Elektrophorese - eine Einführung

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1 Elektrophorese - eine Einführung Zusammenfassung Die Elektrophorese ist eine Technik, bei der Gemische von Stoffen oder Teilchen aufgetrennt werden, weil sie in einem elektrischen Feld verschieden schnell wandern. Die wichtigste Anwendung in der Medizin ist die elektrophoretische Untersuchung der Eiweißstoffe der Blutflüssigkeit. (Serumeiweiß-Elektrophorese). Durch sie erkennt man Vermehrungen oder Verminderungen bestimmter Eiweißstoffe (Dysproteinämien). Werden von entarteten Zellen Eiweißstoffe produziert, kann man auch dies in der Elektrophorese erkennen (Paraproteinämie). Die Ergebnisse der Serumeiweiß- Elektrophorese lassen daher Rückschlüsse auf verschiedene Krankheitszustände zu. 1. Einleitung Namen Elektrophorese: Der Wortteil -phor kommt aus dem Griechischen und bedeutet "tragen". Der Wortteil Elektro- rührt daher, dass die Methode durch Anlegen einer elektrischen Spannung, also dem Aufbau eines elektrischen Feldes, funktioniert. Serumeiweiß (=Serumprotein): das im Serum ("Blutflüssigkeit") enthaltene Eiweiß. Serum gewinnt man, indem man Blut gerinnen lässt und zentrifugiert. Serumeiweiß-Elektrophorese (=Serumprotein-Elektrophorese): Auftrennung der Eiweißstoffe des Serums mittels Elektrophorese. Was ist die Elektrophorese? Die Elektrophorese ist eine Labortechnik, bei der Gemische von Stoffen oder Teilchen aufgetrennt werden, weil sie in einem elektrischen Feld verschieden schnell wandern. Die Auftrennung bietet Informationen über die Zusammensetzung von Stoffgemischen, dient also ihrer Analyse (analytische Elektrophorese). Viel seltener wird die Elektrophorese eingesetzt, um bestimmte Substanzen aus Stoffgemischen zu gewinnen (präparative Elektrophorese). Welche medizinischen Anwendungen gibt es? Prinzipiell gibt es sehr viele Anwendungen. Zu den elektrophoretischen Techniken gehören z.b. Untersuchungen unserer Erbsubstanz (Southern-Blotting), Analysen des roten Blutfarbstoffs (Hämoglobin-Elektrophorese), die Auftrennung der "Fette" des Blutes (Lipoprotein-Elektrophorese) und viele mehr. In der Praxis werden diese Untersuchungen aber selten durchgeführt. Die in der Routinediagnostik bei weitem wichtigste Anwendung der Elektrophorese ist die Untersuchung der Eiweißstoffe der Blutflüssigkeit, die Serumeiweiß-Elektrophorese. Wozu dient die Serumeiweiß-Elektrophorese? Erkennung und Beobachtung des Verlaufs von "abnormen"* Proteinen

