Untersuchungen zur bifunktionellen Rolle von HDL

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1 Untersuchungen zur bifunktionellen Rolle von HDL DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades des Fachbereiches Chemie der Universität Hamburg vorgelegt von Gunnar Höbbel aus Dortmund Hamburg 1999

2 1. Gutachter: Prof. Dr. B. Bisping 2. Gutachter: Prof. Dr. G. Assmann, Westfälische-Wilhelms-Universität Münster Tag der letzten mündlichen Prüfung: 29. November 1999

3 Für Anja, meine Eltern, und Holger, Eva und Hendrik. und für alle gebeutelten Doktoranden in den Laboren dieser Welt: Der Gelkönig Wer steht da so spät im Abzugswind? Der Doktorand pipettiert dort geschwind. Er hält das Eppi, er hält es warm, Darin die Bakterien, E. coli vom Darm. Oh Probe, was pelletierst Du so schlecht? Es ist schon halb eins, das ist nicht gerecht. Ich muß doch nach Hause, dort wartet die Frau, Sie wird sich beschweren, ich weiß es genau. Da plötzlich die Stimme im leeren Labor, Sie kommt aus dem Nichts, sie dringt an sein Ohr: Du Knecht des Versuches so gehe nicht fehl, Beeil Dich mal lieber und gieße das Gel! Professor, Professor, bist Du s den ich hör? Doch nein, Du hast Urlaub, Du bist ja auf Föhr. Sei ruhig mein Sohn und fürchte Dich nicht, Ich bin der Gelkönig... komm wieder an s Licht. Na, soll ich Dir helfen bei Deinem Versuch? Du brauchst meine Hilfe, so steht s nicht im Buch. Ja, Gelkönig, ja, ich gieße das Gel, Für n gutes Ergebnis geb ich Dir mein Seel! So machst Du es richtig, ja so ist es fein, Nun lade und schalte das Netzgerät ein! Oh König, oh König, ich seh es genau, Der Marker ist falsch, er ist gar nicht blau. Egal jetzt mein Sohn, nun spute Dich bald, Und bist Du nicht willig, so kürz ich s Gehalt! Mein König, mein König, das Gel läuft ganz schief, Und all diese Puffer, die sorgen für Mief. Dem Doktorand grauset s, er sucht RNA, Doch auch nach zwei Stunden ist einfach nichts da. Er grübelt, er zweifelt, er hat s nicht kapiert. Die RNA: ist komplett degradiert! Chr. Conrad

4 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 1995 bis November 1999 im Institut für Arterioskleroseforschung an der Westfälischen-Wilhelms-Universität Münster durchgeführt.

5 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis I. Zusammenfassung II. Summary Einleitung High Density Lipoproteine und Arteriosklerose Definition, Struktur und Metabolismus der HDL Einfluß von HDL auf die zelluläre Cholesterinhomöostase HDL-Bindungsproteine Mögliche andere Funktionen der HDL HDL und Signaltransduktion Phosphatasen HDL und Zellwachstum Tangier-Krankheit Aufgabenstellung Material und Methoden Materialien Geräte Chemikalien und Enzyme Lösungen und Medien Methoden Kultivierung humaner Hautfibroblasten [208] Biopsie und Kultivierung humaner Hautfibroblasten Subkultivierung von Monolayerkulturen Kryokonservierung von Zellen Auftauen kryokonservierter Zellen Ausplattieren der Zellen für Experimente Zellzahlbestimmung Lipoproteinpräparation Protein-Konzentrationsbestimmung Modifizierung der HDL Nitrierung von HDL Modifizierung von HDL 3 mit Dimethylsuberimidat Delipidierung von Lipoproteinen [284] Isolierung von Apolipoprotein A-I Präparation von Apo-A-I-Proteoliposomen Isolation von Apolipoprotein A-II und Herstellung von Apo-A-II-Proteoliposomen Herstellung von Liposomen mit Lipiden aus HDL Vorinkubation der Zellen zur Beladung mit Cholesterin...42

6 Inhaltsverzeichnis Methoden zur Cholesterinbestimmung Lipidextraktion des Mediums Lipidextraktion der Zellen Fluorimetrisch-enzymatische Cholesterinbestimmung Bestimmung von Cholesterin mittels HPLC Gaschromatographische Bestimmung von Cholesterin Nachweis von Cholesterin mittels DC Detektion nichtradioaktiver Lipide durch Anfärbung der DC-Folien [301] Messung des Cholesterin-Masseneffluxes bei kurzen Inkubationszeiten Phosphatase-Assay Bestimmung der Phosphataseaktivität Polyacrylamidgelelektrophorese Durchführung der Versuche zum Zellwachstum Ergebnisse Etablierung einer Methode zur Bestimmung des Cholesterineffluxes Einfluß verschiedener Beladungsmethoden Cholesterinefflux aus Kontrollfibroblasten: Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit HDL-induzierter Cholesterinefflux Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Inkubationszeit Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Konzentration Apo-A-I-induzierter Cholesterinefflux Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Inkubationszeit Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Konzentration Apo-A-I-Proteoliposomen-induzierter Cholesterinefflux Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Inkubationszeit Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Konzentration Cholesterinefflux: Vergleich von HDL, Apo-A-I und Apo-A-I-Proteoliposomen Cholesterinefflux aus Tangierfibroblasten HDL-induzierter Cholesterinefflux Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Inkubationszeit Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Konzentration Apo-A-I-induzierter Cholesterinefflux Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Inkubationszeit Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Konzentration Apo-A-I-Proteoliposomen-induzierter Cholesterinefflux Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Inkubationszeit Cholesterinefflux: Abhängigkeit von der Konzentration Cholesterinefflux bei Tangierfibroblasten: Vergleich von HDL, Apo-A-I und Apo-A-I-Proteoliposomen Cholesterinefflux: Vergleich von Tangierzellen und Kontrollzellen Cholesterin-Massenefflux: HDL-induzierte Signaltransduktionswege Cholesterin-Massenefflux: Beteiligung der Proteinkinase C... 98

