Technische Universität München. Lehrstuhl für Technische Mikrobiologie und Technologie der Brauerei II

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1 - OAÄ Technische Universität München Lehrstuhl für Technische Mikrobiologie und Technologie der Brauerei II Elektrophoretische und immunchemische Untersuchungen von Hopfenproteinen zur Sortendifferenzierung Klaus Heller Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Brauwesen, Lebensmitteltechnologie und Milchwirtschaft der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktor-Ingenieurs genehmigten Dissertation Vorsitzender: Prüfer der Dissertation: Univ.-Prof. Dr. W. Back l.univ.-prof. Dr. S. Donhauser, pens. 2.Univ.-Prof. Dr. L. Narziß, em. Die Dissertation wurde am bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Brauwesen, Lebensmitteltechnologie und Milchwissenschaft am angenommen.

2 Inhaltsverzeichnis: 1 Einleitung Methoden der Hopfensortenunterscheidung Handbonitierung Analyse der Hopfenöle Analyse der Bitterstoffe Weitere Methoden der Hopfensortendifferenzierung Problemstellung Grundsätzliche Überlegungen zur Hopfensortenunterscheidung Kriterien zur Auswahl eines geeigneten Antigens für immunchemische Tests 8 2 Theorie: Elektrophoretische Methoden Isoelektrische Fokussierung (IEF) Analytische IEF IEF mit Tragenunpholyten In Aganuegelen (AGIF) IEF mit Trägerampholyten in Polyacrylamidgelen (PAGIF) IEF mit Immobilisierten ph-gradienten (IPG) Präparative IEF Präparative IEF in granulierten Gelen PrSparative IEF in Polyacrylamidgelen mit immobilisiertem ph-gradient Nativ-PAGE SDS-Elektrophorese Densitometrie 11

3 3 Theorie: Immunchemie Die biologische Bedeutung des Immunsystems Immunchemische Analysen Immunpräzipitationstechniken Immunoassays 13 4 Material und Methoden Technische Ausrüstung Vermählen, Probeteilen und Mischen Zentrifugen IEF, Nativ-PAGE und SDS-Elektrophorese Densitometer Gelchromatographie Immunchemie Immunelektrophorese Sonstiges Verbrauchsmaterial Methoden Probenextraktion Probenextraktion für die eiektrophoretischen Methoden Probenextraktion für den EUSA Proteinbestimmungen UV-Methode nach Warburg Mikro-Lowry-Methode Bestimmung von Rohprotein 20

4 4.3.3 Analytische isoelektrische Fokussierung IEF mit Trfigerampholyten in Agarosegelen IEF mit Trägcnunpholyten in Polyacrylamidgelen IEF mit Immobilisierten ph-gradienten Präparative IEF Präparative IEF in granulierten Gelen Präparative IEF In Polyacrylamidgelen mit Immobilisiertem ph-gradient Nativ-PAGE SDS-Elektrophorese Zweidimensionale Elektrophorese (2D) Visualisierung der Proteine Coomassle-Färbungcn Coomassie R Serva Violett :13 Serva W Coomassie R-250 mit Kupferverstärkung Silberfärbungen Silberfärbung nach Willoughby Silberfärbung nach Heukeshoven " Zymogramme Peroxldasen (POD) Aniarbung Esterasen Phosphatasen Densitometrie Gelpermeation Immunchemlsche Methoden Immunisieren Antiserumgewinnung Isolierung von IgG mit immobilisiertem Protein A 31

5 4.4.4 Biotinylierung Immundoppeldiffusionstest nach Ouchterlony Immunelektrophoresen Allgemeine Arbeitsschritte Rocket-Immunelektrophorese Une-Immunelektrophorese Line-Rocket-Inuniinelektrophorese Kreuzimmunelektrofokussierung Elektroblotten ELISA Allgemeine Arbeitsschritte Durchführung des optimierten EUSA Hopfensortenunterscheidung mit Hilfe elektrophoretischer Methoden Probenextraktion 5.2 IEF 53 Nativ-PAGE 5.4 SDS-Elektrophorese 5.5 2D-Elektrophorese 5.6 Zymogramme 5.7 Vergleich verschiedener Hopfensorten Untersuchung verschiedener Erntejahre Einfluß des Erntezeitpunkts auf die Hopfenproteine Abhängigkeit der Proteine vom Standort des Hopfens Einfluß der Stickstoffdüngung auf die Proteine verschiedener Hopfensorten

6 5.7.5 Auswirkungen der Temperatur auf die Proteinzusammensetzung 64 bei Hopfenpulvern 5.8 Bestimmung von verschiedenen Hopfenmischungen Nachweis von Brewers Gold in anderen Hopfensorten Nachweis von Hüller Bitterer in anderen Hopfensorten Nachweis von Hopfen des Saazer-Formenkreises bzw. Hallertauer Mfr. 73 in anderen Hopfensorten 5.9 Diskussion der Ergebnisse Hopfensortendifferenzierung mit immunchemischen Methoden Gewinnung und Charakterisierung von Antiseren zur immunchemischen 77 Hopfensortenunterscheidung Gewinnung eines Antiserums gegen Brewers Gold Gewinnung eines Antiserums gegen Brewers Gold 81 und Hüller Bitterer Gewinnung eines Antiserums gegen Hopfen 82 des Saazer-Formenkreises und Hallertauer Mfr Gewinnung eines Antiserums zur Hopfengruppenunterscheidung Diskussion der Ergebnisse Entwicklung eines ELISA zur Hopfengruppenunterscheidung IgG-Isolierung Biotinylierung des IgG Optimierung des ELISA Bestimmung der optimalen Beschlchtungsbedingungen Optimierung der Probeninkubation Bestimmung der optimalen Konzentration und Inkubation des Konjugats Optimierung der Detergenzienkonzentration im Waschpuffer 97

7 Bestimmung der optimalen Konzentration und Inkubationszelt 98 von Extr- bzw. Streptavidln-AIkalischer Phosphatase Meßgenauigkeit und untere Nachweisgrenze des ELISA Optimierung der Extraktion Präzision der Extraktion Vergleich verschiedener Hopfensorten Untersuchung verschiedener Erntejahre Einfluß des Erntezeitpunkts auf den Antigengehalt Abhängigkeit des Antigengehalts vom Standort des Hopfens Einfluß der Stickstoffdüngung auf den Antigengehalt 113 verschiedener Hopfensorten Temperatureinfluß auf den Antigengehalt bei Hopfenpulver Bestimmung von verschiedenen Hopfenmischungen Nachweis von Hüller Bitterer in anderen Hopfensorten Nachweis von Perle in anderen Hopfensorten Diskussion der Ergebnisse Zusammenfassung Literatur Anhang 152