nukleosomen Konzentrationen jeweils 24-fach auf einer Platte gemessen. Für die Bestimmung der Inter-Assay-Varianz wurden drei Proben mit unterschiedlichen anti- Nukleosomen Konzentrationen auf fünf Platten jeweils sechsfach gemessen. Intra-Assay Inter-Assay Proben Mittelwert Variationskoeffizient Proben Mittelwert Variations- Nr. [U/ml] (%) Nr. [U/ml] koeffizient (%) , , , , , ,5 LITERATUR 1. Burlingame RW, Boey ML, Starkebaum G, et al. The central role of chromatin in autoimmune responses to histones and DNA in systemic lupus erythematosus. J Clin Invest, Jul 1994, 94(1) p Hardin JA The lupus autoantigens and the pathogenesis of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, Apr 1986, 29(4) p Amital H, Shoenfeld Y Nucleosomes, DNA and SLE: where is the starting point? [editorial; comment] Clin Exp Rheumatol, Sep-Oct 1996, 14(5) p
9 4. Burlingame RW The clinical utility of antihistone antibodies. Autoantibodies reactive with chromatin in systemic lupus erythematosus and drug-induced lupus. Clin Lab Med, Sep 1997, 17(3) p Berden JH, Licht R, van Bruggen MC, et al. Role of nucleosomes for induction and glomerular binding of autoantibodies in lupus nephritis. Curr Opin Nephrol Hypertens, May 1999, 8(3) p Amoura Z, Koutouzov S, Chabre H, et al. Presence of antinucleosome autoantibodies in a restricted set of connective tissue diseases: antinucleosome antibodies of the IgG3 subclass are markers of renal pathogenicity in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, Jan 2000, 43(1) p Chabre H, Amoura Z, Piette JC, et al. Presence of nucleosome-restricted antibodies in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, Oct 1995, 38(10) p Holman HR, Kunkel HG Affinity between the lupus erythematosus serum factor and cell nuclei and nucleoprotein,science, 1957, 126 p162-3 HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Alle Reagenzien dieser Testpackung dürfen ausschließlich zur in vitro-diagnostik verwendet werden. Die Einhaltung des vorgeschriebenen Protokolls zur Durchführung des Tests ist unbedingt erforderlich. Die Richtlinien zur Durchführung der Qualitätskontrolle in medizinischen Laboratorien sind zu beachten (Mitführen von Kontrollen, Poolseren). Die Lagerung der Kitreagenzien sollte bei 2 bis 8 C im Kühlschrank erfolgen. Einzelne Komponenten verschiedener Chargen und Testbestecke sollten nicht ausgetauscht werden. Die auf der Verpackung und den Etiketten der einzelnen Komponenten angegebenen Verfallsdaten sind zu beachten. Alle Testkomponenten vor Testbeginn auf Raumtemperatur (20-28 C) bringen und gut durchmischen. Der Testkit enthält Reagenzien, die aus humanen Serum- oder Plasmabestandteilen hergestellt sind. Die Ausgangsreagenzien wurden mit Immunoassaymethoden auf Antikörper gegen HIV 1, HIV 2, HCV und auf das Hepatitis B Oberflächenantigen untersucht. Alle getesteten Parameter wurden für negativ befunden. Für den Umgang mit Kitreagenzien, Kontroll- und Serumproben sind die Vorschriften zur Unfallverhütung für den Gesundheitsdienst beim Umgang mit potentiell infektiösem Material einzuhalten. Insbesondere sind folgende Vorsichtsmaßregeln zu beachten: - nicht essen, trinken oder rauchen - nicht mit dem Mund pipettieren, Sicherheitspipetten verwenden - Handschuhe tragen und Kontakt mit Reagenzien, Kontrollproben und Untersuchungsmaterial vermeiden Untersuchungsmaterial (z.b. Plasma- oder Serumproben), wie es für Laboratoriumsuntersuchungen eingesetzt wird, ist stets als potentiell infektiös einzustufen. Unter den gleichen Sicher-heitsvorkehrungen sind ebenso Kitreagenzien und Kontrollproben zu handhaben. Infektiöse Proben sollten stets besonders gekennzeichnet werden und ggf. in Sicherheitswerkbänken (z.b. Laminar Flow-Arbeitsplatz) bearbeitet werden. Die Reagenzien dieses Testbestecks enthalten zum Schutz gegen bakterielles Wachstum Konservierungsmittel; daher ist die Berührung mit der Haut und/oder Schleimhäuten zu vermeiden. 9
10 Das Substrat TMB (3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidin) ist toxisch bei Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser und Seife abwaschen. Vermeiden Sie den Kontakt der Peroxidlösung mit leicht oxidierbaren Materialien. Extreme Temperaturschwankungen können zum spontanen Zerfall des Peroxids führen. Ein Kontakt mit der Salzsäure enthaltenden Stopp-Lösung ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch gründlich reinigen. KURZANLEITUNG 10
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