7 Inhaltsverzeichnis Cholesterin-Massenefflux: Beteiligung der PI-PLC Cholesterin-Massenefflux: Beteiligung der PC-PLC Cholesterin-Massenefflux: Beteiligung der PC-PLD Cholesterin-Massenefllux: Beteiligung von Lysosulphatiden Cholesterin-Massenefflux: Beteiligung weiterer Proteinkinasen Cholesterin-Massenefflux: Beteiligung von Guanylat-Cyclasen Cholesterin-Massenefflux: Einfluß von Ca Cholesterin-Massenefflux: Einfluß von Proteinphosphatasen der PPP- und PPM-Familie Cholesterin-Massenefflux: Einfluß von Okadasäure Cholesterin-Massenefflux: Einfluß von Calyculin A Cholesterin-Massenefflux: Einfluß von Cantharidin Cholesterin-Massenefflux: Einfluß von Endothall Cholesterin-Massenefflux: Einfluß von Proteinphosphatasen der PTP-Familie Phosphataseaktivität in Fibroblasten Phosphataseaktivität: Phosphorylierung zellulärer Proteine Phosphataseaktivität: HDL-abhängige Proteinphosphorylierung Phosphataseaktivität: TNM-HDL-abhängige Proteinphosphorylierung Phosphataseaktivität: Apo-A-I-abhängige Proteinphosphorylierung Phosphataseaktivität: Calyculin A-abhängige Proteinphosphorylierung Phosphataseaktivität: Okadasäure-abhängige Proteinphosphorylierung Phosphataseaktivität: Cantharidin-abhängige Proteinphosphorylierung Mitogene Aktivität der HDL Mitogene Aktivität der HDL: Konzentrationsabhängigkeit Mitogene Aktivität der HDL: Vergleich von Tangier- und Kontrollzellen Mitogene Aktivität der HDL: Einfluß von Inhibitoren Mitogene Aktivität der HDL: Inhibition der Proteinkinase C Mitogene Aktivität der HDL: Inhibition von Proteinphosphatasen Mitogene Aktivität der HDL: Beteiligung von PI-PLC, PC-PLC und PC-PLD Mitogene Aktivität der HDL: Nähere Charakterisierung des Phospholipidstoffwechsels Mitogene Aktivität der HDL: Beteiligung von Proteinkinasen Mitogene Aktivität der HDL: Einfluß von Ca Diskussion HDL-induzierter Cholesterinefflux Etablierung der Methodik Untersuchung des HDL-induzierten Cholesterin-Masseneffluxes HDL-induzierter Cholesterinefflux an Zellen von Tangier-Patienten Mitogene Wirkung von HDL Nähere Charakterisierung der HDL-induzierten Signaltransduktion Literaturverzeichnis Lebenslauf Danksagung...193

8 Zusammenfassung 4 1. Abkürzungsverzeichnis A ACAT ADP ATP Apo AcetylCoA:Cholesterin-Acyltransferase Adenosindiphosphat Adenosintriphosphat Apolipoprotein B BAPTA-AM BrdU 1,2-bis(o-Aminophenoxy)ethan-N,N,N,N -tetraacetat- (acetomethyl)ester Bromdeoxyuridin C camp CETP cgmp Zyklisches Adenosin-monophosphat Cholesterin Ester Transfer Protein Zyklisches Guanosin-monophosphat D DAG DC DMEM DMS DNA Dpm DPPC Diacylglyzerin Dünnschichtchromatographie Dulbecco's Modified Eagle's Medium Dimethylsuberimidat Desoxyribonukleinsäure Zerfälle pro Minute (Departures per minute) Dipalmitoylphosphatidylcholin E EDTA EGF ER Ethylendiamintetraacetat Epidermaler Wachstumsfaktor (Epidermal growth factor) Endoplasmatisches Retikulum F FCS FPLC Fetales Kälber-Serum (Fetal calve serum) Fast-Protein-Liquid-Chromatographie G GC GDP GTP Gaschromatographie Guanosindiphosphat Guanosintriphosphat H HDL HDL 3 HEPES HPLC Lipoproteine hoher Dichte (High-density lipoproteins) HDL-Subfraktion 3 (mit einer Dichte von 1,125 bis 1,21 kg/l) N-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanschwefelsäure High-Pressure- bzw. High-Performance-Liquid Chromatographie I IDL IP 3 Lipoproteine mittlerer Dichte (Intermediate-density lipoproteins) Inositoltriphosphat K KHK Koronare Herzkrankheit

9 Zusammenfassung 5 L LCAT LDL LOX Lyso-PC Lecithin:Cholesterin-Acyltransferase Lipoproteine niedriger Dichte (Low-density lipoproteins) Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor Lyso-Phosphatidylcholin M MAP-Kinase Mitogen-Activated-Proteinkinase P PA PA-PPH PBS PC PC-PLC PC-PLD PDGF PI PI-PLC PIP PIP 2 PKA PKC PLC PLD PLTP PMA PP1 PP2A PP2B PSL Phosphatidsäure (Phosphatidic Acid) Phosphatidic Acid-Phosphohydrolase Phosphat-gepufferte Salzlösung (Phosphate-buffered saline) Phosphatidylcholin Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase C Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase D Plättchen-Wachstumsfaktor (Platelet-derived growth factor) Phosphatidylinositol Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C Phosphatidylinositolmonophosphat Phosphatidylinositolbisphosphat Proteinkinase A Proteinkinase C Phospholipase C Phospholipase D Phospholipid Transfer Protein Phorbol-12-myristat-13-acetat Proteinphosphatase der Gruppe 1 Proteinphosphatase der Gruppe 2A Proteinphosphatase der Gruppe 2B Photostimulated Luminescence S SREBP SCAP Sterol Regulatory Element-Binding Proteins Sterol Regulatory Element-Binding Protein Cleavage Protein T TEMED TNM N, N, N, N,-Tetramethylethylendiamin Tetranitromethan U upm Umdrehungen pro Minute V (v/v) VLDL Vol. Volumenverhältnis (Volume over volume) Lipoproteine sehr niedriger Dichte (Very-low-density lipoproteins) Volumen Z z.a. zur Analyse, Reinheitsgrad der benutzten Chemikalien

10 2. I. Zusammenfassung Zusammenfassung 6 Es besteht ein inverser Zusammenhang zwischen der HDL-Konzentration im Blut und der Inzidenz kardiovaskulärer Erkrankungen. HDL haben verschiedene potentiell antiatherogene Funktionen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden: die über zelluläre Signaltransduktionswege vermittelte Induktion von Cholesterinefflux und die Beeinflussung des Zellwachstums. Ziel der Arbeit war es, die durch HDL induzierten Signaltransduktionswege diesen beiden Funktionen durch in vitro Versuche an kultivierten menschlichen Fibroblasten zuzuordnen. Zellwachstum wurde mit einem fluorimetrischen Test mittels Inkorporation von Bromdeoxyuridin in die DNA der Zellen gemessen. Zur Untersuchung des Cholesterineffluxes wurde die im Zellüberstand akkumulierende Cholesterinmasse mit Hilfe einer ultrasensitiven gaschromatographischen Methode ermittelt. HDL induzierten in humanen Hautfibroblasten konzentrationsabhängig Netto-Cholesterin-Massenefflux und Zellwachstum. Der Cholesterinefflux war im HDL-Konzentrationsbereich bis 100 µg/ml bis zu 6 mal effektiver als der Cholesterinefflux nur in Anwesenheit eines unspezifischen Cholesterinakzeptors (1000 µg/ml Albumin). Die durch HDL induzierte DNA-Synthese erreichte etwa 80 % des durch Vollmedium induzierten Wertes. Mit Hilfe verschiedener Inhibitoren wurde gezeigt, daß der HDL-induzierte Cholesterin- Massenefflux über eine G-Protein-abhängige Aktivierung der PC-spezifischen Phospholipasen C und D induziert wird. Die bei der PC-Hydrolyse entstehenden Second Messenger Diacylglyzerol (DAG) und Phosphatidsäure (PA) waren an der Induktion von Cholesterin-Massenefflux beteiligt: DAG über eine Aktivierung von PKC und die nachfolgende Phosphorylierung zellulärer Proteine, die unter der Kontrolle Serin- / Threoninspezifischer Phosphatasen stehen; PA über die Umwandlung in DAG und möglicherweise auch direkt über nicht identifizierte Mechanismen. Für die bei der PC-Hydrolyse gebildeten wasserlöslichen Produkte Cholin und Phosphorylcholin konnte keine Beteiligung an der Induktion von Cholesterin-Massenefflux gezeigt werden. Die mit der PC-Hydrolyse assoziierte Cholesterinefflux-Signalkaskade konnte durch das Hauptstrukturprotein der HDL, Apo-A-I, induziert werden und war mit der Phosphorylierung von Proteinen mit den molekularen Massen von 14, 65 und 71 kda assoziiert. Die durch HDL ebenfalls induzierte Aktivierung von PI-PLC war nicht an der Induktion von Cholesterin-Massenefflux beteiligt. Die Aktivierung von PI-PLC war zusammen mit der Aktivierung von PC-PLC an der Induktion der mitogenen Wirkung der HDL beteiligt. Der bei der PI-Hydrolyse gebildete Second Messenger Inositoltriphosphat (IP 3 ) induzierte die

