RIDASCREEN. Art. No.: H1601

Transkript

1 RIDASCREEN Biotin Art. No.: H1601 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) / Telefax: +49 (0)

2 1. Anwendungsbereich Für die in vitro Diagnostik. Der RIDASCREEN Biotin-Test ist ein Enzymbindungsassay im Mikrotiterplatten-Format zur quantitativen Bestimmung von Biotin (Vitamin H) in Serum oder Plasma. 2. Zusammenfassung und Erklärung des Tests Biotin, auch Vitamin H genannt, ist für die Biochemie des menschlichen Organismus von umfassender Bedeutung. Als prosthetische Gruppe mitochondrialer Enzyme (Carboxylasen) spielt Biotin als CO 2 -Überträger bei wichtigen Stoffwechselvorgängen wie Gluconeogenese, Fettsäuresynthese und Aminosäurestoffwechsel eine zentrale Rolle. Ferner hat Biotin Einfluss auf Wachstum und Erhaltung von Blutzellen, Talgdrüsen, Haut, Haar und Nägeln. Neben dem freien Biotin steht dem Körper das an Lysin gekoppelte Biotin, das sogenannte Biocytin nach Spaltung durch das Enzym Biotinidase, als Vitaminquelle zur Verfügung. Falsche und einseitige Ernährung führen ebenso zu Biotinmangelerscheinungen wie angeborene Störungen im Biotinstoffwechsel (singulärer oder multipler Carboxylasemangel, Biotinidasemangel). Darüber hinaus können Lebensumstände, bei denen erhöhter Bedarf besteht (z. B. Schwangerschaft, Stillzeit, Leistungssport, pathologische Zustände) eine Unterversorgung an Biotin bedingen. Medizinische relevante Folgen eines Biotinmangels sind verschiedene Erkrankungen an Haut, Haaren und Nägeln. Die Krankheitsbilder reichen von brüchigen splitternden Fingernägeln über verschiedene Alopezieformen bis hin zu schuppenden erythematösen und seborrhoischen Dermatitiden. Die bei durchschnittlicher Kostgewohnheit aufgenommene Menge von µg Biotin pro Tag wird sowohl von der Deutschen Gesellschaft für Ernährung (DGE) als auch von den amerikanischen Recommended Dietary Allowances (RDA) als ausreichend betrachtet. Die normalen Plasma-Biotinspiegel bewegen sich zwischen 200 und 1200 ng/l. Als optimale Plasmakonzentration an Biotin bei gesunden Menschen gelten 400 ng/l. Da diese Werte von einem zum anderen Tag um bis zu 100% schwanken können, ist eine Biotinbestimmung an zwei bis drei aufeinanderfolgenden Tagen zur sicheren Diagnose des Mangels als auch zur Verlaufskontrolle bei Substitutionstherapie ratsam. Unabhängig von der Ursache liegt ein Biotinmangel immer dann vor, wenn der Plasma- Biotinspiegel unter 100 ng/l liegt. Hier sollte in jedem Fall substituiert werden. Bei externer Biotinzufuhr werden nicht resorbierte Biotinmengen über die Faeces ausgeschieden, während resorbierte Biotinmengen, die die Speicherkapazität des Organismus überschreiten, mit dem Urin eliminiert werden. Kurz nach oraler Biotinzufuhr steigt die Biotinkonzentration im Plasma auf ein vielfaches an, erreicht nach etwa 24 h jedoch wieder einen Normalwert. In pharmakologischer Dosierung (mg-bereich) stimuliert Biotin die Differenzierung der Epidermis Zellen. Die Wirkung ist unabhängig vom Biotinstatus und beeinflusst sämtliche Keratinstrukturen, also Haut, Haare und Nägel. RIDASCREEN Biotin