2 (Paraproteinen) Bei verschiedenen bösartigen Erkrankungen des Blutes oder der Lymphknoten, aber auch bei Vorstufen dieser Erkrankungen können "abnorme"* Eiweißstoffe, genauer gesagt Antikörper, im Blut vorkommen. Man nennt diese Eiweißstoffe Paraproteine. Wenn sie im Blut auftreten, spricht man von Paraproteinämie oder auch von monoklonaler Gammopathie. *Die Bezeichnung Paraprotein, also abnormes Protein, ist eigentlich nicht zutreffend, da es sich hierbei meist um ganz normale Antikörper handelt. Abnorm ist viel mehr die Tatsache, dass da ein bestimmter Antikörper von einem bestimmten B- oder Plasmazellklon unreguliert produziert wird und daher vermehrt ist. Erkennung und Beobachtung von Eiweißverlusten Eiweiß kann z.b. über die Niere, über den Darmtrakt oder über die Haut verloren gehen. Das Muster der im Blut verbleibenden Eiweißstoffe, kann Hinweise auf die Ursache des Eiweißverlusts liefern. Erkennung und Beobachtung von Entzündungen Akute (=plötzliche, kurz dauernde) und chronische (=lang dauernde Entzündungen) zeigen bestimmte Muster in der Serumeiweiß-Elektrophorese. Abklärung auffälliger Laborbefunde Ist das Gesamteiweiß im Serum zu hoch oder zu niedrig, kann die Elektrophorese zeigen, welche Eiweißgruppe daran schuld ist. Auch bei einer erhöhten Blutsenkung oder dem Auftreten von Eiweiß im Harn kann die Serumeiweiß- Elektrophorese die Ursache abklären helfen. Geschichte Die Elektrophorese ist bereits seit den dreißiger Jahren des vorigen Jahrhunderts bekannt. Der Schwede Arne Tiselius hat sie eingeführt. Sie ist daher auch als Tiselius- System bekannt. Tiselius wurde dafür 1948 mit dem Chemie-Nobelpreis ausgezeichnet. 2. Das Prinzip Verschiedene Stoffe wandern im elektrischen Feld verschieden schnell. Das ist die Grundlage der Auftrennung von Stoffen bei der Elektrophorese. Allgemeines Im elektrischen Feld wandern bewegliche, elektrisch geladene Teilchen zum entgegengesetzt geladenen Pol. Positiv-geladene Teilchen (Kationen) wandern zum Minus-Pol (Kathode), negativ-geladene Teilchen (Anionen) wandern zum Plus-Pol (Anode). Aber verschiedene Teilchen wandern verschieden schnell. Und es sind besonders zwei Eigenschaften eines Teilchens, die seine Wanderungsgeschwindigkeit bestimmen: Je größer die Ladung, desto schneller ist die Wanderung Je stärker ein Teilchen bzw. ein Stoff geladen ist, desto schneller wandert er in der Elektrophorese.

3 Die Ladung Stoffe mit größerer negativer Ladung wandern schneller zum Plus-Pol als die schwächer geladenen: Am Ende der Elektrophorese sind die stärker geladenen Teilchen weiter gewandert. Je kleiner das Teilchen, desto schneller ist die Wanderung Die Größe eines Teilchens bzw. eines Stoffes ist der zweite entscheidende Faktor für die Geschwindigkeit der Wanderung in der Elektrophorese. Kleinere Teilchen wandern schneller als größere. Neben der Größe spielt auch die Form eine gewisse Rolle. Die Größe Kleinere Teilchen wandern schneller als größere: Am Ende der Elektrophorese ist das kleinere Teilchen weiter gewandert. Völlig verschiedene Stoffe können in der Elektrophorese gleich schnell wandern: Da sowohl die Ladung als auch die Größe eines Stoffes Einfluss auf die Wanderungsgeschwindigkeit haben, kann man bei zwei gleich schnell wandernden Stoffen nicht sicher sagen kann, ob sie einander sehr ähnlich sind, oder ob sie sich in Sachen Größe und Ladung stark aber gegenläufig unterscheiden. So kann z.b ein großer stark geladener Stoff genauso schnell wandern wie ein kleiner schwächer geladener.

4 Idente Wanderung unterschiedlicher Stoffe Das obere Teilchen ist zwar kleiner, dafür ist das untere stärker geladen: beide wandern gleich schnell. Prinzip der Serumeiweiß-Elektrophorese (=Serumprotein Elektrophorese) Bei der Serumeiweiß-Elektrophorese versucht man, die verschiedenen Eiweißstoffe (Proteine) der Blutflüssigkeit durch ein elektrisches Feld aufzutrennen. Die Proteine müssen dazu elektrisch geladen sein Damit eine Auftrennung funktioniert, muss man dafür sorgen, dass alle Proteine im geladenen Zustand vorliegen. Das ist nicht selbstverständlich. In einer wässrigen Lösung können Proteine nämlich positiv, negativ oder gar nicht geladen sein. Das hängt davon ab, wie der ph-wert der Lösung ist, d.h. wie viele H-Ionen in der Lösung sind, oder noch anders ausgedrückt, wie stark sauer oder basisch die Lösung ist. H-Ionen sind positiv geladene Teilchen, sie stellen den Säuregehalt einer Flüssigkeit dar. Ungeladenes Protein Dieser Eiweißstoff ist in der Summe ungeladen. Er hat zwar zwei negativ geladene Gruppen (COO - ), aber durch Anlagerung von 2 positiven H-Ionen besitzt er auch zwei positiv geladene Gruppen (NH3 + ). Dies ist für die Elektrophorese ungünstig, weil das Protein so nicht wandern würde. Negativ geladenes Protein Bringt man das oben abgebildete Protein in eine Lösung, in der H-Ionen knapper sind (= der ph höher ist), dann gibt das Protein seine H-Ionen ab und wird in Summe negativ geladen (unteres Bild). Es würde in der Elektrophorese zum Plus-Pol wandern.

