ThromboType Test (HPA 1-6, 15)

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1 GEBRAUCHSANLEITUNG ThromboType Test (HPA 1-6, 15) REF THROMBOTYPE IVD ThromboType Reagenzien E-Gel 48 TABLE OF CONTENTS Inhaltsverzeichnis GEBRAUCHSANLEITUNG... 2 ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN... 2 TESTPRINZIP... 2 REAGENZIEN... 2 VORSICHTSMAßNAHMEN... 3 WARNHINWEISE... 3 PROBENGEWINNUNG... 3 DURCHFÜHRUNG... 4 Mitgelieferte Materialien... 4 Weitere benötigte Materialien... 4 Testdurchführung... 4 QUALITÄTSKONTROLLE... 8 INTERPRETATION DER ERGEBNISSE... 8 LIMITATIONS Einschränkungen... 9 SPEZIFISCHE CHARAKTERISTIKA DES TESTS... 9 BIBLIOGRAFIE ThromboType Test IFUDE REV E

2 GEBRAUCHSANLEITUNG Der ThromboType Test ist ein Test zur molekulargenetischen Typisierung von HPA 1 (PL A ), HPA-2 (Ko), HPA-3 (Bak), HPA-4 (Pen), HPA-5 (Br), HPA-6 (Ca) und HPA-15 (Gov) mittels PCR-Amplifikation humaner genomischer DNA. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN Grundlage der humanen Plättchenalloantigensysteme sind individuelle Unterschiede einzelner Aminosäuren in den thrombozytären Glykoproteinen. Obwohl ein Einfluss der Aminosäuremodifikationen auf die Funktion der Proteine nicht unmittelbar erkennbar ist, führen sie zu Veränderungen der Proteinstruktur. Die daraus resultierenden antigenen Determinanten können Ziel der Immunantwort werden und zur Bildung von Allo- oder Autoantikörpern führen. Diese wiederum können lebensbedrohliche Blutgerinnungsstörungen hervorrufen. Hierzu gehören die Transfusionsrefraktärität bei Therapie mit Thrombozytenkonzentraten, die Posttransfusionspurpura und die neonatale Alloimmunthrombozytopenie. Bisher verwendete serologische Methoden zur Typisierung von Plättchenantigenen haben ihre Grenzen, da es an gut charakterisierten Alloantiseren mangelte, und Plättchen bei thrombozytopenischen Patienten häufig schwer zu isolieren sind. Durch Fortschritte auf dem Gebiet der Plättchenimmungenetik ist es inzwischen möglich, die Unterschiede einzelner Nukleotide, die die Allelen der HPA-Polymorphismen charakterisieren, zu bestimmen. Es kann somit eine Genotypisierung von Individuen durchgeführt werden. Der ThromboType Test ist eine Alternative zur serologischen Typisierung von Plättchenmerkmalen. Bei der Auswahl kompatibler Plättchenkonzentrate für alloimmunisierte Empfänger stellt der Test eine Ergänzung zum HLA-Matching dar. ThromboType Test enthält Reagenzien zur Durchführung einer Allel-spezifischen PCR unter Verwendung von isolierter genomischer DNA und zur Identifizierung des individuellen Genotyps für HPA 1, 2, 3, 4, 5, 6, und 15. Die Auswertung erfolgt mittels Gelelektrophorese. TESTPRINZIP Der Test nutzt eine gesetzlich geschützte, modifizierte Form der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung Allelspezifischer Primer, bei der es zur Entstehung eines PCR-Produktes kommt, wenn das entsprechende Allel in der Probe vorliegt. Über die Amplifikation kann das Vorhandensein von Allelen für die Plättchenpolymorphismen HPA-1 (PL A ), HPA-2 (Ko), HPA-3 (Bak), HPA-4 (Pen), HPA-5 (Br), HPA-6 (Ca) und HPA-15 (Gov) in einer DNA-Probe bestimmt werden. Zunächst wird genomische DNA aus der Probe des Patienten isoliert. Hierfür können kommerzielle Systeme oder in der Fachliteratur beschriebene Techniken für die Isolierung von hoch-reiner genomischer DNA verwendet werden. Mit Hilfe der mitgelieferten Gefäße und Reagenzien wird eine Amplifikation der isolierten DNA durchgeführt. Nach der Amplifikation wird ein Aliquot jeder Reaktion in eine Vertiefung eines Agarosegels pipettiert. Die PCR-Produkte werden mittels Elektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt (Dauer min.). Die Auswertung des Gels erfolgt auf einem UV-Tisch (UV-Transilluminator). Das Vorliegen eines PCR-Produkts von spezifischer Größe zeigt das Vorhandensein des jeweiligen Allels in der DNA-Probe an. Produktbanden von internen Kontrollprimern zeigen an, dass in jeder PCR-Reaktion geeignete Reaktionsbedingungen vorgelegen haben. Zur Dokumentation der Testergebnisse kann ein Foto des Gels angefertigt werden. REAGENZIEN Maximale Anzahl an Bestimmungen pro Testpackung: ThromboType: 8 Bestimmungen pro Testpackung Alle Reagenzien müssen entsprechend den Angaben der Etiketten gelagert werden. REF PT a/b HPA-Primer Gefäße: PCR-Gefäße mit innen anhaftenden getrockneten