3 Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass ältere Menschen mit etwa 300 ng/l einen durchschnittlich niedrigeren Biotinspiegel haben als jüngere Erwachsene und Kinder, die eher im optimalen Bereich zwischen ng/l liegen. Der quantitative Nachweis von Biotin in Serum oder Plasma mittels enzymatischen Tests ist schneller und einfacher durchzuführen als mit herkömmlichen mikrobiologischen Verfahren und Isotopenverdünnungstests. Die Proben werden unverdünnt direkt im Test eingesetzt. 3. Testprinzip Bei dem Test handelt es sich um einen kompetetiven Enzymbindungsassay, der auf der hohen Affinität zwischen Avidin und Biotin basiert. In die mit Avidin beschichtete Mikrotiterplatte werden enzymmarkiertes Biotin (Konjugat) und die Proben bzw. Biotin-Standardlösungen gegeben. Freies und enzymmarkiertes Biotin konkurrieren um die Avidinbindungsstellen. Nicht gebundenes Biotin wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Durch das Enzym wird ein farbloses Substrat (H 2 O 2 /TMB) zu einem blauen Endprodukt umgesetzt. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von Schwefelsäure beendet. Dabei erfolgt gleichzeitig ein Farbumschlag von blau nach gelb. Die abschließende Messung erfolgt in einem Photometer bei 450 nm (Referenzwellenlänge 620 nm). Die Extinktion der Lösung ist umgekehrt proportional zur Biotin-Konzentration in der Probe. RIDASCREEN Biotin

4 4. Packungsinhalt Die Reagenzien einer Packung reichen für 96 Bestimmungen (inkl. fünf Standards). Tab. 1: Packungsinhalt Plate 96 Best. 12 Mikrotiterstreifen (teilbar) im Halterahmen; beschichtet mit Avidin Diluent 18 ml Probenpuffer; Phosphat-gepufferte NaCl-Lösung (ph 7,4), gebrauchsfertig SeroWP 100 ml Waschpuffer, 10fach konzentriert; Tris-gepufferte NaCl-Lsg. Standard 1 0 ng/l Standard 2 37 ng/l Standard ng/l Standard ng/l Standard ng/l Control A schwarzer Deckel Control B schwarzer Deckel Conjugate roter Deckel 1,3 ml Standard 1; wässrige Lösung ohne Biotin, gebrauchsfertig 1,3 ml Standard 2; 37 ng/l Biotin in wässriger Lösung, gebrauchsfertig 1,3 ml Standard 3; 111 ng/l Biotin in wässriger Lösung, gebrauchsfertig 1,3 ml Standard 4; 333 ng/l Biotin in wässriger Lösung, gebrauchsfertig 1,3 ml Standard 5; 1000 ng/l Biotin in wässriger Lösung, gebrauchsfertig 1,3 ml Qualitätskontrolle A; verdünntes Humanserum, gebrauchsfertig; Biotingehalt siehe Kitbeilage 1,3 ml Qualitätskontrolle B; verdünntes Humanserum, gebrauchsfertig; Biotingehalt siehe Kitbeilage 1,3 ml biotinylierte Peroxidase (11fach konz.); in stabil. Proteinlösung SeroSC 12 ml Harnstoffperoxid, gebrauchsfertig Stop 12 ml 1 N Schwefelsäure, gebrauchsfertig Gefahrstoffangabe gemäß Kennzeichnungspflicht. Weitere Details siehe Material Safety Data Sheets (MSDS) auf RIDASCREEN Biotin