5 Der ph der Lösung muss im alkalischen Bereich liegen Die obigen Bilder verdeutlichen, was man tun kann, damit eine Elektrophorese von Proteinen gelingt: man sorgt dafür, dass die Lösung, in der die Proteine gelöst sind und in der sie wandern sollen, relativ knapp an H-Ionen ist. Chemisch ausgedrückt: die Lösung muss einen alkalischen ph-wert aufweisen. Dann verlieren die Proteine ihre H- Ionen, sind daher negativ geladen und wandern in der Elektrophorese einheitlich zum Plus-Pol. Das in alkalischer Lösung negativ geladene Protein wandert unter dem Einfluss des elektrischen Feldes zum Plus-Pol. Der Elektrophorese-Puffer Die Trennung von Proteinen wird bei der Elektrophorese also in einer Lösung (Flüssigkeit) durchgeführt, die einen alkalischen ph haben muss. Und dieser ph darf sich während der Elektrophorese auch nicht ändern. In der Chemie nennt man Lösungen, die einen bestimmten ph besitzen, und anderen Einflüssen zum Trotz auch beibehalten also "puffern" können, Puffer. Daher bezeichnet man die Flüssigkeit, in der die Wanderung bei der Elektrophorese abläuft, auch meist als Puffer. Die Trennung der Proteine Hat man erreicht, dass die Proteine im elektrischen Feld wandern, dann werden sie auch automatisch getrennt, weil sie ja unterschiedlich schnell wandern. Das Serum wird in der Nähe des Minus-Pols aufgetragen. Spannung wird angelegt. Die verschiedenen Proteine wandern unterschiedlich schnell. Nach Ende der Elektrophorese sind verschiedene Proteingruppen voneinander getrennt. Die Abbildung ist nur ein vereinfachtes Schema. Sie verdeutlicht aber, dass die verschiedenen, nach der Elektrophorese sichtbaren Proteingruppen aus unterschiedlichen Proteinen bestehen. Anders ausgedrückt, man trennt mit der Serumeiweiß-Elektrophorese die Vielzahl der Proteine des Serums in wenige, meist 5 bis 7 Gruppen auf. 3. Die freie Elektrophorese

6 Die sog. freie oder auch trägerfreie Elektrophorese (Flüssigkeiten ohne Trägermaterial) hat für die Labormedizin nur mehr historische Bedeutung. Die ersten von Tiselius eingeführten Elektrophorese-Apparate gehörten zur Gruppe der freien Elektrophoresen. Die freie Elektrophorese nach Tiselius Bei der freien Elektrophorese wird Serum in ein gläsernes U-Rohr gegeben und auf beiden Seiten mit Puffer überschichtet. Elektroden werden in die U-Rohrschenkel eingebracht und Spannung angelegt. Aus dem Serum wandern jetzt die Proteine ihrer Ladung entsprechend in den Puffer hinein. Diese Wanderung lässt sich mit einem durch das Glasrohr durchtretenden Lichtstrahl beobachten (Proteine verändern die Lichtbrechung). 4. Die Träger-Elektrophorese Die freie Elektrophorese war aufwändig und zeigte verschiedene Nachteile. Schon bald versuchte man daher, geeignetere Methoden zu finden. Man begann, die Trennung der Proteine nicht in der freien Pufferflüssigkeit durchzuführen, sondern man tränkte ein Trägermaterial mit dem Puffer und führte die Trennung auf diesem Trägermaterial durch. Zu Beginn verwendete man dafür Papier (Papier-Elektrophorese). Papier hat aber für die Eiweißtrennung einige ungünstige Eigenschaften und man entwickelte daher spezielle Trägermaterialien, die diese Nachteile nicht oder geringer aufwiesen. In der Routine durchgesetzt haben sich vor allem zwei Materialien: Cellulose-Azetat (Cellulose-Azetat-Elektrophorese, CAE) Agarose-Gel (Agarose-Gel-Elektrophorese, AGE) 4a. Die Cellulose-Azetat-Folien-Elektrophorese (CAE) Bei der CAE erfolgt die Auftrennung der Proteine auf einer Cellulose-Azetat-Folie. Cellulose-Azetat-Folien sind weiße, im trockenen Zustand spröd-brüchige, etwa papierdicke Folien.

