Chemiepraktikum für Biologen. Versuchsprotokoll. Dünnschichtchromatographie (von Farbstoffen, Aminosäuren und Monosacchariden)

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1 Johannes Gutenberg Universität Fachbereich Biologie Chemiepraktikum für Biologen SS 2002 Versuchsprotokoll zum Thema Dünnschichtchromatographie (von Farbstoffen, Aminosäuren und Monosacchariden) von

2 1) Farbstofftrennung Geräte / Material: Substanzen / Lösungen: Dünnschichtchromatographieflachtank mit Blech und Deckel Fließpapier Dünnschichtchromatographieplatte Kapillaren Bromkresolgrün (Br) Fuchsin (Fu) Fluoreszin (Fl) Malachitgrün (Ma) Methylrot (Me) Methylenblau (Meb) Aceton Essigsäureethylester 100 % Essigsäure konz. Ammoniaklösung Durchführung: Siehe Skript Beobachtung: Laufmittel / Fließmittel: Tank 1: / Aceton / Essigsäureethylester Tank 2: / Wasser / Essigsäure Tank 3: / Wasser / Konz. Ammoniak Tank 1 Tank 2 Tank 3 2

3 Erklärungen der Abkürzungen siehe oben bei Substanzen und Lösungen Die oben gezeigten Platten sind die Ergebnisse der Chromatographie bei den oben genannten verschiedenen Laufmitteln. Die dazu gehörigen R f Werte findet man bei Stichwort Tabellen. Tabellen: Stoff Rf - Werte Br 0,898 Fu 0,7627 Fl 0,915 Ma 0,084 Me 0,915 Meb 0,1 Stoff Rf - Wert Br 0,89 Fu 0,948 Fl 0,86 Ma 0,966 Me 0,93 Meb 0,724 Stoff Rf - Wert Br 0,6897 Fu 0,6897 Fl 0,6897 Ma 0,638 Me 0,793 Meb 0,0862 Tank 1 Tank 2 Tank 3 Definitionen: R f -Wert (retarding factor) dient zur Beschreibung des Laufverhaltens aufgetrennter Substanzen. b (Entfernung vom Startpunkt bis zum Mittelpunkt des Substanzfleckes) R f = a (Entfernung vom Startpunkt bis zur Fließmittelfront) Der R f -Wert ist von verschiedenen Faktoren abhängig. So zum Beispiel von der Art des Lösungsmittels, der Kammer- bzw. Plattengröße, der Temperatur, dem Trägermaterial, der Konzentration und der Luftfeuchtigkeit. Auswertung: Die Frage, die hier behandelt werden soll, ist folgende: Warum laufen die Farbstoffe bei den verschiedenen Laufmitteln auf den Chromatographieplatten unterschiedlich weit, weisen also unterschiedliche Rf Werte auf, im Bezug auf ihrer Zusammensetzung? Um die Frage zu beantworten, muß man die drei Platten gruppenweise betrachten. Hierzu vergleicht man das Verhalten der Stoffe der ersten und der zweiten Platte, sowie die der zweiten und dritten Platte miteinander. Bei dem erst genannten Vergleich unterscheidet man zwischen einem polareren und unpolareren Laufmittel. Bei dem letztgenannten vergleicht man ein saures mit einem eher basischen Laufmittel. 3

4 Um die R f Werte mit dem Laufmittel in Verbindung zu setzen, muß man die Strukturformeln der Farbstoffe betrachten. (aus Skript) Bei der Auswertung muß man sich hauptsächlich auf die Stoffe beschränken, die bei den zu vergleichenden Platten ein völlig anderes Laufverhalten aufweisen. Bei der ersten und zweiten Platte ist dies Malachitgrün und Methylenblau. Anhand der obigen Strukturformeln der beiden genannten Stoffe wird klar, warum das Laufverhalten auf der zweiten Platte mit dem polareren Lösungsmittel besser ist. Die Strukturformel der Farbstoffe zeigt geladene Teilchen (Ionen). Polare Flüssigkeiten, wie z.b. Wasser, können Ionenverbindungen lösen. So kommt es zu Ion-Dipol- Anziehungskräften. Das positive Ion des Lösungsmittels tritt in Wechselwirkung mit dem negativen Ion des Farbstoffs und umgedreht. 4