Allel-spezifischen Primern. Die Gefäße befinden sich in wieder verschließbaren Beuteln. Gebrauchsfertig. a: Violette Gefäße: Die Gefäße enthalten spezifische Primer für die a -Allele von HPA 1, 2, 3, 4, 5, 6, und 15 (in dieser Reihenfolge) und ein leeres Gefäß, das mit einem schwarzen Punkt markiert ist. b: Grüne Gefäße: Die Gefäße enthalten spezifische Primer für die b -Allele von HPA 1, 2, 3, 4, 5, 6, und 15 (in dieser Reihenfolge) und ein leeres Gefäß, das mit einem schwarzen Punkt markiert ist. LAD bp DNA-Leiter: Einzelne Fragmente doppelsträngiger DNA, beginnend bei 100 bp und in 100 bp- Schritten aufsteigend bis 1000 bp in einem Tris-Puffer. Gebrauchsfertig. PR fach konzentriertes PCR Reagenz: Tris-HCL-Puffer mit Magnesiumchlorid, Oligonukleotidprimern, freien Desoxynukleotid-Triphosphaten (dntp s) sowie andere gesetzlich geschützte Komponenten. Vor Gebrauch verdünnen. E-Gel E-Gel 48 Gel: vorgefertigte Agarosegele (4%), die für die Auftrennung der PCR-Produkte verwendet werden. Gebrauchsfertig. ThromboType Test IFUDE REV E

3 VORSICHTSMAßNAHMEN Reagenzien oder Gele nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden. Keine trüben oder kontaminierten Reagenzien verwenden. Gele, die beschädigt oder ausgetrocknet sind, sollen nicht verwendet werden. Die in der Testpackung enthaltenen PCR-Gefäße und Reagenzien dürfen nicht in Verbindung mit anderen Testsystemen verwendet werden. Der schwarze Punkt auf dem Leergefäß dient der Orientierung der Primer Gefäße. Die eingeprägten Nummern in den Streifen sollten nicht als Referenz benutzt werden. Der Austausch von Komponenten, die nicht zu dieser Testpackung gehören, kann zu widersprüchlichen oder fehlerhaften Ergebnissen führen. Aufgrund von Schwankungen in der Leistung verschiedener Thermocycler kann es notwendig werden, die Laufparameter des Thermocycler-Programms anzupassen. DNA nicht aus heparinisiertem Blut isolieren. Heparin kann die Amplifikation stören. Das PCR-Verfahren ist geschützt durch mehre Patente, deren Inhaber die Firmen Roche Molecular Systems und F. Hoffmann LaRoche Ltd. sind. Informationen bzgl. Lizenzen zur Durchführung der PCR erhalten Sie (für die USA) beim Director of Licensing at Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, oder (außerhalb der USA) beim PCR- Lizenzmanagement, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Grenzacherstr. 124, CH-4070 Basel, Schweiz. PCR Laborpraxis Die ausgeprägte Fähigkeit der PCR zur Vervielfältigung von DNA-Sequenzen macht die Methode empfindlich gegen Kontaminationen mit Fremd-DNA, auch wenn es sich nur um geringe Mengen handelt. Daher sollte alles unternommen werden, um die Verschleppung von bereits amplifizierter DNA in die zu testende DNA-Probe zu vermeiden. Das Risiko einer Kreuzkontamination kann reduziert werden, indem man Bereiche für Arbeiten vor der Amplifikation von Arbeitsbereichen für Arbeiten nach der Amplifikation trennt. Vorzugsweise sollten die Arbeiten in separaten Räumen erfolgen, wenigstens jedoch in getrennten Bereichen eines Raumes. Um freigesetzte Aerosole als Kontaminationsquelle zu vermeiden, kann eine biologische Sicherheitswerkbank für die DNA-Präparation genutzt werden. Zur Herstellung einer kontrollierten Arbeitsumgebung für PCR- Ansätze im Präamplifikationsbereich kann eine Dead Air Box verwendet werden. Sämtliche Arbeiten im Postamplifikationsbereich sollten auf saugfähigen wasserundurchlässigen Papierunterlagen zum Auffangen von Spritzern durchgeführt werden. Die Unterlagen sind unter Beachtung der gültigen nationalen Abfallrichtlinien für biologische Stoffe zu entsorgen. Jeder Arbeitsbereich sollte über einen eigenen Satz von zweckgebundenen Pipettiergeräten verfügen. Der Austausch von Laborzubehör zwischen Prä- und Postamplifikationsbereichen sollte so gering wie möglich gehalten werden. Jegliches Zubehör aus dem Postamplifikationsbereich sollte vor Einbringen in den Prä-Bereich mit einem DNA-inaktivierenden Agens behandelt werden (geeignet ist z.b. 10%-ige Bleichlösung für Haushaltszwecke). Für jeden Pipettierschritt sollte eine frische Pipettenspitze verwendet werden. Sofern keine Direktverdränger-Pipetten ( positive displacement ) verwendet werden, empfiehlt sich die Verwendung von Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere. Für jeden Arbeitsbereich sollten separate Laborkittel vorgesehen sein. Während der