7 Streifen einer Cellulose-Azetat- Folie (weiß, man sieht hier nichts!) Elektronenmikroskopische Detail- Aufnahme Die Abbildung zeigt das grobe Geflecht der Zellulose und die relativ großen Zwischenräume. Diese sind weit größer als die Proteine und lassen diese daher praktisch ungehindert durchwandern. Durchführung der CA-Elektrophorese Ein Puffer-getränkter Zellulose-Azetat-Träger wird so in den Elektrophorese- Apparat eingelegt, dass beide Enden der Folie in den Puffer eintauchen. Die Probe wird mit einem Auftragsstempel auf die Folie aufgetragen. Allerdings nicht in der Mitte der Folie sondern versetzt Richtung Minus-Pol (Kathode), weil die Proteine ja in Richtung Plus-Pol (Anode) wandern werden. Die beiden Pole (Kathode und Anode) des Elektrophorese-Apparates tauchen ebenfalls in den Puffer ein. Der Elektrophorese-Apparat wird dann an das Netzgerät (d.h. den Strom) angeschlossen. Typische Trennungsbedingungen (können von Gerät zu Gerät variieren): Die Auftrennung der Proteine erfolgt bei einer konstanten Spannung von V. Die Laufzeit beträgt ca. 20 Minuten. Die Pufferlösung hat einen ph-wert von 8.2 bis 8.6, ist also im alkalischen Bereich.

8 Färbung der Proteine Nach der Auftrennung wird die Cellulose-Azetat-Folie aus dem Elektrophorese-Apparat genommen und mit einem Proteinfarbstoff (z.b. Ponceau-Rot) gefärbt. Danach wird der nicht an Protein gebundene, überschüssige Farbstoff in sog. Entfärbebädern ausgewaschen. Jetzt zeigt sich die unterschiedliche Anfärbung der einzelnen, aufgetrennten Proteine. Man erkennt verschiedene Proteingruppen. So sieht eine gefärbte Serumeiweiß- Elektrophorese auf Cellulose- Azetat aus. Rechts die Proteine, die am schnellsten und daher am weitesten gewandert sind. Für die weitere Besprechung drehen wir die Folie um. Dies hat einen einzigen Grund: diese Darstellung hat sich eingebürgert. Auf den ersten Blick erkennt man verschiedene Gruppen von Proteinen, man spricht auch von Protein-Fraktionen. Abtrennung der wichtigsten Protein-Fraktionen Die größte Fraktion (links) ist das Albumin. Den anderen, die zur Proteingruppe der Globuline gehören, gab man der Reihenfolge nach griechische Buchstaben. Man spricht daher vom Alpha-1-Globulin, Alpha-2-Globulin, Beta-Globulin und Gamma-Globulin.