5 5. Reagenzien und ihre Lagerung Das Testkit ist bei 2 8 C zu lagern und ist auch nach dem Öffnen bis zu dem auf dem Etikett aufgedruckten Verfallsdatum verwendbar. Der verdünnte Waschpuffer ist bei einer Lagerung von 2 8 C vier Wochen, bei einer Lagerung bei Raumtemperatur (20 25 C) eine Woche haltbar. Nach Erreichen des Verfallsdatums kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Der Alu-Beutel, in dem sich die Mikrotiterplatte befindet, ist so zu öffnen, dass der Klippverschluss nicht abgetrennt wird. Nicht benötigte Mikrotiterstreifen sind im verschlossenen Alu-Beutel bei 2 8 C zu lagern. Eine Kontamination der Reagenzien ist ebenso zu vermeiden wie eine direkte Lichteinwirkung auf das farblose Substrat. 6. Zusätzlich benötigte Reagenzien erforderliches Zubehör 6.1. Reagenzien destilliertes oder deionisiertes Wasser 6.2. Zubehör Probenröhrchen Vortex Mixer Mikropipetten für µl und µl Volumina Messzylinder (1000 ml) Stoppuhr Waschgerät für Mikrotiterplatten oder Mehrkanalpipette Photometer für Mikrotiterplatten (450 nm, Referenzfilter 620 nm) Filterpapier (Labortücher) Abfallbehälter mit einer 0,5 %igen Hypochloritlösung halblogarithmisches Papier zur Erstellung der Eichkurve alternativ: Auswerteprogramm RIDA SOFT Win (Art. Nr. A9999) 7. Vorsichtsmaßnahmen Nur für die in vitro Diagnostik. Dieser Test ist nur von geschultem Laborpersonal durchzuführen. Die Richtlinien zur Arbeit in medizinischen Laboratorien sind zu beachten. Die Gebrauchsanweisung zur Durchführung des Tests ist strikt einzuhalten. Proben oder Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren. Kontakt mit verletzter Haut oder Schleimhäuten vermeiden. RIDASCREEN Biotin

6 Während des Umgangs mit Reagenzien und Proben persönliche Schutzausrüstung (geeignetes Handschuhmaterial, Kittel, Schutzbrille) tragen und nach Abschluss des Tests die Hände waschen. In Bereichen, in denen mit Proben gearbeitet wird, nicht rauchen, essen oder trinken. Weitere Details, siehe Material Safety Data Sheets (MSDS) Die im Kit befindlichen Kontrollseren (Qualitätskontrolle A und Qualitätskontrolle B) wurden auf HIV- und HCV-Ak sowie HbsAg untersucht und für negativ befunden. Dennoch sollten sie, ebenso wie die Patientenproben und alle Materialien, die mit ihnen in Berührung kommen, als potentiell infektiös behandelt und entsprechend den jeweiligen nationalen Sicherheitsbestimmungen gehandhabt werden. Alle Reagenzien und Materialien müssen nach Gebrauch sachgerecht und eigenverantwortlich entsorgt werden. Bitte beachten sie bei der Entsorgung die jeweils national geltenden Vorschriften! 8. Sammlung und Lagerung der Proben Der vorliegende Test ist geeignet für den Einsatz von Serum oder Plasma. Die Proben sollten möglichst frisch eingesetzt werden. Eine Lagerung der Serum- und Plasmaproben ist bei 2-8 C bis zu 48h möglich. Für eine längere Lagerung sollten die Proben bei -20 C aufbewahrt werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Proben ist unbedingt zu vermeiden, ebenso mikrobielle Kontamination. Die Verwendung von Hitze inaktivierten, lipämischen, hämolytischen, ikterischen oder trüben Proben kann zu verfälschten Ergebnissen führen. 9. Testdurchführung 9.1. Allgemeines Vor Verwendung sind alle Reagenzien und die Mikrotiterstreifen auf Raumtemperatur (20 25 C) zu bringen. Die Mikrotiterstreifen sind erst nach Erreichen der Raumtemperatur dem Alu-Beutel zu entnehmen. Die Reagenzien sind unmittelbar vor der Verwendung gut zu mischen. Nach dem Gebrauch ist das Kit sofort wieder bei 2 8 C zu lagern. Es sollte nur soviel Reagenz entnommen werden, wie für die Durchführung des Tests benötigt wird. Überschüssiges Reagenz darf nicht in die Gefäße zurückgegeben werden, da dies zu einer Kontamination führen kann. Die Mikrotiterstreifen können nicht mehrfach verwendet werden. Reagenzien und Mikrotiterstreifen dürfen nicht verwendet werden, wenn die Verpackung beschädigt ist oder die Gefäße undicht sind. Reproduzierbare Ergebnisse hängen in starkem Maße vom genauen Pipettieren, Einhalten der Inkubationszeiten und -temperatur sowie vom gleichmäßigen Waschen der Mikrotiterstreifen ab. RIDASCREEN Biotin