5 Man kann also sagen, dass durch die Ionenladung der Farbstoffe eine gewisse Polarität besteht, die auch bei polaren Lösungsmitteln wie Wasser vorhanden ist. Hier gilt der Merksatz: Ähnliches löst Ähnliches Beim Vergleich der zweiten und dritten Platte geht es vorrangig nicht um die Polarität der Stoffe und Laufmittel. Hier stehen die Verhalten im Bezug auf die Säure Base Eigenschaften der Stoffe im Vordergrund. Das zweite Laufmittel ist sauer und das dritte basisch. Anhand des Farbstoffs Fuchsin kann man die Säure Base Eigenschaften gut erklären. Fuchsin weist drei NH 2 Gruppen auf. Diese Gruppen sind basisch, da sie mit einer Säure reagieren können. Eine Base ist nach Bronstedt ein H-Atom Akzeptor. Dies ist hier der Fall. Das saure Laufmittel reagiert mit den basischen Gruppen des Fuchsins. Dadurch wird der Farbstoff mit über die Platte gezogen. Dagegen reagiert er mit einem basischen Laufmittel nicht und wird somit kaum mitgezogen (im Bezug auf das Säure-Base-Verhalten). Das er doch ein wenig wandert, zeigt das auch noch andere Kriterien, wie die oben erwähnte Polarität eine Rolle spielen. Ein noch besseres Beispiel ist auch hier das Methylenblau. (siehe Tabelle 2 und drei sowie 2. und 3. Platte). Auch hier gelten die eben erwähnten Erklärungen. 5

6 2) Trennung von Monosacchariden Geräte / Material: siehe Teil 1) Substanzen / Lsg.: Durchführung: D- Arabinose (Ara) D- Xylose (Xyl) D- Glucose (Glu) D- Galactose (Gal) D-Fructose (Frau) Sprühreagenz aus 3-Methoxyphenol und Schwefelsäure in Essigsäureethylester 100% Essigsäure ANALYSENLÖSUNG siehe Skript Beobachtung: Laufmittel besteht aus Essigsäureethylester / / Essigsäure und Wasser im Verhältnis 8 : 1 : 1 : 1. Die Abkürzungen sind oben erklärt. Das Abkürzung Ref. bedeutet Referenzpunkt. Auf diesem Punkt ist die zu analysierende Lösung aufgetragen worden. Durch das Anfärben kann man die einzelenen Zucker mit denen in der Analysenlösung vergleichen und anhand der Steighöhen die unbekannten Stoffe in der Lösung identifiezeren. Auswertung: Anhand der gemachten Beobachtungen konnten wir herausfinden, dass in unserer unbekannten Lösung Glukose und Fructose enthalten ist. (Auf Rf- Werte wurde hier nicht eingegangen. Natürlich weisen die auf dem Ref.-Punkt die gleichen Werte auf, wie die bei den bekannten Substanzen.) 6

7 3) Trennung von Aminosäuren Geräte / Material: siehe Teil 1) Lösungen / Substanzen: Durchführung: L- Alanin (Ala) L- Glutaminsäure (Glu) Glycin (Gly) L- Leucin (Leu) L. Methionin (Met) L-Serin (Ser) L- Valin (Val) Ninhydrin-Sprühreagenz Essigsärueethyleste Konz. Ammoniak Lsg. siehe Skript Beobachtung: Laufmittel besteht aus Essigsäureethylester / konz. Ammoniak-Lsg. / im Verhältnis 3 : 1 : 2. Die Abkürzungen sind oben erklärt. Für den Ref. punkt gelten die gleichen Angabe wie unter Punkt 2). Auswertung: In unserer unbekannten Analysenlösung sind die beiden Aminosäuren Glutaminsäure und Methionin enthalten. Im Bezug auf die R f Werte gilt das unter Punkt 2) genannte. 7