9 Bestimmung des Anteils der einzelnen Fraktionen Da die Vermehrung oder Verminderung der einzelnen Fraktionen von medizinischer Bedeutung sein kann, ist es notwendig, den Anteil der einzelnen Fraktionen zu bestimmen, das heißt, die einzelnen Fraktionen zu quantifizieren. Dazu gibt es verschiedene Verfahren. Meist wird die Folie, nachdem sie durch spezielle Chemikalien transparent (durchsichtig) gemacht wurde, in einer Art Photometer abgetastet. Dadurch entsteht aus der verschieden stark gefärbten Folie eine Kurve. Mit Computern ist es dann kein Problem, die Fläche unter der Kurve für die einzelnen Fraktionen zu berechnen und damit ihren Anteil zu bestimmen. Die Elektrophoresekurve Durch Abtasten der transparent gemachten Folie in einem Photometer oder einem Scanner entsteht aus den Unterschieden der Färbeintensität in der Folie eine Kurve - die Elektrophoresekurve. Früher wurde die Fläche unter der Kurve mit Millimeterpapier bestimmt, heute übernehmen das Computer. Die Ergebnisse werden zuerst einmal als Anteil am Gesamtprotein angegeben. Beta-Globulin 10 % hieße z.b., dass die Beta-Globulin Fraktion 10 % des Gesamtproteins ausmacht. Kennt man die Konzentration des Gesamtproteins im Blut (z.b. 60 g/l) kann man auch die absolute Konzentration der Beta-Globulin- Fraktion berechnen (das ergäbe 6 g/l) Viele Proteine bilden eine Fraktion Wie bei der Prinzipdarstellung schon kurz erwähnt, muss man sich bewusst sein, dass die Fraktionen keine einzelnen Proteine sind, sondern dass in einer Gruppe viele verschiedene Proteine enthalten sind. Anfangs wusste man nicht, welche Proteine sich in einer Fraktion befinden, ja man kannte diese Proteine zum Teil noch gar nicht. Heute kennt man die wichtigsten Proteine, die die einzelnen Fraktionen bilden. Welche Eiweißstoffe befinden sich in den einzelnen Fraktionen? Im Serum findet sich eine enorme Zahl zu gutem Teil noch unbekannter Proteine, sodass in jeder Fraktion der Elektrophorese hunderte, ja vielleicht tausende Eiweißstoffe enthalten sind. Die meisten liegen aber in so geringer Konzentration vor, dass sie zum Entstehen der Elektrophoresekurve praktisch nichts beitragen. Die Hauptbestandteile der jeweiligen Fraktionen kennt man heute und viele dieser Proteine tragen in ihrem Namen den Buchstaben derjenigen Fraktion, in der man sie gefunden hat.

10 Albuminfraktion: Wie der Name sagt, dominiert in der Albuminfraktion das o Albumin, das den größten Teil des Eiweißes im Serum ausmacht Alpha-1-Fraktion (Alpha-1-Globulin): o alpha-1-lipoprotein (HDL) o alpha-1-glykoprotein (=Orosomukoid) o alpha-1-antitrypsin Alpha-2-Fraktion (Alpha-2-Globulin): o Alpha-2-Makroglobulin o Coeruloplasmin o Haptoglobin Alpha-2-Fraktion bzw. Übergang von Alpha-2 zu Beta: o prä-beta-lipoprotein (VLDL/Triglyzeride) Beta-Fraktion (Beta-Globulin): o Hämopexin o Transferrin o Beta-Lipoprotein (LDL) o Komplement Am Übergang von Beta zu Gamma: o Antikörper der Klasse IgA o Fibrinogen (nur bei der Plasmaeiweiß-Elektrophorese) Gamma-Fraktion (Gamma-Globuline): o Antikörper der Klasse IgG und IgM Anmerkungen: Die beschriebene Auftrennung und das Vorkommen der Proteine in bestimmten Fraktionen ist nicht für alle Elektrophorese-Methoden gleich. Bei Vermehrungen einzelner Proteine können zusätzliche Gipfel in der Elektrophoresekurve vorkommen. Das können harmlose Veränderungen sein. So können Medikamente oder erbliche Besonderheiten können zu einem geteilten Albumingipfel führen. Auch ein erhöhtes Cholesterin kann die Elektrophorese verändern. Zusätzliche Gipfel können aber auch durch eine abnorme Vermehrung von Antikörpern verursacht sein, die von entarteten weißen Blutkörperchen produziert werden (MGUS, Lymphom, Plasmozytom). 4b. Die Agarose-Gel-Elektrophorese (AGE) Eine andere Art von Trägermaterial ist das sog. Agarose-Gel. Man darf sich unter dem Gel keinen Creme-artigen Stoff vorstellen. Gele ähneln in ihrer Beschaffenheit eher einem Gelee ("Tortenguss"). Gele für die Elektrophorese kann man zwar selbst herstellen, im Routinelabor greift man aber meist auf fertige, Puffer-getränkte Gele zurück. Aufgrund des Aufbaus des Gels bildet sich ein großporiges Maschenwerk, das Proteine praktisch ungehindert durchwandern können. Die Wanderung der Proteine führt daher nur zu minimalen Bandenverzerrungen, was eine hohe Trennschärfe ermöglicht.