7 Direkte Sonneneinstrahlung ist während der Durchführung des Testes zu vermeiden. Es wird empfohlen die Mikrotiterplatte abzudecken Verdünnung des Konjugates Das Konjugat liegt als Konzentrat vor. Vor der Entnahme ist das Konjugat vorsichtig zu mischen. Da die gebrauchsfertige Verdünnung nur begrenzt haltbar ist, sollte immer nur soviel Konjugat verdünnt werden, wie gerade benötigt wird. Hierfür wird das Konzentrat mit dem Verdünnungspuffer 1:11 verdünnt. Tabelle 2: Herstellung der gebrauchsfertigen Konjugatlösung Mikrotiterstreifen Konjugat (Konzentrat) Verdünnungspuffer µl 200 µl 300 µl 400 µl 500 µl 600 µl 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 9.3. Herstellung des Waschpuffers 1 Teil des Waschpuffer-Konzentrates SeroWP wird mit 9 Teilen destillierten Wassers gemischt. Hierfür werden 100 ml des Konzentrates in einen 1000 ml Standzylinder gegeben und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Eventuell im Konzentrat vorhandene Kristalle sind vorher durch Erwärmen (Wasserbad bei 37 C) zu lösen. Der verdünnte Waschpuffer ist bei einer Lagerung von 2 8 C vier Wochen, bei einer Lagerung bei Raumtemperatur (20 25 C) eine Woche haltbar Erste Inkubation Nach dem Einstecken einer ausreichenden Zahl von Kavitäten in den Halterahmen werden jeweils 50 µl der Standards, der Kontrollseren sowie der unverdünnten Proben in die entsprechenden Kavitäten pipettiert und 30 min bei Raumtemperatur (20 25 C) inkubiert. Zur Verbesserung der Präzision empfehlen wir eine Testdurchführung in Doppelbestimmung. Achtung! Die Kontrollseren sind auf einen Chargen-spezifischen Wert eingestellt. Sie dürfen nicht bei Testkits mit anderer Chargennummer verwendet werden. Standards und Kontrollseren sind gebrauchsfertig. RIDASCREEN Biotin

8 9.5. Zweite Inkubation Zum ersten Inkubat werden jeweils 50 µl verdünntes Konjugat Conjugate (siehe Punkt 9.2.) hinzu pipettiert und für weitere 30 min bei Raumtemperatur (20 25 C) inkubiert Waschen Die Kavitäten sollten in einen Abfallbehälter mit Hypochloritlösung zur Desinfektion entleert werden. Danach wird die Platte auf saugfähigem Papier ausgeklopft, um die Restfeuchtigkeit zu entfernen. Anschließend wird dreimal mit jeweils 250 µl Waschpuffer gewaschen. Dabei ist nach jedem Waschgang für eine komplette Entleerung durch Ausklopfen auf einer unbenutzten Stelle des Papiers zu sorgen. Bei Verwendung eines Waschautomaten ist auf die korrekte Einstellung des Gerätes auf den verwendeten Plattentyp zu achten. Nach dem Waschen sollte die Platte auf saugfähigem, sauberem Papier ausgeklopft werden, um die Restfeuchtigkeit zu entfernen Dritte Inkubation Jeweils 100 µl Substrat SeroSC werden nacheinander in die Kavitäten pipettiert. Zum Mischen der Reagenzien wird die Platte vorsichtig kurz geschüttelt und anschließend 30 min bei Raumtemperatur (20 25 C) im Dunkeln inkubiert. Danach wird die Reaktion durch Zugabe von jeweils 100 µl Stopplösung Stop beendet. Die Extinktion der Proben wird bei 450 nm gemessen (optional: Referenzfilter 620 nm). Der Nullabgleich erfolgt gegen Luft. Die Messung sollte innerhalb von 60 min nach dem Abstoppen erfolgen. 10. Qualitätskontrolle - Anzeichen für Reagenzienverfall Für die Qualitätskontrolle sind bei jeder Testdurchführung die Standards und die Qualitätskontrollen mitzuführen. Der Test ist korrekt verlaufen, wenn der ermittelte Biotingehalt der Qualitätskontrollen den Vorgaben entspricht. Der Lot-spezifische Gehalt ist auf dem der Packung beiliegenden Datenblatt vermerkt. Eine Abweichung in Höhe der auf dem Datenblatt angegebenen Abweichung ist tolerabel. Zusätzlich muss der Extinktionsmittelwert von Standard 1 bei 450 nm größer 0,6 sein. Eine Abweichung von den geforderten Werten sowie eine Reagenzientrübung oder Blaufärbung des Substrates vor Zugabe in die Kavitäten können ein Hinweis auf einen Reagenzienverfall sein. RIDASCREEN Biotin