11 Zusammenfassung 7 Mobilisierung zellulären Calciums. Durch Ca 2+ aktivierte Effektoren sind Phospholipase A 2 (PLA 2 ) und MAP-Kinase. Für das bei der PC-Hydrolyse mittels PC-PLC enstehende Phosphorylcholin konnte ebenfalls eine Beteiligung an der Induktion von Zellwachstum gezeigt werden. Die für die mitogene Wirkung der HDL phosphorylierten Proteine werden sowohl durch Serin- / Threonin-spezifische Phosphatasen als auch durch Tyrosin-spezifische Phosphatasen reguliert; die Phosphorylierung dieser Proteine mit Molekulargewichten zwischen 14 und 81 kda wurde nicht durch Apo-A-I induziert. Mit HDL assoziierte Lysosulphatide konnten als mögliche Induktoren der mitogenen Wirkung aufgezeigt werden. Der durch HDL induzierte Cholesterin-Massenefflux und das durch HDL induzierte Wachstumsverhalten werden somit in kultivierten Fibroblasten durch unterschiedliche Liganden und Signaltransduktionswege getriggert, wobei die PC-PLC in beide Signalwege, die PI-PLC ausschließlich in den mitogenen Signalweg involviert ist. Die Regulation (und in vitro Verstärkung) des Cholesterin-Masseneffluxes durch Phosphatase-Inhibitoren zeigt einen neuen möglichen Ansatz einer antiateriosklerotischen Therapie auf.

12 Zusammenfassung 8 2. II. Summary Epidemiological studies revealed a strong inverse correlation between high density lipoprotein (HDL) cholesterol plasma levels and the incidence of cardiovascular disease. This finding is usually explained by the ability of HDL to remove cholesterol from peripheral cells for delivery in the liver. An additional proposed function of HDL which may influence atherogenesis is the modulation of cell growth. In this study, the influence of HDL-induced cell signalling on cholesterol excretion and mitogenesis was examined. DNA synthesis was assessed by measuring bromdeoxyuridine (BrdU) incorporation into DNA using a commercially available ELISA. Cholesterol efflux was measured by gas-liquid-chromatography. In cholesterol-loaded human skin fibroblasts, low concentrations of HDL (< 100 µg/ml) induced cholesterol mass efflux in a non-linear concentration-dependent manner. A strong proliferative effect of HDL (upto 80 % of the effect induced by foetal calf serum) reached saturation at concentrations of µg/ml. By use of different inhibitors it was shown that HDL-induced cholesterol mass efflux in cultivated human skin fibroblasts occurs via a G-protein-dependent activation of phosphatidylcholine (PC)-specific phospholipases C and D. The produced lipid second messengers diacylglycerol (DAG) and phosphatidic acid (PA) were found to be involved in this process. DAG (via activation of protein kinase C) induced the phosphorylation of proteins with apparent molecular masses of 14 to 81 kda. These phosphoproteins were regulated by serine- /threonine-, but not by tyrosine-specific phosphatases. The water-soluble products of PC-hydrolysis (cholin and phosphorylcholin) were not directly involved in cholesterol mass efflux in vitro. The HDL-induced effects on PC-hydrolysis and cholesterol efflux could be mimicked by apolipoprotein A-I (apo-a-i), the main protein constituent of HDL. Apo-A-I induced the phosphorylation of proteins with apparent molecular weights of 14, 65 and 71 kda. HDL induced activation of phosphoinositide-specific phospholipase C (PI-PLC) was not involved in the activation of cholesterol efflux in cholesterol loaded cells. PI-PLC activation, however, was involved in the mitogenic effect of HDL. The second messenger inositoltrisphosphate (IP 3 ) initiated the release of cellular Ca 2+. Ca 2+ -dependent downstream effectors activated by HDL are phospholipase A 2 (PLA 2 ) and MAP-kinase. The HDLdependent mitogenic response was regulated by both serine- /threonine- and tyrosine-specific phosphatases. Lysosulphatides were found at least partly responsible for the described mitogenic effects.

13 Zusammenfassung 9 In conclusion, HDL-induced cholesterol efflux and mitogenesis are induced by different ligands and are regulated by different cell signalling pathways in cultivated human skin fibroblasts. The cell signalling molecules involved in these pathways (kinases, phosphatases and phosphoproteins) migth be potential targets for an antiatherogenic therapy.

14 Einleitung Einleitung Herz- Kreislauferkrankungen sind in den Industrienationen die Haupttodesursache [337]. Neben Risikofaktoren wie Rauchen und Bluthochdruck zählen Lipidstoffwechselstörungen zu den Hauptursachen arteriosklerotischer Erkrankungen High Density Lipoproteine und Arteriosklerose Cholesterin ist ein für die Zellen höherer Lebewesen essentielles Lipidmolekül. Es ist eine wichtige Komponente zur Regulation der allgemeinen und lokalen physikochemischen Eigenschaften der Membran und Vorläufer für die Steroidhormon- und Gallensäurebiosynthese. Die Zellen höherer Lebewesen können Cholesterin synthetisieren und sind in der Regel nicht auf eine externe Zuführung von Cholesterin angewiesen, mit Ausnahme starker Wachstumsphasen, wie z.b. bei Zellen des in der Entwicklung begriffenen zentralen Nervensystems. Der menschliche Organismus produziert täglich etwa 10 mg Cholesterins pro kg Körpergewicht, davon nur 5 10 % in der Leber. Da in peripheren Zellen keine Möglichkeit besteht Cholesterin abzubauen, müssen täglich ca. 9 mg Cholesterin pro kg Körpergewicht zur Leber transportiert und dort zu Gallensäuren umgewandelt werden. Diesen Prozeß des Transportes von Cholesterin aus peripheren Geweben zur Leber bezeichnet man als reversen Cholesterintransport [94]. High Density Lipoproteine (HDL) spielen eine zentrale Rolle in diesem reversen Cholesterin-Transport. Zahlreiche epidemiologische Studien der letzten Jahre wie z. B. die Framingham-Studie [134], die Tromsø-Studie [230], die PROCAM-Studie [17, 19] und der Multiple Risk Factor Intervention Trial [136, 334] zeigten, daß eine von anderen Risikofaktoren unabhängige, inverse Korrelation zwischen der HDL-Cholesterinkonzentration und der Inzidenz der koronaren Herzkrankheit (KHK) besteht. Eine Verringerung der Konzentration der HDL sowie des Apolipoproteins A-I als deren wesentlichem Proteinbestandteil gilt als einer der wichtigsten Risikofaktoren für Erkrankungen des Herz- Kreislaufsystems [123, 135, 254, 268]. Untersuchungen an Tiermodellen zeigten, daß durch eine Erhöhung des HDL-Spiegels im Plasma die Zahl arteriosklerotischer Plaques stark