11 Agarose-Gel Das durchsichtige und daher kaum sichtbare Gel befindet auf einer Kunststoffunterlage die sich wieder in einer Kunststoffschablone befindet. Das Gel enthält bereits die Pufferlösung. Es muss vor der Verwendung luftdicht verschlossen bleiben, sonst würde es austrocknen. Die Durchführung ist vergleichbar mit dem Prinzip der oben beschriebenen Cellulose- Azetat-Folien-Elektrophorese. Agarose-Gel im Automaten Hier liegt das Agarose-Gel bereits im Elektrophorese- Automaten. Die stabförmigen Elektroden liegen dem Gel auf beiden Seiten auf. Über sie wird der Strom zugeführt. Auf diesem Gel können gleichzeitig bis zu 60Serumei-weiß- Elektro-phoresen durchgeführt werden.

12 Auftragen der Proben Mit kammartigen Stempeln, die vorher in die Serumproben getaucht werden, werden bis zu 60 Serumproben gleichzeitig automatisch auf das Gel aufgetragen. Nach dem Auftragen der Proben kann die Spannung angelegt werden und die Elektrophorese beginnt. Nach Ende der elektrophoretischen Auftrennung wird das Protein auf der Agarose-Gel-Folie in Färbebädern fixiert und gefärbt. Anschließend wird der überschüssige Farbstoff in Entfärbebädern entfernt. Das Resultat ist eine transparente Folie, auf der die Proteine blau gefärbt sind. Hier sind die Ergebnisse der Agarose-Gel Serumeiweiß-Elektrophorese von 20 Proben dargestellt. Betrachtet man eine Spur näher, dann sieht man, dass die Ergebnisse sehr ähnlich denen der Cellulose-Azetat-Folien-Elektrophorese sind. Agarose-Gel- Elektrophorese Auch hier wandert Albumin (ganz rechts) am schnellsten und es zeigen sich 5 deutliche Fraktionen. Da die Folie bereits transparent ist, erspart man sich das Transparentmachen und kann die Folie gleich in einem Computer-Scanner oder einem Photometer auswerten. Es

13 entsteht dann eine Elektrophoresekurve, wie schon weiter oben bei der Cellulose-Azetat- Elektrophorese beschrieben. Agarose-Gel-Elektrophoresen sind auch gut geeignet für spezielle Anwendungen wie die z.b. Auftrennung von Lipoproteinen oder DNA. 5. Der elektro-osmotische Fluss (EOF) Um die Verständlichkeit zu verbessern, wurde bei der bisherigen Betrachtung der Elektrophorese auf die theoretisch-physikalischen Grundlagen kaum eingegangen. Viele Details würden für eine Übersicht auch zu weit führen und sind für ein Verständnis der Elektrophorese entbehrlich. Ein Phänomen der Elektrophorese ist aber zum Verständnis moderner Elektrophorese- Techniken wichtig und das ist der sog elektro-osmotische Fluss (EOF). Andere Bezeichnungen sind Elektro-Endosmose oder auch nur Endosmose. Was ist der EOF? Der EOF ist ein Effekt, der bei der Träger-Elektrophorese auftritt. Es ist ein Fluss von positiv geladenen Teilchen (Kationen) in Richtung Minus-Pol (Kathode). Diese Teilchen nehmen dann auch Wasser mit. Es entsteht daher ein Fluss, eine Strömung, in Richtung Minus-Pol. Warum entsteht der EOF? Dass positiv geladene Teilchen zum Minus-Pol wandern, ist keine Überraschung. Aber warum entstehen in einer elektrisch neutralen Pufferlösung überhaupt Anhäufungen von positiv geladenen Teilchen? Das hat mit dem Trägermaterial zu tun. Verschiedene Trägermaterialien binden negative Teilchen (Anionen) aus dem Puffer. Diese negativen Ladungen sind dann am Trägermaterial fixiert. In dem Puffer entstehen daraufhin Wolken überschüssiger positiver Ladungen. Die sind aber nicht fixiert. Und wenn man im Rahmen der Elektrophorese Spannung anlegt, wandern diese positiven Ladungen natürlich zum Minus-Pol. Dabei nehmen sie Wasser mit. Der elektro-osmotische Fluss entsteht. Der Fluss ist der Wanderung der Proteine entgegengesetzt Die in dem alkalischen Puffer negativ geladenen Proteine wandern zum Plus-Pol, der EOF aber zum Minus-Pol. Der elektro-osmotische Fluss (EOF) Durch eine Wechselwirkung zwischen Puffer und Oberfläche des Trägermaterials (z.b. Agarose) sind im Puffer Wolken von frei beweglichen positiven Ladungen. Diese bewegen sich beim Anlegen der Spannung in Richtung Minus-Pol.