9 Sollten die vorgegebenen Werte nicht erfüllt sein, ist vor einer Testwiederholung folgendes zu überprüfen: Haltbarkeit der verwendeten Reagenzien Funktionsfähigkeit der eingesetzten Geräte (z. B. Kalibrierung) Korrekte Testdurchführung Visuelle Kontrolle der Kitkomponenten auf Kontamination oder Undichtigkeit; ein bläulich gefärbte Substratlösung darf nicht mehr verwendet werden Sind nach Testwiederholung die Bedingungen wiederum nicht erfüllt, wenden Sie sich bitte an den Hersteller. 11. Auswertung und Interpretation Ermittlung des Biotingehaltes der Patientenproben Zunächst werden die Extinktionsmittelwerte der Doppelbestimmungen berechnet. Danach werden die Werte der Standards (2-5), der Kontrollen bzw. der Patientenproben durch den Wert von Standard 1 (Nullstandard) dividiert und mit 100 multipliziert. Der Nullstandard wird somit gleich 100% gesetzt und die Extinktionswerte werden in Prozent angegeben. % Extinktion = Extinktion Standard (2-5) bzw. Probe Extinktion Standard 1 x 100 Die so errechneten %-Werte für die Standards werden in einem halblogarithmischen Koordinatensystem gegen die Konzentration der Biotin-Standards (ng/l) aufgetragen. Die Eichkurve sollte im Idealfall im Bereich von Standard 2-4 annähernd linear verlaufen. Die Biotinkonzentration (ng/l) der verdünnten Patientenproben kann aus der Eichkurve abgelesen werden Befundinterpretation Tab. 3: Bewertung des Biotingehaltes Biotinkonzentration Interpretation < 100 ng/l behandlungsbedürftiger Biotinmangel ng/l suboptimale Biotinversorgung > 250 ng/l ausreichende Biotinversorgung RIDASCREEN Biotin

10 12. Grenzen der Methode Da der Biotinspiegel einer Person von Tag zu Tag um bis zu 100% schwanken kann, ist eine Bestimmung an zwei bis drei aufeinander folgenden Tagen sowohl zur sicheren Diagnose eines Biotinmangels als auch bei Verlaufskontrollen während einer Biotintherapie (orale Substitution) ratsam. Kurz nach oraler Biotinzufuhr steigt die Biotinkonzentration im Plasma auf ein Vielfaches an. Deshalb sollte die Probennahme im nüchternen Zustand erfolgen. 13. Leistungsmerkmale Die normalen Plasma-Biotinspiegel bewegen sich laut Literatur zwischen 200 und 1200 ng/l. Als optimale Plasmakonzentration an Biotin gelten bei gesunden Menschen 400 ng/l. In diesem Bereich liegen auch die Messwerte des Enzymbindungsassays. In einer Untersuchung an der Friedrich-Schiller-Universität Jena mit dem RIDASCREEN Biotin-Test konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass in Abhängigkeit vom Alter unterschiedliche Biotinspiegel im Plasma gemessen werden können. Wurde in dieser Untersuchung bei Kindern und jüngeren Erwachsenen eine mittlere Biotinkonzentration von über 400 ng/l gemessen, so lag diese bei älteren Menschen mit durchschnittlich 270 ng/l signifikant niedriger. Tab. 4: Biotinkonzentration im Plasma in Abhängigkeit vom Alter (nach Helbich-Endermann, 1999) Biotinkonzentration [ng/l] im Plasma Kinder n = 20; Jahre Erwachsene n = 35; Jahre Senioren n = 33; Jahre 420 ± ± ± 100 Die Kreuzreaktivität des Tests wurde mit strukturell ähnlichen Substanzen untersucht. Es zeigte sich, dass mit Ausnahme des Biocytins (proteingebundenes Biotin) die anderen Biotinähnlichen Substanzen keine deutliche Kreuzreaktion im Test hervorrufen. RIDASCREEN Biotin