15 Einleitung 11 verringert werden kann [308]. Aus klinischen Studien mit Lipidsenkern ging hervor, daß auch eine medikamentöse Erhöhung des HDL-Spiegels in Kombination mit anderen Veränderungen des Lipidstoffwechsels mit einer Reduktion sowohl der Inzidenz als auch der Progression der KHK assoziiert ist [24, 58, 124, 135, 136, 216, 232]. Jedoch ist bis heute nicht eindeutig geklärt, ob die offenkundige Schutzfunktion hoher HDL-Cholesterinwerte allein durch das Modell des reversen Cholesterin-Transportes erklärt wird, welches den Cholesterin-Transport von extrahepatischen Zellen zur Leber beschreibt [102, 169, 231, 308]. Der erste Schritt des reversen Cholesterin-Transportes ist der Efflux zellulären Cholesterins und die Aufnahme dieses Cholesterins durch HDL. Es existieren zwei Hypothesen für die Mechanismen der Aufnahme zellulären Cholesterins durch HDL. Das erste Konzept basiert auf der Tatsache, daß Cholesterin zwischen Lipoproteinen und zellulären Membranen aufgrund eines physikochemischen Gradienten austauschbar ist. Dies geschieht vermutlich durch Diffusion in die umgebende wäßrige Phase [169, 259]. Der Cholesterin-Nettoefflux entsteht somit durch ein Konzentrationsgefälle für Cholesterin zwischen der Plasmamembran und der extrazellulären Lipoproteinoberfläche [83, 170, 171]. Er wird durch die Aktivität der Lecithin:Cholesterin-Acyltransferase (LCAT), die freies Cholesterin auf der äußeren Hülle der HDL verestert, verstärkt und aufrechterhalten [81, 113, 162, 182], da die veresterten Cholesterinmoleküle im Inneren des HDL-Moleküls gespeichert werden. Andere strukturelle Faktoren wie die Lipid- und Proteinzusammensetzung der Membran und die Form des Akzeptormoleküls könnten bei dem Cholesterinefflux durch dieses Modell ebenfalls noch eine Rolle spielen [86, 87, 88, 130, 132, 180, 192, 276]. Die spezifische Rolle der HDL beschränkt sich in diesem Modell somit auf ihre Affinität zur LCAT. Die physiologische Relevanz dieses Modells wird jedoch dadurch relativiert, daß HDL an spezifische Bindungsstellen der Zelloberfläche binden, und daß diese Interaktion zwischen den HDL und der Zelle eine spezifische Rolle beim Cholesterinefflux spielen könnte [55, 98, 223, 251]. Auch wenn bisher nur indirekte Anzeichen für eine Beteiligung der HDL-Bindungsproteine an dem spezifischen, durch HDL induzierten Cholesterinefflux gefunden wurden, wird in dem zweiten Modell davon ausgegangen, daß neben dem unspezifischen, nur durch den Konzentrationsgradienten bedingten Cholesterinefflux durch HDL in der Zelle eine Signalkaskade ausgelöst wird. Diese führt letztendlich zu einem aktiven Transport von Cholesterin zur Plasmamembran. Gestützt wird diese Hypothese durch in vitro Untersuchungen an Zellkulturen, die verschiedene HDL-übermittelte Signalkaskaden zeigen konnten.

16 3.2. Definition, Struktur und Metabolismus der HDL Einleitung 12 Die HDL sind Lipoproteine mit einer Dichte von kg/l. Sie sind etwa nm groß und bestehen durchschnittlich aus ca. 50% Protein, 30% Phospholipiden, 10-20% Cholesterin und Cholesterinestern sowie 5% Triglyzeriden [8, 102]. Generell sind HDL inhomogene Lipoproteine mit unterschiedlicher Lipid- und Proteinzusammensetzung und verschiedenen physikochemischen und funktionellen Eigenschaften. Durch Ultrazentrifugation lassen sich die HDL in zwei Dichteklassen HDL 2 (d= kg/l) und HDL 3 (d= kg/l) differenzieren [151, 258]. HDL 2 enthält sowohl die Apolipoproteine Apo-A-I und Apo-A-II, sowie in geringerem Ausmaß andere Apolipoproteine wie Apo-C-II, Apo-C-III, Apo-E und Apo-D [8, 102]. HDL 3 enthält überwiegend die Apolipoproteine A-I und A-II als Strukturproteine und nur geringe Anteile von Apo-C-I. Insgesamt wurde für mehr als 20 Proteine eine Assoziation mit einer oder mehreren HDL-Subklassen gezeigt. HDL 2 ist cholesterin- und triglyzeridreicher als HDL 3. Die mit HDL assoziierten Apolipoproteine A-I, A-II, A-IV, C-I, C-II, C-III und E weisen untereinander eine ähnliche molekulare Struktur auf [48, 199]. Hauptteile ihrer Primärstruktur sind aus repetitiven Blöcken eines 11-Aminosäuren-Sequenzmotivs zusammengesetzt. Die aus zwei 11 er-einheiten entstehenden 22 er-einheiten formen eine amphipathische α-helix, bei der die hydrophobe Seite mit den hydrophoben Seitenketten der Phospholipide und Cholesterin in Wechselwirkung tritt, während die hydrophile Helixhälfte zur wäßrigen Phase gerichtet ist und somit die Dispersion des Lipoproteinpartikels ermöglicht [296]. Das Hauptstrukturprotein der HDL ist das 243 Aminosäuren lange Apolipoprotein A-I. Aufgabe von Apo A-I ist unter anderem die Solubilisierung des HDL-Partikels und die Aktivierung des cholesterin-veresternden Enzyms LCAT. Dieses katalysiert den Transfer sn-2-ständiger Fettsäuren des Phosphatidylcholins auf die 3ß-Hydroxylgruppe des Cholesterins, wobei Lysolecithin und Cholesterinester entstehen [172]. Außerdem ist Apolipoprotein A-I Ligand für spezifische HDL-Rezeptor-Interaktionen und stabilisiert Prostacycline. Wenig untersuchte HDL-Proteine sind das ß2-Glykoprotein I (Apo H), ein Inhibitor der Kontaktaktivierung bei der Gerinnung, Clusterin (Apo J), ein Inhibitor der Komplement-vermittelten Zytolyse und Serum-Amyloid A, ein Akut-Phase Protein. Außer Apolipoproteinen zählen Enzyme zu den Proteinbestandteilen der HDL. Neben der LCAT ist dies vor allem das Cholesterinestertransferprotein CETP, das den Transfer der durch LCAT synthetisierten Cholesterinester von HDL zu den triglyzeridreichen Lipoproteinen im Austausch gegen Triglyzeride und Phospholipide katalysiert [310]. Der