14 Die positiven Teilchen im Puffer verursachen einen Fluss in Richtung Minus-Pol, den EOF 1. Beginn einer Protein- Elektrophorese. Die Probe wurde aufgetragen. Die Proteine wandern gegen den EOF in Richtung Plus- Pol. Zumindest wollen sie Richtung Plus-Pol wandern. Anmerkung: in dem Schema sind nur einige Eiweißstoffe als Beispiele dargestellt. 2. Ende der Protein- Elektrophorese Durch die Wirkung des EOF sind die am schwächsten Richtung Plus-Pol wandernden Proteine (grüne Kugeln) nicht in Richtung Plussondern in Richtung Minuspol verschoben.

15 Dies passiert auch in der Realität: die Gammaglobuline werden bei der Elektrophorese auf Agarose-Gel durch den EOF Richtung Minus- Pol getragen. Der EOF erhöht die Leistungsfähigkeit der Elektrophorese Man könnte meinen, der EOF sei ein Störfaktor bei der Elektrophorese. Außer bei speziellen Anwendungen trifft dies aber nicht zu. In den meisten Fällen und auch bei der Agarose-Gel-Elektrophorese von Proteinen führt der EOF zu einer besseren Auftrennung der einzelnen Stoffe. Vielleicht wird das durch einen Vergleich aus dem Schwimmsport verständlicher: Möchten sie auf einer nur 5 Meter langen Bahn herausfinden, wer von zwei Schwimmern der schnellere ist, wird das sehr schwierig. Zufällige Einflüsse können sehr leicht das Ergebnis verfälschen. Haben sie aber eine Gegenstromanlage, wird sich auch auf einer nur 5 Meter langen Strecke der bessere Schwimmer vom schlechteren unterscheiden. 6. Die Kapillar-Elektrophorese Die neueste Variante der Elektrophorese ist die Kapillar-Elektrophorese, auch Kapillar- Zonen-Elektrophorese (KZE) genannt. Wie der Name andeutet, findet dabei die elektrophoretische Trennung in einer Kapillare, also in einem sehr dünnen Röhrchen statt. Das folgende Schema zeigt den Aufbau. Schema der Kapillar- Elektrophorese Die Auftrennung der Stoffe findet in einer dünnen Kapillare statt (1/100 bis 1/10 mm Innendurchmesser, 20 bis 200 cm lang) Wie bringt man die Probe hinein? Das geschieht, indem man kurzzeitig den linken Pufferbehälter durch das Probengefäß

16 ersetzt und dann ein wenig Probe z.b. durch Ausübung von Druck oder durch einen Stromstoß in die Kapillare bringt. Es gibt für die Probenaufgabe verschiedenste Verfahren. Jedes hat Vor- und Nachteile. Wie wird die Kurve aufgezeichnet? Der Detektor zeichnet vorbeifließende Stoffe auf, weil diese eine Schwächung des einfallenden Lichts verursachen. Für die Protein-Elektrophorese werden meist UV- Lichtquellen und UV-Detektoren verwendet. Der Ablauf einer Auftrennung mittels Kapillar-Elektrophorese ist in der folgenden Abildung dargestellt: Ablauf der Kapillarelektrophorese Die Proteine wandern Richtung Minus-Pol Die Anordnung der Pole in den obigen Abbildungen ist kein Irrtum. Bei der Kapillar- Elektrophorese wandern die Proteine Richtung Minus-Pol, obwohl sie negativ geladen sind. Der Grund ist der bei der Kapillar-Elektrophorese übermächtige elektro-osmotische Fluss (EOF). Der EOF geht Richtung Minus-Pol. Die Proteine wollen zwar Richtung Plus-Pol wandern, der EOF reißt sie aber zum Minus-Pol mit. Gamma-Globuline kommen als erste zum Detektor