Arbeiten sollten die Handschuhe häufiger gewechselt werden. Weiterhin sollten bei der Testdurchführung die Kontrollprobe und die Umgebungskontrolle (Negativkontrolle Verwendung von Wasser anstatt DNA als Probe) nach den Patientenproben angesetzt werden. WARNHINWEISE Nach Beendigung des Tests sind für die Entsorgung der Abfälle die lokalen Vorschriften für die Entsorgung potentiell biogefährdender Abfälle zu beachten. Wieder verwendbare Materialien sind mit 10%-iger Bleichlösung oder anderen DNAinaktivierenden Wirkstoffen zu behandeln. Die UV-Tische, mit deren Hilfe PCR-Produkte sichtbar gemacht werden, emittieren energiereiches ultraviolettes Licht, welches Augen und die Haut schädigen kann. Tragen Sie bei Arbeiten am UV-Tisch immer entsprechende Schutzkleidung und eine UV- Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz. E-Gels enthalten zum Anfärben der DNA eine geringe Menge Ethidiumbromid. Ethidiumbromid ist als humanes Mutagen bekannt. Gelkassetten dürfen nicht geöffnet werden. Entsorgen Sie die Gele entsprechend den lokalen Vorschriften für die Entsorgung von Gefahrstoffabfällen. PROBENGEWINNUNG Isolieren Sie DNA nach einer in der Fachliteratur beschriebenen Methode oder mittels eines kommerziellen für diesen Zweck hergestellten Kits. Die DNA sollte in sterilem destilliertem Wasser oder 10 mm Tris-Puffer, ph 8,0-9,0, gelöst werden. Die Proben sollten nicht in Lösungen rehydriert werden, die mehr als 0,5 mm EDTA oder andere Chelatbildner enthalten. Diese können die PCR-Reaktion beeinträchtigen. DNA-Proben sofort nach der Isolation untersuchen oder in einem Gefrierschrank (ohne Abtauautomatik) bei 20 C oder kälter für längere Zeit (ein Jahr oder länger) lagern. Der Einsatz von gefrorenen Proben ( 20 C) im ThromboType Test, verdünnt in TRIS/EDTA-Puffer (10 mm TRIS, ph 8,0-9,0/0,5 mm EDTA) und gelagert in Röhrchen mir O-Ring Schraubverschluss, zeigte eine 100%-ige Übereinstimmung mit den Ergebnissen der DNA-Sequenzierung dieser Proben. Weitere Stabilitätsdaten zu gefrorenen Proben erhalten Sie auch auf den Webseiten von zwei Herstellern von DNA-Isolationskits: Gentra Systems und Qiagen. ThromboType Test IFUDE REV E

4 DNA-Proben sollten in einem Konzentrationsbereich von ng/µl vorliegen und ein Verhältnis der Absorptionen 260nm/280nm zwischen 1,60 und 1,90 aufweisen. Die Anwesenheit größerer Mengen an Protein, RNA, Heparin, EDTA oder anderer Chelatbildner können die PCR-Amplifikation stören. DURCHFÜHRUNG Die Gefäße in der Testpackung können mehr Reagenz enthalten, als auf dem Label angegeben ist. Entnehmen Sie deshalb immer die benötigten Mengen mit kalibrierten Pipetten. Mitgelieferte Materialien Verpackt für die Lagerung bei 2-8 C 1. Enthält acht wieder verschließbare Beutel mit jeweils einem Streifen mit 8 PCR-Gefäßen (violett) für die a-allele von HPA 1, 2, 3, 4, 5, 6, und 15. einem Streifen mit 8 PCR-Gefäßen (grün) für die b-allele von HPA 1, 2, 3, 4, 5, 6, und x 450 µl 2-fach konzentrierte PCR-Reagenz x 200 µl 100 bp-dna-leiter-standard FS 4. 3 Verschlussfolien für PCR-Gefäße Verpackt für die Lagerung bei C 1. 3 x 4% E-Gel 48 Weitere benötigte Materialien (nicht im Lieferumfang enthalten) Für die PCR Taq-Polymerase, nativ oder rekombinant, 5 U/µl. Keine anderen Hitze resistenten Polymerasen oder hot start Modifikationen von Taq-Polymerase verwenden Programmierbarer Thermocycler mit Heizblock für 0,2 ml PCR-Gefäße Silikon-Andruckmatte Verstellbare Mikropipetten für µl Volumen, sterile Pipettenspitzen mit Aerosolschutz DNA- und DNase-freies Wasser Eisbad oder Kühlblock für 0,6 ml oder 1,5 ml Gefäße und 0,2 ml PCR-Gefäße PCR-Gefäßständer für 0,2 ml Gefäße Vortexer Polypropylen-Mikrozentrifugengefäße mit anhängendem Verschlussdeckel (0,5 1,7 ml), DNA und DNase-frei 10 %-ige Bleichlösung oder anderes DNA-inaktivierendes Mittel Für die Elektrophorese und Auswertung Elektrophoreseeinheit E-Base-Motherbase Ständer für PCR-Gefäße (0,2 ml) Verstellbare Mikropipetten (Volumen 1-20 µl) und sterile Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere Wasserdichte saugfähige Unterlage für den Labortisch UV-Tisch UV-Transilluminator 10 %-ige Bleichlösung oder anderes DNA-inaktivierendes Mittel Deionisiertes Wasser Gel-Dokumentationssystem Optional verstellbare Mehrkanalmikropipette, Volumina 5 µl und 10 µl, sterile Pipettenspitzen mit Aerosolschutz elektronische Pipette oder Dispensierpipette (25 µl) und Pipettenspitzen mit Aerosolschutz Testdurchführung Zur Vorbereitung 1. Isolieren Sie genomische DNA von allen zu testenden Proben. Jede Probe sollte eine DNA-Konzentration im Bereich von ng/µl und ein Absorptionsverhältnis 260 nm/280 nm zwischen 1,60 und 1,90 aufweisen. 2. Programmierung des Thermocyclers mit dem ThromboType Test PCR-Programm. Die Parameter lauten wie folgt: 94 C 30 Sekunden ThromboType Test IFUDE REV E

