Santa Cruz, Santa Cruz, USA. Bovines Serumalbumin, BSA, Fraktion V Serva, Heidelberg Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach. BD Biosciences, Heidelberg

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1 8 Materialien 8.1 Reagenzien Reagenzien für die Blutentnahme, Isolierung von PBMC, Magnetische Zellseparation und Durchflusszytometrie anticd 14-PerCP, # antiigg 2a -FITC, # antiigg 2a -PerCP, # antitlr 2 Santa Cruz, Santa Cruz, USA antitlr 4 Santa Cruz, Santa Cruz, USA antitlr 2-FITC Biocarta, Hamburg antitlr 4-FITC, Clone HTA 125 Biocarta, Hamburg antitlr 2 Apotech, Epalinges, CH antitlr 4 Apotech, Epalinges, CH Beriglobin, humanes Immunglobulin Chiron Behring, Marburg Bovines Serumalbumin, BSA, Fraktion V CD14 MicroBeads Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach CD19 MicroBeads Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) FACS Sheath FACS Rinse FACS Safe Ficoll-Lösung, Biocoll Separating Solution Biochrom, Berlin Liquemin N I.E. Phosphatpuffer (PBS) ohne Mg 2+ und Ca 2+ PAA Laboratories GmbH, Cölbe Propidiumjodid Sigma, Deisenhofen Reagenzien für die Stimulationen mit Pam-3-Cys und LTA sowie den TNF-α-ELISA Bovines Serumalbumin (BSA), Fraktion V Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg DuoSet ELISA, humanes TNF-α R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt Lipoteichonsäure (LTA), Staphylococcus aureus freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Professor Dr. med. R. Schumann, Institut für Mikrobiologie und Hygiene, Charité, Berlin Medium RPMI 1640 Biochrom AG, Berlin Tri-acyliertes Lipopeptid (Pam-3-Cys) EMC microcollections GmbH, Tübingen Phosphatpuffer (PBS) ohne Mg 2+ und Ca 2+ PAA Laboratories GmbH, Cölbe 86

2 Schwefelsäure, H 2 SO 4 Substratlösungen A und B Tween 20 pure R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg Reagenzien für die RNA-Extraktion, DNase-Verdau, Reverse Transkription, cdna- Quantifizierung und Gelelektrophorese 2-Hydroxyethylmercaptan (β-mercaptoethanol) Sigma, Deisenhofen 50 x TAE-Puffer Gibco BRL, Gaithersburg, USA Agarose, Ultra Pure Gibco BRL, Gaithersburg, USA AMV Reverse Transcriptase DNA-Standard, Molecular Weight Marker XIII Roche Diagnostics, Mannheim DNase I, 1U/µl Invitrogen, Mannheim Ethanol, absolut, unvergällt J. T. Baker, Griesheim Ethidiumbromid, 10 mg/ml Ultra Pure Gibco BRL, Gaithersburg, USA Oligo-dT-Primer Tib Molbiol, Berlin OliGreen ssdna Quantitation Kit Molecular Probes, Leiden, NL Omniscript Reverse Transcriptase Kit Natriumdiphosphat, Na 4 P 2 O 7 Random Primers Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor RNeasy Mini Kit RNase-Free DNase Set datp, dctp, dgtp, dttp SuperScript II RT Kit Invitrogen, Mannheim Reagenzien für die real-time-pcr Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Tween 20 Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan SureMaster LightCycler Kit Oligonukleotide TaqMan Sonden Congen Biotechnologie GmbH, Berlin BioTeZ Berlin-Buch GmbH, Berlin BioTeZ Berlin-Buch GmbH, Berlin 87