17 Einleitung 13 durch das Zusammenwirken von LCAT und CETP vermittelte Cholesteringradient zwischen Zellmembran und Plasma begünstigt die Aufnahme von zellulärem Cholesterin. Unter den Lipiden der HDL kommt den Phospholipiden, vorwiegend Phosphatidylcholin, eine besondere Rolle zu. Die von ihnen gebildeten Bilayer, in denen die hydrophoben Fettsäuren nach innen und hydrophilen Phosphatidgruppen nach außen weisen, ermöglichen zusammen mit den Apolipoproteinen die Solubilisierung und den Transport von Cholesterin und Triglyzeriden. Sie bilden zudem die optimale Umgebung für die Funktion der HDLassoziierten Enzyme [167]. Lipidreiche HDL entstehen aus lipidarmen Partikeln oder sogar aus lipidfreien Apolipoproteinen [31, 102, 109, 248, 324]. Diese lipidarmen HDL-Vorläufer werden entweder als naszierende HDL in Hepatozyten [65, 119, 145, 219, 220, 314] sowie in der Mukosa des Dickdarms [84, 118, 141] produziert, oder entstehen durch Dissoziation während der Lipolyse von Chylomicronen und VLDL [239, 286, 312] oder durch die Umwandlung von HDL durch die Aktivitäten von CETP [73, 122, 154, 202, 203], Phosphoplipidtransferprotein (PLTP) [168, 323] und hepatischer Lipase [32]. Naszierende HDL aus dem Intestinum enthalten Apo-A-I und Apo-A-IV, naszierende HDL aus Hepatozyten enthalten Apo-A-I, Apo-A-II und / oder Apo E. Es ist bisher noch unbekannt, ob naszierende HDL bereits im Endoplasmatischen Retikulum (ER) entstehen, oder ob sie extrazellulär durch die Assoziation freier Apolipoproteine mit Phospholipiden und Cholesterin aus der Zellmembran gebildet werden. In Übereinstimmung mit dem letzteren Modell fördern lipidfreie Apolipoproteine A- I, A-IV und E den Efflux von Phospholipiden und Cholesterin aus der Zellmembran von Makrophagen, Hepatozyten und Fibroblasten und bilden so HDL-ähnliche Partikel [12, 20, 31, 38, 109, 120, 150, 162, 248, 269, 340]. Lipidarme HDL (prä-ß-hdl) und lipidfreie Apo-A-I werden zu reifen, lipidreichen und sphärischen HDL durch die Aufnahme von Phospholipiden und unverestertem Cholesterin, die Veresterung des Cholesterins durch LCAT und die Aufnahme weiterer Apolipoproteine [74, 162, 164, 190, 204, 229, 241]. Bei diesem Prozeß dienen vermutlich die Plasmamembranen peripherer Körperzellen als Lipidspender und Apo B-haltige Lipoproteine im Plasma als Spender von Apolipoproteinen und Lipiden. Es gibt Hinweise, daß dieser Prozeß eher durch ein Lipidtransferprotein vermittelt wird, als durch unspezifische Assoziation [162, 163, 320, 322]. Das initiale Produkt sind kleine HDL 3, die durch die Veresterung von Cholesterin mittels LCAT in HDL 2 [70, 93, 102] und durch Fusion mit HDL 3 [166, 210, 318] in HDL 2 umgewandelt werden. Cholesterinester der HDL werden durch mindestens zwei direkte und einen indirekten Weg aus dem Kreislauf entfernt: (I) Hepatozyten und steroidhormon-produzierende Zellen

18 Einleitung 14 exprimieren den Scavenger-Rezeptor B 1 (SR-B 1 ), der HDL bindet und die selektive Aufnahme der Cholesterinester vermittelt, ohne daß die Proteine der HDL internalisiert werden [2, 188, 271]. (II) Eine Subpopulation der HDL enthält Apo E und wird durch hepatische Apo E-Rezeptoren aufgenommen [125, 137, 186, 214]. (III) CETP tauscht Cholesterinester der HDL gegen Triglyceride aus VLDL, IDL und LDL und vermittelt so die Elimination der HDL-Cholesterinester aus dem Kreislauf durch den LDL-Rezeptorweg [309, 311]. Als Konsequenz werden aus diesem Prozeß kleinere HDL 3, prä-ß-hdl und lipidfreie Apo-A- I gebildet [73, 122, 154, 202, 203]. HDL 3 und prä-ß-hdl werden ebenfalls noch durch die Hydrolyse von Triglyzeriden und Phospholipiden von HDL 2 durch die hepatische Lipase, die anscheinend als ein Co-Rezeptor in HDL-Bindungstellen bei Hepatozyten fungiert, gebildet [32, 126]. Die Umsetzung von HDL 3 in HDL 2 durch PLTP, sowie die Entfernung von Lipiden aus HDL 2 durch SR-B 1, CETP und hepatischer Lipase setzt lipidarme und lipidfreie Apo-A-I- Partikel frei [32, 73, 122, 154, 168, 202, 203, 323]. Diese kleinen Partikel können den Kreislauf in den extravaskulären Raum verlassen [31, 109, 248]. Dort können sie als Akzeptoren zellulärer Lipide dienen, und somit die Bildung der HDL neu induzieren. In der Niere werden diese kleinen Partikel ausgefiltert und können so den Organismus verlassen [158]. Abbildung 3.1 zeigt schematisch vereinfacht den HDL-Metabolismus:

19 Einleitung 15 Abbildung 3.1: Schematische Darstellung des HDL-Metabolismus, verändert nach Pieters et al. [261]. FC: Freies Cholesterin; LCAT: Lecithin:Cholesterin-Acyltransferase; CE: Cholesterinester; HL: Hepatische Lipase; LPL: Lipoprotein Lipase; VLDL: Lipoproteine sehr geringer Dichte; LDL: Lipoproteine geringer Dichte; CETP: Cholesterinester Transferprotein Einfluß von HDL auf die zelluläre Cholesterinhomöostase Die Regulation der zellulären Cholesterinhomöostase erfolgt zum einen durch die Neusynthese von Cholesterin, zum anderen durch die Aufnahme und den Abtransport von Cholesterin durch Lipoproteine. Nur in wenigen Zelltypen kann Cholesterin durch die Umsetzung in Steroidhormone, Gallensäuren oder Vitamin D abgebaut werden. Exogenes Cholesterin wird als Komponente verschiedener Lipoproteine über spezifische Oberflächenrezeptoren zellulär aufgenommen. Die Cholesterinversorgung extrahepatischer Zellen geschieht überwiegend durch Neusynthese und zu % durch die Aufnahme von LDL nach deren Bindung an LDL-Rezeptoren. Makrophagen besitzen darüber hinaus