5 94 C 1 Sekunde 57 C 30 Sekunden 6 Zyklen 72 C 10 Sekunden 94 C 1 Sekunde 65 C 30 Sekunden 27 Zyklen 72 C 10 Sekunden 72 C 12 Sekunden 4 C Halten Dieses Temperaturprotokoll wurde für den ABI PE9700 im Max mode entwickelt. Aufgrund unterschiedlicher Eigenschaften verschiedener PCR-Geräte muss der Test für jeden Gerätetyp individuell validiert werden, indem bekannte Proben zur Überprüfung der einwandfreien Funktion des Tests amplifiziert werden. Bei Auftreten von schwachen Banden erhöhen Sie die Zeiten für beide Annealing-Schritte in 1-Sekunden-Schritten bis maximal 35 Sekunden, bis die Produktmengen ausreichend sind. Bei Auftreten von schwachen hohlen Banden oder störenden Primer-Dimer-Produkten sind die Zeiten für beide Annealing-Schritte in 1-Sekunden-Schritten bis minimal 25 Sekunden zu erniedrigen, bis die Problembanden verschwunden sind. PCR 3. Nehmen Sie den Thermocycler einige Zeit vor Beginn des Laufs in Betrieb, damit der beheizbare Deckel seine Arbeitstemperatur erreichen kann. Überprüfen Sie, ob das PCR-Programm korrekt eingestellt ist. 4. Die Taq-Polymerase und das 2-fach konzentrierte PCR-Reagenz sollten auf Eis oder einem Kühlblock verarbeitet werden. 5. Pipettiergeräte und Arbeitsoberflächen sollten mit 10 %-iger Bleichlösung oder anderen DNA-inaktivierenden Mitteln gereinigt werden. 6. Legen Sie die Anzahl der zu testenden Proben fest. Für jede Probe ist ein 0,6 ml- oder ein 1,5 ml Mikrozentrifugen- Polypropylengefäß mit anhängendem Deckel zu beschriften. Ein weiteres Gefäß ist für die Negativkontrolle zu beschriften. Die Gefäße werden zur Herstellung der Mastermixe verwendet. Sie sind ebenfalls auf Eis oder einem Kühlblock zu kühlen. 7. Erstellen Sie ein PCR-Protokoll (PCR setup map) mit den Positionen für jedes Gefäß jeder Probe. 8. Für jede zu untersuchende Probe wird ein Beutel mit Primer beladenen PCR-Gefäßen benötigt, je Probe ein a-streifen (violett) und ein b-streifen (grün). Die Streifen werden so auf einen Kühlblock oder auf Eis gestellt, dass die a-gefäße jeder Probe oberhalb der b-gefäße und die Leergefäße (schwarzer Punkt) rechts sind. Die Gefäße sind dann folgendermaßen von links nach rechts angeordnet: HPA 1, 2, 3, 4, 5, 6, 15 und ein Leergefäß (das achte Gefäß). 9. Tabelle 1, Spalte B kann für die Herstellung einer Arbeitskonzentration von Taq-Polymerase (Endkonzentration 0,5 U/µl) in einem 0,6 ml oder 1,5 ml Mikrozentrifugengefäß benutzt werden. Verwenden Sie für die Verdünnungen DNA-freies Wasser. Verdünnte Taq-Polymerase sollte auf Eis oder einem Kühlblock verarbeitet werden. ThromboType Test IFUDE REV E

6 Verdünnung von Taq-Polymerase A # Patienten- Proben B Verdünnte Taq- Polymerase (Taq) 2.4 l Taq 21.6 l Wasser 24 l 4.4 l Taq 39.6 l Wasser 44 l 6.0 l Taq 54.0 l Wasser 60 l 8.0 l Taq 72.0 l Wasser 80 l 9.8 l Taq 88.2 l Wasser 98 l 11.5 l Taq l Wasser 115 l 13.5 l Taq l Wasser 135 l 15.0 l Taq l Wasser 150 l 10. Beschriften Sie jeweils ein Mikrozentrifugengefäß (0,6 oder 1,5 ml) für jede Probe und eines für die Negativkontrolle. Dies sind die Mastermix-Gefäße. 11. Der Mastermix wird gemäß Tabelle 2 für jede Probe angesetzt. Bei DNA-Konzentrationen zwischen 20 und 100 ng/µl kann auch die vereinfachte Methode nach Tabelle 3 verwendet werden. Alternativ kann auch ein eigenes Protokoll verwendet werden, sofern jeder PCR-Mix pro Ansatz folgende Bestandteile enthält: 12,5 µl 2-fach konzentrierte PCR Reagenz 0,5 U/µl Taq-Polymerase ng humane genomische DNA DNA-freies Wasser bis zu einem Endvolumen von 25 µl Verwenden Sie Tabelle 2 als Hilfe. Herstellung der Proben-Mastermixe 16 PCR Gefäße x 25 µl = 400 µl 400 µl DNA Volumen (a)=16 x 100 ng/gefäß DNA- Konz. (ng/µl) ng DNA-Konz. (ng/µl)= (a) µl Volumen Wasser Taq- Polymerase (0,5 U/µl) 2-fach konz. PCR-Reagenz Master-Mix Gesamtvolumen µl (a) + 16 µl µl = 400 µl *DNA Konzentrationensbereich liegt zwischen ng/µl Vereinfachte Herstellung der Proben-Mastermixe Volumen Wasser 2-fach konz. PCR- Reagenz Taq-Polymerase (0.5 U/µl) Proben-DNA Master-Mix Gesamtvolumen 152 μl 200 μl 16 μl 32 μl 400 μl ThromboType Test IFUDE REV E