3 Tabelle 8: Oligonukleotide Gen GenBank - Nummer Toll-like Rezeptor 2 NM (TLR2) Toll-like Rezeptor 4 NM (TLR4) Toll-like Rezeptor 9 NM (TLR9) β 2 -Mikroglobulin NM (β 2 M) Glyceraldehyd-3- NM Phosphat- Dehydrogenase (GAPDH) Name des Sequenz in Länge Primers 5 3 -Richtung des Primers in bp TLR2 for GGCCAGCAAATTACCTGTGTG 21 TLR2 rev AGGCGGACATCCTGAACCT 19 TLR4 II for GCAGTGAGGATGATGCCAGGAT 22 TLR4 II rev CCCAGCTTTCTGGTCTCACG 20 TLR9 for GGACCTCTGGTACTGCTTCCA 21 TLR9 rev AAGCTCGTT GTACACCCAGTCT 22 β 2 M for GAGTATGCCTGCCGTGTG 18 β 2 M rev AATCCAAATGCGGCATCT 18 GAPDH for GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 19 GAPDH rev GAAGATGGTGATGGGATTTC 20 OdT TTTTTTTTTTTTTTT 15 Quelle [22] Primer Premier [22] [117] [117] 88

4 Toll-like Rezeptor 2 (TLR2) Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) 20 [22] NM TCCATCCCATGTGCGTGG CC 5 FAM 1 2 NM TGTCTGCCTCGCGCCTGGC 5 FAM 19 [22] NM ACGATGCCTTCGTGGTCTTCGA 5 FAM 26 [22] CAAA Tabelle 9: TaqMan Sonden Gen GenBank - Sequenz in 5 3 -Richtung Gekoppeltes Länge Quelle Nummer Fluorochrom der Sonde in bp β 2 -Mikroglobulin (β 2 M) NM CCTCCATGATGCTGCTTACATG TCTC 5 FAM 26 [117] Glyceraldehyd-3- Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) NM CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC 5 FAM 20 [117] Reagenzien für die Bestimmung von Gesamt-IgE und spezifischem IgE Phadia CAP System IgE FEIA Phadia Diagnostics, Uppsala, SWE Phadia CAP System SX1 FEIA Phadia Diagnostics, Uppsala, SWE 8.2 Materialien und Geräte Analysewaage MC1 analytic AC120S Agarosegelkammern Autoklav 24 automacs ELISA-Mikrotiterplatten, 96-Loch, Flachboden FACScan LightCycler LightCycler Glaskapillaren LightCycler Kühlblock Mikroskop Axiovert 10 Sartorius GmbH, Göttingen Bio-Rad Laboratories, München Melag Medizintechnik, Berlin Miltenyi, Bergisch Gladbach Nunc GmbH & Co KG, Wiesbaden Carl Zeiss AG, Oberkochen 1 FAM: 6-Carboxyfluorescein 2 TAMRA: 6-Carboxytetramethylrhodamin 89

5 Mikrotiterplatten Cellstar, 96-Loch, für Suspensionskulturen Mikrotiterplatten-Leser Fluoro 320 (ELISA) Mikrotiterplatten-Leser MRX (cdna) ph-meter MV 870 Plattenzentrifuge Präzisionswaage Sartorius universal Thermomixer 5436 Tischzentrifuge 5417C Trockenschrank Schüttler MTS4 Spannungsgerät Power Pac 300 Ultraviolett Transilluminator Vortexer REAX 2000 Zellzählgerät Casy 1TT Zentrifuge Minifuge RF Greiner Labortechnik, Solingen MWG Biotech, Ebersberg Dynex Technologies, Denkendorf Präcitronic, Dresden Heraeus Sepatech, Osterode/Harz Sartorius GmbH, Göttingen Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg Melag Medizintechnik, Berlin IKAWerke GmbH & Co. KG, Staufen Bio-Rad Laboratories, München UVP, Cambridge, UK Heidolph, München Schärfe System, Reutlingen Heraeus Sepatech, Osterode/Harz 8.3 Verwendete Computerprogramme CellQuest Revelation Version G.32 Excel 2000 Grab It, Version 2.0 KC 4, Kineticalc for Windows, Version 2.5 LightCycler Software, Version 3.5 PrimerPremier SPSS 10.1 für Windows Word 2000 Dynex Technologies, Denkendorf UVP, Cambridge, UK Bio-Tek Instruments, St. Quentin en Y., F Biosoft International, Palo Alto, USA 90