20 Einleitung 16 Scavenger-Rezeptoren, durch die sie chemisch modifizierte LDL und Abbauprodukte der triglyzeridreichen Lipoproteine aufnehmen können. Unabhängig von der Art der Aufnahme gelangen die meisten Lipoproteine intrazellulär in Lysosomen, in denen sie abgebaut werden. Die dabei frei werdenden Cholesterinester werden entweder lysosomal gespeichert, oder durch die saure Lipase hydrolysiert und in die lysosomale Membran inkorporiert. Dieses lysosomale Cholesterin wird teils zur Plasmamembran transferiert [54], teils erneut am ER mittels AcetylCoA:Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) verestert und als zytoplasmatische Cholesterinester-Tröpfchen gespeichert [305]. Der Transport lysosomalen Cholesterins zur Plasmamembran ist in Fibroblasten von Patienten mit der Niemann-Pick Typ C Krankheit gestört [64, 78, 209]. Da in eukaryotischen Zellen mehr als 85% des freien Cholesterins in der Plasmamembran lokalisiert ist [295], hat der Transport von Cholesterin zwischen dem trans-golgi-apparat und der Plasmamembran einen besonderen Stellenwert für die Cholesterinhomöostase der Zelle. Er wird durch amphiphile Substanzen inhibiert [112, 194]. Das Cholesterin kann hierbei nicht-vesikulär in Proteolipid-Partikeln zur Zellmembran transportiert werden. Diese enthalten neben Cholesterin auch Sphingolipide, Glykosyl-Phosphatidylinositol-verankerte Membranproteine und Caveolin [112, 238, 299, 300]. Die Mechanismen und Faktoren, die den zielgerichteten Transport ermöglichen, sind - im Gegensatz zum vesikulären Transport jedoch nicht genau bekannt. Der Transport neu synthetisierten Cholesterins vom ER zur Plasmamembran ähnelt dem beschriebenen Proteolipid-Partikel-vermittelten Transport. Er wurde in vitro durch amphiphile Substanzen wie Progesteron und Imipramin inhibiert [112]. Die auf Zellen einwirkenden Lipoproteinkonzentrationen schwanken je nach Zelltyp zwischen 100 % (Plasmakonzentration) bei Endothelzellen und 5-10 % (Konzentration in der Lymphflüssigkeit) [267]. Auch der Bedarf an Cholesterin ist je nach Zelltyp und Wachstumsphase verschieden. Daher ist ein fein reguliertes Gleichgewicht zwischen extrazellulärem und intrazellulärem Cholesterin notwendig. Die Neusynthese von Cholesterin und die LDL-Rezeptor-vermittelte Aufnahme von Cholesterin unterliegen dabei einem negativen Rückkopplungsmechanismus. Ein Anstieg der intrazellulären Cholesterinkonzentration reguliert die Expression des Schlüsselenzyms der Cholesterinsynthese, der HMG- CoA-Reduktase, und die des LDL-Rezeptors herunter und verhindert so eine unbegrenzte Akkumulation von Cholesterin [60, 133, 169]. Weiterhin werden die Gene für CETP und PLTP durch den Cholesteringehalt in der Zelle reguliert. Diese Moleküle besitzen spezifische Lipidbindungsstellen und wirken dadurch als Trägerproteine, die den Lipidaustausch

21 Einleitung 17 zwischen Lipoproteinen vermitteln [62]. CETP spielt eine große Rolle im Katabolismus der HDL und beeinflußt durch den oben bereits beschriebenen Austausch von Cholesterinestern zwischen verschiedenen Lipoproteinklassen die Konzentration, den Apolipoproteingehalt und die Größe der HDL-Partikel im Plasma [62]. Reguliert werden diese Gene u. a. durch SREBP-1 und SREBP-2 (Sterol Regulatory Element-Binding Proteins), Transkriptionsfaktoren, die durch SCAP (SREBP Cleavage-Activating Protein), ein Membranprotein mit einer sterolsensitiven Domäne, aktiviert werden [62, 159, 187, 253, 282, 341]. Im Gegensatz hierzu erfolgt die exogene Cholesterinaufnahme durch Scavenger-Rezeptoren wie z.b. LOX-1 (Lectin-like Oxidized low-density lipoprotein receptor) unkontrolliert [95, 339]. Infolgedessen können Zellen, die über diese Mechanismen der Cholesterinaufnahme verfügen (z.b. Makrophagen und Fibroblasten), Cholesterin intrazellulär akkumulieren und dann in Schaumzellen umgewandelt werden, die maßgeblich zur Arterioskleroseentwicklung beitragen [60, 133, 169]. Doch auch diese Zellen können sich durch aktiven Transport von Cholesterin in den Extrazellularraum vor einer Überladung mit Cholesterin schützen. An diesem Prozeß sind HDL wesentlich beteiligt, da sie den Cholesterinefflux durch verschiedene Mechanismen stimulieren können. Die mögliche Bedeutung der Cholesterinefflux-Mechanismen für die zelluläre Cholesterinhomöostase konnte an konfluenten ruhenden Fibroblasten in vitro demonstriert werden. Unter diesen Bedingungen erfolgt die Aufnahme von LDL-Cholesterin fast ausschließlich Rezeptor-unabhängig durch einen selektiven Cholesterintransfer [111]. Wie bereits oben angeführt, können zwei Hauptmechanismen des HDL-induzierten Cholesterineffluxes unterschieden werden: a) der diffusionsähnliche Transport von Zellmembran-gebundenem Cholesterin durch die die Zellmembran umgebene wäßrige Phase [169, 277], sowie b) die durch spezifische Apolipoprotein-Zellinteraktion vermittelte Mobilisierung intrazellulären Cholesterins [150, 185, 198, 225, 249, 252, 293]. Der diffusionsähnliche Transport von Cholesterin erfolgt in beiden Richtungen, so daß ein Netto- Cholesterinefflux nur dann stattfindet, wenn ein Cholesteringradient zwischen Zellmembran und Cholesterin-Akzeptor (z.b. HDL) besteht [169, 170, 277]. Ausmaß und Richtung des Gradienten ist abhängig von der Cholesterinkonzentration in HDL und Zellmembran, aber auch von anderen Eigenschaften der HDL und Zellmembran wie Phospholipidzusammensetzung, Apolipoproteinzusammensetzung, Fluidität der Membranen und Radius der HDL [90, 169, 170, 171, 212, 213]. Wenn der Cholesterinakzeptor eine hohe Cholesterin- Absorptionsfähigkeit aufweist, ist die Cholesterin-Desorption von der Plasmamembran der limitierende Faktor dieses Mechanismus [169]. Die Cholesterin-Absorptionsfähigkeit der