7 12. Herstellung eines negativen Kontroll-Mastermix mit 25 µl 2-fach konzentrierter PCR-Reagenz, 2 µl verdünnter Taq-Polymerase und 23 µl DNA-freiem Wasser. 13. Alle Mastermix-Ansätze verschließen und diese jeweils für 3 5 Sekunden vortexen. 14. Entfernen und verwerfen Sie die Deckel von den PCR-Gefäßen. 15. Für jede Probe werden 25 µl des entsprechenden Mastermix-Ansatzes in jede der ersten 7 PCR-Gefäße des a-streifens (violett) und des b-streifens (grün) pipettiert. Das achte Gefäß bleibt leer µl des Mastermix der Negativkontrolle werden in eines der leeren Gefäße eines beliebigen PCR-Gefäßstreifens pipettiert. 17. Die PCR-Gefäße werden mit der dafür vorgesehenen Verschlussfolie verschlossen. 18. Der Folienverschluss muss auf Dichtigkeit überprüft werden. Luftblasen am Boden der PCR-Gefäße müssen entfernt werden. Die gesamte Flüssigkeit sollte sich am Gefäßboden befinden. Dazu können die Gefäße sanft auf den Tisch geklopft oder kurz in einer Mikroplattenzentrifuge mit Ausschwingrotor zentrifugiert werden. Es ist wichtig, dass sich keine Luftblasen am Boden der PCR-Gefäße befinden und keine Flüssigkeitsreste an den Gefäßwänden verbleiben. Nichtbeachtung kann zum Ausfall der Allel-spezifischen Amplifikationen führen. 19. Das ThromboType Test Programm am Thermocycler kann nun gestartet werden. Wenn die Blocktemperatur 70 C erreicht hat, schalten Sie auf Pause oder halten das Programm an. Die PCR-Gefäße können aus dem Eisbad oder vom Kühlblock in den Thermocycler überführt werden. Ein oder mehrere leere PCR-Gefäßstreifen sollten als Platzhalter an der gegenüberliegenden Seite des Heizblocks plaziert werden. 20. Setzen Sie eine Silikon-Andruckmatte über die Folienverschlüsse, so dass jedes PCR-Gefäß bedeckt wird. Der korrekte Sitz der Matte sollte sichergestellt sein, und es ist darauf zu achten, dass die Matte bei Schließen des Heizdeckels nicht verrutscht. Ein gleichmäßiger Druck auf die Verschlussfolie auf den PCR-Gefäßen ist wichtig, um den Luftabschluss während der Programmschritte mit hohen Temperaturen zu erhalten. Um dieses zu erreichen, sollten gesonderte PCR- Gefäße im Block derart um die Probengefäße positioniert werden, dass der Heizdeckel waagerecht aufliegt. Die Silikonmatte dient zur Erzeugung eines ausreichenden Anpressdrucks und zum Ausgleich feiner Höhenunterschiede zwischen den PCR-Gefäßen. 21. Das PCR-Programm kann nun weiterlaufen. Das Programm dauert ca. 55 Minuten. 22. Nach Erreichen des letzten Programmschritts (4 C) werden die PCR-Probengefäße entnommen und auf einen PCR- Gefäßständer gestellt. Wenn die Elektrophorese nicht direkt im Anschluss erfolgt, können die Gefäße bis zu 3 Tage bei 2-8 C im Kühlschrank oder bis zu 7 Tagen bei unter 20 C im Gefrierschrank gelagert werden. Nachweis Der Nachweis der PCR-Produkte muss an einem vom Prä-PCR-Bereich getrennten Arbeitsplatz erfolgen. Labormaterialien sollen zur Vermeidung von Probenverschleppungen nicht zwischen den Bereichen hin- und hergetauscht werden. 23. Der Arbeitsplatz sollte mit einer saugfähigen wasserundurchlässigen Unterlage vorbereitet werden. Stellen Sie die E-Base- Motherbase, deionisiertes Wasser, den 100 bp DNA-Leiterstandard und Pipetten bereit. 24. Gefrorene PCR-Proben vor Gebrauch auftauen. Die folgende Anleitung beschreibt die Detektion auf einem einzelnen E-Gel, welches für die Analyse von bis zu 3 Proben ausreicht. Wenn mehr als 3 Proben amplifiziert wurden, sind für die Detektion mehrere Elektrophoreseläufe erforderlich. 25. Nehmen Sie das E-Gel aus der Verpackung und entfernen Sie die Kämme. Wenn notwendig, kann die obere Fläche der Gelkassette mit einem feuchten Labortuch gereinigt werden. Beschriften Sie diesen Bereich mit dem Marker. 26. Schieben Sie das Gel unter die Elektroden der Elektophoreseeinheit (E-Base Motherbase) und drücken Sie es so nach unten, dass die beiden Elektroden Kontakt zum Gerät bekommen. 27. In jede Vertiefung, in die PCR-Produkte gegeben werden, 10 µl deionisiertes Wasser pipettieren (14 Vertiefungen pro Probe und eine Vertiefung für die Negativkontrolle). Kein Wasser in die 4 Vertiefungen am Rand geben (markiert mit M ). Diese sind für den 100 bp DNA-Leiterstandard reserviert. ThromboType Test IFUDE REV E