17 Auch dies ist für die Protein-Elektrophorese ungewöhnlich, bei der man Gamma- Globuline als langsame, nur gering wandernde Fraktion kennt. Aber gerade deswegen kommen die Gamma-Globuline bei der Kapillar-Elektrophorese als erste zum Detektor. Weil sie dem EOF am wenigsten Widerstand entgegensetzen. Wo liegen die Vorteile der Kapillar-Elektrophorese? Da man die Kapillaren gut kühlen kann, läuft die Elektrophorese schneller. Proteintrennungen dauern nur wenige Minuten. Dies muss man näher erklären: Elektrophoresen laufen schneller, wenn man höhere Spannungen anlegt. Höhere Spannungen führen aber auch zu stärkerem Stromfluss und zum Entstehen von Wärme. Und Wärme hat verschiedene negative Einflüsse auf die Elektrophorese. Die Kapillaren bei der Kapillar-Elektrophorese lassen sich aus technischmechanischen Gründen viel leichter kühlen als ein Agarose-Gel oder eine Zellulose- Azetat-Folie. Daher kann man bei der Kapillar-Elektrophorese viel höhere Spannungen einsetzen (z.b Volt) und die Auftrennung ist dadurch schneller fertig. Die Methode ist gut automatisierbar. Das Vorbereiten der Serumproben und das Hantieren mit Folien oder Gelen bei den Träger-Elektrophoresen erfordert einen relativ hohen manuellen oder mechanischen Aufwand. Bei der Kapillar-Elektrophorese ist dies einfacher. Geringe Probenmengen notwendig Bei der Kapillar-Elektrophorese braucht man nur extrem kleine Probenmengen (1-50 nl). Diese Eigenschaft kommt eher Spezialanwendungen zugute, für medizinische Anwendungen ist das kein großer Vorteil, da auch die anderen Elektrophorese-Techniken nicht viel Probe brauchen.

18 7. Beispiele von Serumeiweiß-Elektrophoresen Normale Elektrophorese Es dominiert die Albuminfraktion (ca. 60%). Die Alpha-1-Globuline machen etwa 4% aus, die Alpha-2-Globuline 8%, die Beta-Globuline 12% und die Gamma-Globuline 16%. (Merkhilfe für Globuline ). Diese Werte gelten für die Cellulose-Azetat-Folien-Elektrophorese bei Färbung mit Ponceau-Rot, bei anderen Färbungen oder anderen Elektrophoresen gelten etwas andere Werte (Ursache: Nicht alle Techniken trennen die Fraktionen genau gleich und nicht alle Farbstoffe färben alle Proteine gleich stark an).

19 Akute Entzündung Die Alpha-1- und die Alpha-2-Globuline sind im Vergleich zur normalen Kurve (grün) deutlich erhöht. Das kann bei jeder Art von akuter Entzündung vorkommen, besonders bei Bakterienverursachter Entzündung (z.b. Nierenentzündung, Lungenentzündung, Rotlauf). Allerdings dauert es 2-3 Tage bis die Alpha-Globuline deutlich erhöht sind. Virus-verursachte Entzündungen zeigen geringere Veränderungen. Auch nicht-infektiöse Entzündungen (z.b. Verbrennungen, Herzinfarkt) können dieses Bild zeigen.

20 Paraproteinämie Entartete weiße Blutkörperchen können ein Protein (Paraprotein) bilden, das in der Elektrophorese als Zacke auffällt. Das Protein entsteht aus einer einzigen, bestimmten Linie von Zellen, einem Zell-Klon. Man nennt es auch M-Protein und die Zacke der Kurve M-Gradient, wobei das M für monoklonal steht ("1 Klon"). Am häufigsten kommt ein Paraprotein beim sog. MGUS vor, ein Zustand, der an sich keine Krankheit ist, aber in etwa 1% der Fälle pro Jahr in eine bösartige Erkrankung übergeht. Paraproteine kommen vor bei Lymphomen (Krebs der Lymphozyten in Lymphknoten und/oder Blut) und beim Plasmozytom (Krebs der Plasmazellen; meist im Knochenmark).

21 Beta-Gamma-Typ Vom Beta-Gamma-Typ spricht man, wenn der Beta-Gipfel ohne klare Abtrennung in den Gamma-Bereich übergeht. Der Beta-Gamma-Typ findet sich bei Leberzirrhose verschiedener Ursache. Verursacht wird dies durch die Erhöhung der Immunglobuline. IgG, IgA und ev. IgM sind erhöht. IgA sind besonders bei der durch Alkohol oder andere Gifte verursachten Zirrhose erhöht. Und gerade die IgA-Erhöhung trägt zum Beta-Gamma-Typ bei, da die IgA bei der Elektrophorese im Übergangsbereich zwischen Beta und Gamma liegen.