22 Einleitung 18 HDL ist jedoch begrenzt. Sie wird durch die Cholesterinveresterung mittels LCAT erhöht, da die Cholesterinester im Kern der Lipoproteine akkumulieren und dadurch weiteres freies Cholesterin der Zellmembran in die Phospholipide der HDL-Oberfläche integriert werden kann [81]. Bei vielen bislang untersuchten Zelltypen verläuft in vitro die Desorption von Cholesterin aus der Plasmamembran über mehrere Stunden, bis eine Sättigung erreicht ist. Diese Form des Cholesterineffluxes kann auch von anderen Akzeptoren des Plasmakompartimentes, wie z.b. Albumin, induziert werden. Daher wird diese Effluxform oft auch als unspezifisch bezeichnet. Die zweite Form des Cholesterineffluxes wird durch spezifische, möglicherweise Rezeptorvermittelte Bindung an die Zelloberfläche vermittelt. Auch hier wird wieder das oben angeführte Modell zur Hilfe genommen, daß Apolipoproteine den Efflux von Cholesterin und Phospholipiden stimulieren können [12, 20, 31, 38, 109, 120, 150, 162, 185, 198, 225, 248, 249, 251, 269, 340]. Dabei induzieren Lipid-freie Apo A-I und Lipid-arme HDL-Vorläufer, s.g. prä-ß-hdl, einen Cholesterinefflux durch spezifische Interaktion zwischen dem Akzeptor und der Zellmembran [31, 342]. Im Gegensatz zu nicht spezifischen Akzeptoren (Liposomen, Phospholipid-Emulsionen und Triglyzeriden), die ausschließlich eine Cholesterin-Mobilisierung aus der Plasmamembran induzieren, bewirken Apo A-I und prä-ß- HDL nicht nur die Solubilisierung des Membrancholesterins, sondern auch die Mobilisierung des Cholesterins aus intrazellulären Pools, die im Gleichgewicht mit dem Cholsterinesterpool stehen und für das Enzym AcylCoA:Cholesterin Acyltransferase (ACAT) zugänglich sind, einem Enzym, das sich im endoplasmatischen Retikulum (ER) befindet [121, 224, 225, 249, 251, 252]. Da die Kapazität der spezifischen Akzeptoren, Cholesterin zu binden, nur gering ist, fungieren Apo A-I und prä-ß-hdl vermutlich als Shuttle zwischen der Zellmembran und größeren Partikeln wie HDL 3 [81, 120, 121, 148, 150, 185, 198, 225, 249, 251, 340]. In zahlreichen Experimenten wurde die Existenz spezifischen Cholesterineffluxes dokumentiert [248, 342]. Die kovalente Modifizierung der in HDL vorhandenen Proteine führt zu verminderter spezifischer Bindung von HDL an die Zelloberfläche und zu einer gestörten Mobilisierung intrazellulären Cholesterins, die Desorption des Membrancholesterins bleibt jedoch unverändert. Kein Apo A-I-vermittelter Efflux wurde in Zellen beobachtet, die nicht über spezifische HDL-Bindungsstellen verfügen, wie z.b. Erythrozyten. Auch eine proteolytische Behandlung von Fibroblasten, die die spezifische Bindung von Apo A-I und HDL aufhebt, hat eine Verringerung des Apo A-I-induzierten Effluxes, aber nicht des durch Gesamt-HDL induzierten Effuxes zur Folge. Probucol, ein lipidsenkendes Medikament, inhibiert den Apoprotein-induzierten Cholesterinefflux, aber nicht die Mobilisierung Cholesterins direkt aus der Zellmembran. Ähnliche Effekte wurden in Zellen beobachtet, die

23 Einleitung 19 mit Inhibitoren des intrazellulären Transportes (Monensin, Brefeldin) oder mit Toxinen des Energiestoffwechsels behandelt wurden. Diese Experimente zeigen, daß freie Apoproteine die Mobilisierung von Cholesterin aus dem ER in einem energieverbrauchenden Prozeß induzieren können. Auch Substanzen, die die intrazelluläre Signaltransduktion beeinflussen, sind in der Lage, den durch die Apoproteine induzierten Efflux zu modulieren. Analoga des zyklischen AMP induzieren Apo A-I Bindung an die Zelloberfläche und verstärken deutlich die Cholesterin-Mobilisierung aus intrazellulären Pools. Auch Inhibitoren der Protein Kinase C (PKC) hemmen die Mobilisierung von Cholesterin aus intrazellulären Pools, während die Stimulation von PKC einen gegenteiligen Effekt hat [224, 240, 313] HDL-Bindungsproteine Die Suche nach physiologisch bedeutsamen HDL-Rezeptoren auf der Zelloberfläche wurde durch unspezifische Bindungstellen erschwert, die HDL nur mit geringerer Affinität binden [108]. In letzter Zeit wurden jedoch mehrere Kandidaten für einen physiologisch wirksamen HDL-Rezeptor isoliert und teilweise bereits kloniert. Diese Bindungsproteine wurden in Nieren, Fibroblasten, Endothelzellen, Adipozyten, Hepatozyten und steroidogenem Gewebe gefunden [27, 107, 115, 140, 317]. Teilweise wurden auch zwei Proteine in einem Zelltyp gefunden [52, 317], was darauf hindeutet, daß es mehr als eine Klasse HDL-Rezeptoren gibt. Die wichtigsten sind SR-B 1 (Scavenger-Rezeptor B 1, M r = 82 kda, homolog zu CD36) [2], HBP (High density lipoprotein Binding Protein, M r = 110 kda, identisch mit Vigilin) [72, 221], und ein Protein-Dimer HB 1 und HB 2 (HDL-Bindungsproteine, M r = 120 und 100 kda. Nur HB 2 wurde bisher kloniert und ist homolog zu ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) und BEN (bursal epithelium and neurons), zwei Adhäsionsmolekülen [217]. SR-B 1 wurde zunächst als LDL-Scavenger-Rezeptor beschrieben [2], der acetylierte LDL binden kann, zeigt aber wie alle Scavenger-Rezeptoren eine breite Bindungsspezifität. Später wurde gefunden, daß SR-B 1 in LDL-Rezeptor-negativen CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary) auch HDL mit hoher Affinität bindet [103, 108] und die selektive Aufnahme von Cholesterinestern in die Zelle vermittelt. SR-B 1 ist kolokalisiert mit Plasmamembrancavaeolae und wird zusammen mit Caveolin aufgereinigt [23]. Diese Membrandomänen könnten bei dem SR-B 1 -vermittelten Lipidtransfer zwischen Zellen und Lipoproteinen eine wichtige Rolle spielen.

24 Einleitung 20 SR-B 1 kommt bei Ratten und Mäusen vor allem in der Leber, in Ovarien, adrenalen Drüsen, in geringerer Menge in Hoden und Brustdrüsen sowie in Spuren im Herzen vor [2, 193, 233, 270]. Damit stimmt das Expressionsmuster mit dem Ausmaß der Beteiligung der Gewebe an der Steroidhormonsynthese überein. HBP wurde von Graham und Oram beschrieben [140] und von McKnight et al. kloniert [221]. Die hypothetische Struktur von HBP zeigt weder klassische Transmembransequenzen, noch klar definierte zytoplasmatische oder extrazelluläre Domänen, wie sie andere Rezeptoren aufweisen. Es wird vermutet, daß HBP auf der Zelloberfläche lokalisiert ist und so HDL binden kann [108]. HB 1 und HB 2 wurden in der Rattenleber nachgewiesen. Nur HB 2 wurde bislang kloniert [72] und hat keinerlei strukturelle Ähnlichkeit mit den oben beschriebenen Rezeptoren. Es gehört zu der Immunglobulin-Superfamilie und hat Ähnlichkeiten mit den Adhäsionsmolekülen ALCAM (96 % Homologie) und BEN (70 % Homologie). Eine Transfektion verschiedener Zelltypen mit HB 2 führte zu einer 80 bis 100 %igen Steigerung der HDL-Bindung, die auf HB 2 zurückzuführen war [108]. Außerdem wird die Expression des HB 2 -Gens durch eine Cholesterinbeladung der Zellen mit acetyliertem LDL herunterreguliert [217] Mögliche andere Funktionen der HDL Die inverse Beziehung zwischen der Höhe des HDL-Cholesterinwertes im Plasma und der Inzidenz kardiovaskulärer Erkrankungen ist in zahlreichen epidemiologischen Studien bestätigt worden [18, 135]. Die mögliche Erklärung für diesen statistischen Zusammenhang, die Fähigkeit der HDL, Cholesterin aus der Arterienwand in die Leber zu transportieren, ist aus den oben beschriebenen Gründen umstritten. Es müssen daher auch andere potentiell antiatherogene Wirkungen der HDL beachtet werden. So deuten verschiedene Befunde auf eine Beeinflussung der Thrombozytenfunktion durch HDL hin [Überblick in: 76]. Eine vermehrte Thrombozytenaktivität wurde bei Personen mit niedrigen HDL-Konzentrationen nachgewiesen [39]. In vitro Studien zeigten einen inhibitorischen Effekt der HDL auf die durch starke Agonisten wie Thrombin und Kollagen induzierte Thrombozytenaggregation [21, 22, 156, 244]. HDL sind zudem in der Lage, die Bildung und Freisetzung von Thromboxan A2 in Thrombozyten zu inhibieren [34, 35]. Außerdem wurde jetzt gezeigt, daß HDL, durch eine Aktivierung von Protein C und Protein S, den Koagulationsfaktor Va inaktivieren [142].