8 28. Durchstechen Sie für jede PCR-Probe die Verschlussfolie mit eine frischen Pipettenspitze. Pipettieren Sie 5 µl jedes PCR- Produkts in die entsprechende Vertiefung des Gels. Durchstechen Sie die Verschlussfolien erst dann, wenn das Produkt auf das Gel transferiert wird. Die Verwendung einer Mehrkanal-Mikropipette beschleunigt die Beladung des Gels und vermindert das Risiko von Pipettierfehlern. Pipettieren Sie von jeder Probe die a und b Amplifikationen in benachbarte Vertiefungen des Gels, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern. 29. Durchstechen Sie die Folie der Negativkontrolle und pipettieren Sie 5 µl der Negativkontrolle in die entsprechende Vertiefung. 30. Pipettieren Sie 15 µl des 100 bp DNA-Leiterstandard in die vier für den Leiterstandard reservierten äußeren Vertiefungen (markiert mit M ). Wenn nur eine einzelne Probe untersucht wird, ist es nicht notwendig, den 100 bp-standard in alle 4 Vertiefungen zu geben. Generell sollte jede Probe zusammen mit 100 bp-leiterstandards laufen, damit die Größe des Amplifikats richtig bestimmt werden kann. 31. Der Netzstecker der Elektrophoreseeinheit (Motherbase) kann nun eingesteckt werden.es leuchtet ein rotes Licht und die Zeitanzeige erscheint. Mit dem Power -Knopf (rechter Knopf) in den EG-Modus (anstatt EP-Modus) wechseln. 32. Mit dem linken Knopf wird die Zeituhr auf 17 Minuten eingestellt. Eine geeignete Auftrennung kann mit einer Laufzeit von 15 Minuten erreicht werden. Die Auftrennung wird jedoch mit einer Laufzeit von Minuten verbessert. Gele nicht länger als 20 Minuten laufen lassen. 33. Zum Start auf Power (rechter Knopf) drücken. Das rote Licht wechselt auf grün. 34. Am Ende der Elektrophorese ertönt ein Alarmton und das grüne Licht wechselt zu einem roten Blinklicht. Drücken Sie auf Power um den Lauf zu stoppen. Das rote Blinklicht wechselt zu einem roten Dauerlicht. Der Netzstecker kann nun gezogen und das Gel aus der Kammer entnommen werden. 35. Legen Sie das Gel auf den UV-Tisch (UV-Transilluminator), um die Produktbanden sichtbar zu machen. Das Gel sollte innerhalb von 20 Minuten beurteilt und dokumentiert werden. Wenn eine Dokumentation des Tests gewünscht wird, kann ein Foto mit Hilfe eines Geldokumentationssystems angefertigt werden. QUALITÄTSKONTROLLE Das interne Kontroll-Primerset erzeugt ein Produkt mit 85 bp, sofern amplifizierbare humane DNA in einer Menge von 40 ng oder mehr in die PCR-Reaktion gegeben wurde. Diese Bande sollte für jede PCR-Reaktion außer für die Negativkontrolle auf dem Gel erscheinen. Die Allel-spezifische Amplifikation und die interne PCR-Kontrolle konkurrieren miteinander; die internen Kontrollbanden können in Proben, die positiv für ein Allel sind, sehr schwach ausfallen oder sogar fehlen. Das Fehlen der internen Kontrollbanden bei Vorhandensein einer Allel-spezifischen Bande ist daher möglich und tolerabel. Sofern ein PCR-Ansatz jedoch DNA enthält und weder eine Kontrollbande noch eine Allel-spezifische Bande auf der Gelspur erkennbar ist, ist ein Ausfall der Amplifikation sehr wahrscheinlich. Ein Ausfall der PCR-Reaktion kann bedingt sein durch einen Verfall der Reagenzien, falsch programmierte Thermocycler, qualitativ schlecht aufgereinigte DNA, zu geringe DNA-Menge für die Reaktion oder durch fälschlich nicht pipettierte Reagenzien beim Ansatz der PCR-Reaktionen. Die Ergebnisse sind in diesen Fällen nicht verwertbar. Die Proben sollten vorzugsweise mit einer frisch isolierten DNA-Probe reanalysiert werden. Der 100bp DNA-Leiterstandard stellt einen unabhängigen Größenstandard für die PCR-Produktbanden dar. Er sollte bei jeder Elektrophorese mitgeführt werden. Die Banden des 100 bp-dna-leiters sollten scharf und gut voneinander getrennt erscheinen. Jeder Test, bei dem die Banden des Größenstandards zerlaufen oder komprimiert erscheinen, sollte wiederholt werden. Die Ergebnisse sollten nicht als Befund ausgegeben werden. Primer-Dimer-Banden können abhängig von der DNA-Probe oder vom verwendeten PCR-Gerät entstehen. Diese Banden mit einer Größe von weniger als 85 bp beeinträchtigen die Typisierung mit ThromboType Test nicht. Wenn Dimerbanden ein Problem darstellen, kann die Anpassung des PCR-Programms ihr Auftreten vermindern. Die Negativkontrolle (Wasser) sollte keine PCR-Produktbanden aufweisen, weder Allel-spezifische Banden noch interne Kontrollbanden. Das Auftreten von PCR-Banden in den Negativkontrollen spricht für technische Fehler oder kontaminierte Reagenzien. Wenn eine Kontrolle nicht wie erwartet ausfällt, sind die Ergebnisse nicht verwertbar und der Test sollte wiederholt werden. In diesem Fall können die Ergebnisse nicht als Befund ausgegeben werden. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Das Auftreten einer Allel-spezifischen Bande der richtigen Größe auf einer Gelspur zeigt ein positives Ergebnis für das betreffende Allel an. Nehmen Sie Bezug auf die unten aufgeführte Liste der allell-spezifischen PCR-Produktgrößen und auf die Liste der beobachteten PCR-Artefakte für den ThromboType Test. Das Fehlen der Allel-spezifischen PCR-Produktbande zeigt das Fehlen des Allels in der DNA-Probe an (negatives Ergebnis), wenn die interne Kontrollbande als Hinweis für eine erfolgreiche ThromboType Test IFUDE REV E

9 Amplifikationsreaktion vorhanden ist. Ist in einer PCR-Reaktion weder eine Kontrollbande noch eine Allel-spezifische Bande sichtbar, so spricht dies für einen Ausfall der Amplifikationsreaktion. Die Probe muss erneut auf das Vorhandensein des betreffenden Allels getestet werden. Produkt PCR-Produktgröße (bp) HPA HPA HPA HPA HPA HPA HPA-15 (Gov) 117 Kontrolle 85 Beachten Sie, dass für alle HPA-Systeme die Amplifikationen für eine bestimmte Probe für die a- und b-allele in etwa die gleiche Menge an PCR-Produkt erzeugen, sofern die Allele vorhanden sind. Heterozygote Proben sollten a- und b-pcr-produkte von annähernd gleicher Intensität ergeben für alle sieben HPA-Systeme, typisiert in diesem Test. Eine Probe, in der ein Allel-spezifisches Produkt wesentlich schwächer erscheint als das andere im gleichen HPA-System, ist möglicherweise nicht heterozygot. Stattdessen ist die schwache Bande möglicherweise auf einen technischen Fehler oder auf unspezifische Amplifikation zurückzuführen ( readthrough der Polymerase). Beim read-through kommt es zur schwachen Amplifikation durch Allel-spezifische Primer von einer DNA, die das betreffende Allel nicht trägt. Diese Proben sollten mit einer geringeren Menge von Proben DNA nachuntersucht werden. Tritt die Bande in der Wiederholung in ähnlicher Intensität wie die alternierende Allele auf, ist es ein positives Ergebnis für die fragliche Reaktion und die Probe sollte positiv für die Allele typisiert werden als echt heterozygot. Dieses Ergebnis weist auf einen technische Fehler als Ursache für das Entstehen der schwachen Bande im Originalansatz hin. Tritt die schwache Bande in der Wiederholung erneut auf, spricht dieses für einen echten read-through oder ein falsch positives Ergebnis; die Probe sollte als negativ für das betreffende Allel eingestuft werden. LIMITATIONS Einschränkungen ThromboType Test enthält Materialien für die Vervielfältigung genomischer DNA-Sequenzen mittels Polymerasekettenreaktion und die nachfolgende Detektion HPA 1-6 und 15 (Gov)- allel-spezifischer Sequenzen mittels Agarosegelelektrophorese. Unbekannte Varianten in den relevanten Gensequenzen können die Ergebnisse ungünstig beeinflussen. Um optimale Ergebnisse des ThromboType Tests sicherzustellen, sollten die DNA-Proben eine Konzentration zwischen 10 ng/µl und 200 ng/µl mit einem 260 nm/280nm Verhältnis von 1,60 1,90 aufweisen. Schlechte PCR-Resultate können durch funktionell geschädigte DNA oder durch DNA von geringem Reinheitsgrad entstehen. Falsch negative Resultate können durch ungeeignete Behandlung von Proben, durch Fehler bei der Durchführung des Tests, durch PCR-Inhibitoren oder ungeeignete genomische Proben-DNA entstehen. Kontaminationen durch verschleppte Nukleinsäuren, Überladung der Reaktionsansätze mit genomischer DNA oder von den Vorgaben abweichende Temperaturen im PCR-Protokoll können Gründe für falsch positive Ergebnisse sein. Für die Entwicklung dieses Tests wurde die DNA erwachsener Personen eingesetzt. Der Test wurde nicht für die Verwendung pränataler Proben validiert. Dieser Test liefert gute Ergebnisse mit den PCR-Geräten ABI PE9700, 9600 und 2720 und mit dem MJ-Research (jetzt Bio-Rad) PTC-200 und dem Eppendorf Mastercycler und Eppendorf Mastercyler EP. Die Verwendung anderer PCR-Geräte kann Anpassungen der oben genannten PCR-Parameter erforderlich machen. Thermocycler sollten entsprechend den Anweisungen des Herstellers kalibriert und gewartet werden. SPEZIFISCHE