25 Einleitung 21 Weiterhin wurde nachgewiesen, daß HDL die Synthese von Prostacyclin in arteriellen Endothelzellen stimulieren [116, 246]. Prostacyclin wirkt durch seine vasodilatierende und die Thrombozytenaggregation hemmenden Eigenschaften potentiell antiatherogen. HDL verstärken außerdem in vitro die durch Urokinase induzierte Fibrinolyse [283]. Darüber hinaus inhibieren HDL atherogene Mechanismen oxidierter LDL [257]. Die Oxidation der LDL spielt eine entscheidende Rolle für die Atherogenität dieser Lipoproteinklasse [306]. Auch die Aggregatbildung von LDL begünstigt die Aufnahme in Makrophagen und somit die Schaumzellbildung. HDL und Apolipoprotein A-I inhibieren die Bildung von LDL- Aggregaten und reduzieren dadurch den Cholesterininflux in die Intima [179]. Weiterhin stimulieren HDL das Wachstum von Endothelzellen und verhindern deren Zelltod [76], verhindern in Endothelzellen die Expression von VCAM-1, ICAM-1 und E-Selectin, Proteine, die den ersten Schritt der Arteriosklerose, die Bindung von Leukozyten an die Endothelwand, ermöglichen [75]. Eine weitere Schutzfunktion der HDL bei beginnender Arteriosklerose liegt in der Inhibition der Bildung des C5b-C9 Komplexes [144], wodurch prokoagulierende Reaktionen in Endothelzellen und Blutplättchen inhibiert werden HDL und Signaltransduktion Die bislang publizierten Daten zur HDL-induzierten Signaltransduktion deuten darauf hin, daß HDL über einen oder mehrere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren wirken. An unterschiedlichen Zelltypen konnte ein HDL-vermittelter Anstieg von zyclischem AMP (camp), Inositoltriphosphat (IP 3 ), Ca 2+ und Diacylglyzerin (DAG) beobachtet werden. DAG und IP 3 werden durch die Hydrolyse von Phosphatidylinositolbisphosphat (PIP 2 ) gebildet. Diese Hydrolyse wird durch die Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C (PI-PLC) katalysiert, die ein wichtiges Targetprotein von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist. DAG aktiviert bestimmte Isoformen der Proteinkinase C (PKC), die ihrerseits eine Vielzahl intrazellulärer Proteine phosphoryliert und somit aktiviert. IP 3 bewirkt die Freisetzung des u. a. für diese Prozesse erforderlichen intrazellulären Calciums. DAG kann auch durch Hydrolyse von Phosphatidylcholin (PC) gebildet werden, und zwar entweder direkt, durch eine PC-spezifische Phospholipase C (PC-PLC), oder indirekt über Phosphatidsäure (PA), die zunächst durch eine PC-spezifische Phospholipase D (PC-PLD) gebildet und anschließend durch eine PA-Phosphatase (PPH) in DAG umgewandelt werden kann. PA ist selbst vermutlich auch ein wichtiger Second Messenger [41].

26 Einleitung 22 Ebenfalls ein wichtiger intrazellulärer Second messenger ist zyklisches Adenosinmonophosphat (camp). Es entsteht durch das Adenylatcyclase-System, welches ebenfalls durch Bindung eines Agonisten an einen Rezeptor aktiviert wird. Bei diesem System sind sowohl aktivierende als auch inhibierende Agonisten bekannt, die jeweils über die Bindung an einen Rezeptor G-Proteine aktivieren, die dann aktivierend bzw. inhibierend auf die Adenylatcyclase wirken. Die membrangebundene Adenylatcyclase spaltet dann intracelluläres ATP in camp und Pyrophosphat. Dieses camp führt zu einer Aktivierung von campabhängigen gewebespezifischen Proteinkinasen [77], die ihrerseits andere Proteine phosphorylieren und damit aktivieren oder inaktivieren. Eine Bindung der HDL an einen Rezeptor der Zelle ist nach den bislang veröffentlichten Daten zur HDL-induzierten Signaltransduktion wahrscheinlich. Bochkov et al. zeigten nach HDL-Inkubation einen Anstieg der PI-Hydrolyse in glatten Muskelzellen [46], Drobnik et al. in Fibroblasten [96], während in Thrombozyten und Adipozyten die Hydrolyse von PC gezeigt werden konnte [240, 313]. Eine Aktivierung von Proteinkinasen durch HDL wurde zunächst in Endothelzellen nachgewiesen [4]. In späteren Untersuchungen an Adipozyten, Fibroblasten und Thrombozyten wurde beobachtet, daß insbesondere die Bindung der Apo-A-I-reichen HDL- Subfraktion HDL 3 oder Apo-A-I-haltiger in vitro hergestellter Proteoliposomen die PKC aktiviert [224, 240, 313]. An humanen Fibroblasten konnte gezeigt werden, daß die Aktivierung der PKC mit einer vermehrten Translokation intrazellulären Cholesterins zur Zellmembran einher geht [224]. Auch die Inkubation mit PKC-Aktivatoren erzeugte eine Translokation intrazellulären Cholesterins. Durch Inkubation mit PKC-Inhibitoren wurde der HDL 3 -vermittelte Cholesterin-Transport inhibiert. Der Efflux des membranösen Cholesterins auf die HDL 3 wurde hingegen weder durch PKC-Aktivatoren, noch durch PKC-Inhibitoren beeinflußt [224, 240, 313]. Diese Beobachtungen sprechen dafür, daß HDL 3 via PKC- Aktivierung Cholesterin aus intrazellulären Kompartimenten mobilisieren kann, für den Übergang von membranständigem Cholesterin auf die HDL jedoch andere Mechanismen verantwortlich sind. Apo A-I als Hauptstrukturprotein der HDL scheint entscheidend an diesen Prozessen beteiligt zu sein. So konnte in Adipozyten gezeigt werden, daß Apo-A-Ihaltige Proteoliposomen sowohl eine PC-Hydrolyse mit DAG-Freisetzung, eine PKC- Aktivierung, wie auch einen Cholesterinefflux induzieren können. Hingegen induzierten Apo- A-II-haltige Proteoliposomen diese Effekte in diesem Zelltyp nicht [313]. HDL und Apo-A-I aktivieren nicht nur PKC, sondern Apo-A-I ist zumindest in vitro selbst auch Substrat für die PKC und wird durch sie phosphoryliert [157]. Dabei kann jedoch nur freies Apo A-I phosphoryliert werden, nicht aber Apo A-I in HDL-Partikeln oder