CHARAKTERISTIKA DES TESTS Genauigkeit der Ergebnisse Die Genauigkeit des ThromboType Test wurde in zwei Vergleichsstudien beurteilt: Vergleich von ThromboType Test und einem DNA-basierten molekularbiologischen Typisierungstest: 36 Proben mit einem weiten Spektrum vorhandener HPA-Allelen wurden mittels ThromboType Test für HPA-1a/b, HPA-2a/b, HPA- 3a/b, HPA-4a/b, HPA-5a/b, HPA-6a/b und HPA-15a/b typisiert. Die Proben wurden zusätzlich mit einer anderen PCR-basierten Methode im Rahmen einer unabhängigen externen Untersuchung getestet. Es wurden vierzehn Ergebnisse für jede Probe dokumentiert (insgesamt 504 Ergebnisse). Eine einzelne seltene Probe wurde nur im HPA-6a/b System typisiert. Die Auswertung der insgesamt 506 Ergebnisse zeigte eine 99,8%-ige Übereinstimmung der Ergebnisse des ThromboType Test und der Vergleichsmethode. Vergleich von ThromboType Test und DNA-Sequenzierung: Im ThromboType Test wurden 46 Proben mit einem breiten Spektrum vorhandener HPA-Allelen untersucht. Zudem wurde die DNA- Sequenzierungen zur Ermittlung der HPA-1a/b, HPA-2a/b, HPA-3a/b, HPA-4a/b, HPA-5a/b, HPA-6a/b und HPA-15a/b Genotypen der Proben durchgeführt. Die Ergebnisse des ThromboType Test zeigten eine 100%-ige Übereinstimmung mit den Ergebnissen der DNA- Sequenzierung. ThromboType Test IFUDE REV E

10 Testpräzision Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse des ThromboType Test wurde mit 3 Proben ermittelt. Diese drei Proben, representativ für das Spektrum von Allelen, wurden in Doppelbestimmung an neun verschiedenen Tagen getestet. Die Ergebnisse zeigten eine 100%-ige Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der Doppelbestimmungen und den Ergebnissen an den verschiedenen Tagen. Beobachtete PCR-Artefakte 1. HPA-3 Reaktionsmixe (entweder 3a oder 3b) können ein Geschmier von unspezifischen DNA-Fragmenten generieren. Dieses Geschmier liegt in der Größenordung von 300bp und größer. Wenn es in einem Gefäß, das eine schwach positive Allelspezifische Bande generiert hat, auftaucht, wächst das Geschmier über die Allel-spezifische Bande hinaus. Gelegentlich erscheint eine diffuse Bande > 500 bp anstelle des Geschmier oder diese Bande liegt innerhalb des Geschmier. Diese Artefakte haben keinerlei Einfluss auf die An- bzw. Abwesenheit der Allel-spezifischen PCR-Banden und damit keinen Einfluss auf die Typisierung. 2. Die HPA-3 Reaktionsmixe können ein schwaches PCR-Artefakt von 165 bp Größe generieren. Diese erscheint häufig in Verbindung mit dem Geschmier von Allel-negativen Amplifikationen wie in Punkt 1 beschrieben. 3. HPA-5 Reaktionsmixe können eine doppelte anstelle einer einfachen Bande in einer Allel-positiven Probe generieren. Dieses wurde bei 5a und b beobachtet. Es hat aber keinen Einfluss auf die Typisierung. Eine Allel-negative Probe produziert keine Doppelbanden. 4. Primer Dimere und überschüssige, nicht gebundene Primer sind häufig zu erkennen. Sie erscheinen als Banden mit kleinem Molekulargewicht, kleiner als das 85bp Produkt der internen Kontrolle und sollten ignoriert werden. 5. Readthrough Banden schwache Allel-spezifische Banden von Amplifikationen einer Allel-negativen Probe lassen sich bei hohen DNA Loadings beobachten. BIBLIOGRAFIE 1. Williamson LM, et. al.; The Natural History of Fetomaternal Alloimmunization to the Platelet-specific Antigen HPA-1a (PL A1, Zw a ) as Determined by Antenatal Screening ; Blood 1998, vol. 92: Davornen A, et. al.; Human Platelet Antigen-specific Alloantibodies Implicated in 1162 Cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia ; Transfusion 2004, vol 44: Newman PJ, et. al.; J Clin Invest 1989; vol. 83(5): Kuijpers JW, et. al.; J Clin Invest 1992; vol. 89(2): Lyman S, et. al.; Blood 1990; vol. 75(12): Wang R, et. al.; J Clin Invest 1992; vol. 90(5): Santoso S, et. al.; J Clin Invest 1993; vol. 92(5): Wang R, et. al.; Blood 1993; vol. 82(11): Schuh AC, et. al.; Blood 2002; vol. 99(5): Skogen B, et. al.; Transfusion 1994; vol. 34: Immucor GTI Diagnostics, Inc Crossroads Circle Waukesha, WI USA EC REP Immucor Medizinische Diagnostik GmbH Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark Germany US and International Contact Information: Technical Support : waukeshatechsupport@immucor.com E-Gel ist ein Markenzeichen von Life Technologies Cooperation Immucor GTI Diagnostics, Inc IFUDE Rev E ThromboType Test IFUDE REV E