11 Tab. 5: Kreuzreaktivität (nach Helbich-Endermann, 1999) Substanz Kreuzreaktivität (%) Biotin Biocytin Biotin-d-sulfoxid Biotin-l-sulfoxid* Biotinsulfon Bisnorbiotin ,7 24,5 28,2 5,5 *Biotin-l-sulfoxid ist kontaminiert mit 3,3 % Biotin und einer nicht quantifizierten Menge Biotin-d-sulfoxid Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit von Testergebnissen wurde die Intra- und Inter-Assay- Variation ermittelt. Tab. 6: Inter-Assay-Varianz (n=15) Inter-Assay-Varianz ng/l VK Serum 1 249,1 8,6 % Serum 2 188,8 13,6 % Serum 3 67,8 13,1 % Serum 4 63,7 17,2 % Tab. 7: Intra-Assay-Varianz (n=20) Intra-Assay-Varianz ng/l VK Serum 1 222,1 7,5 % Serum 2 177,0 7,6 % Serum 3 122,4 8,0 % Serum 4 52,1 13,3 % RIDASCREEN Biotin

12 Eine Probe wurde mit Probenverdünnungspuffer verdünnt und gemessen. Die Ergebnisse der Wiederfindung sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt. Tab. 8: Wiederfindung in einer verdünnten Probe Verdünnung Gemessen [ng/l] Soll [ng/l] Wiederfindung [%] Unverdünnt > :2 > :4 > :8 847,1 847,1-1:16 386,9 423,6 109,5 % 1:32 188,6 211,8 112,3 % 1:64 102,9 105,9 102,9 % 1:128 53,5 53,0 99,1 % RIDASCREEN Biotin

13 Literatur 1. Baker, H., O. Frank, V. B. Matovitch, I. Pasher, S. Aaronson, S.H. Hunter, H. Sobotka: A new assay method for Biotin in blood, urine and tissue. Anal. Biochem. 3: (1962a) 2. Baker, H. and H. Sobotka: Microbiological assay methods for vitamins. Advances in Clinical Chemistry 5: (1962b) 3. Barlow, G. B., J.A. Dickerson, A.W. Wilkinson: Plasma biotin levels in children with burns and scalds. J. clin. Path. 29:58-59 (1976) 4. Bell, J. G.: Microbiological assays of vitamins of the B group in foodstuffs. Laboratory Practice 5/1974 pp (1974) 5. Bhullar, R.P., S.H. Lie, K. Dakshinamurti: Isotope dilution assay for biotin. Annals of the New York Academy of Science 447: (1985) 6. Bitsch, R., I. Salz, D. Hötzel: Biotin Assessment in foods and body fluids by a protein binding assay. Internat. J. Vit. Nutr. Res. 59: (1989a) 7. Bitsch, R., I. Salz, D. Hötzel: Studies on Bioavailability of oral biotin doses for humansinternat. J. Vit. Nutr. Res. 59: (1989b) 8. Bonjour, J.P.: Biotin in Man s Nutrition and Therapy - a Review. Internat. J. Vit. Nutr. Res. 47: (1977) 9. Bonjour, J.P.: Biotinin: Handbook of Vitamins II. Series: Food Science (Marcel Dekker, Inc.); ISBN X p (1984) 10. Colombo, V.E., F. Gerber, M. Bronhofer, G. L. Floersheim: Treatment of brittle fingernails and onychoschizia with biotin: Scanning electron microscopy. J. American Academy of Dermatology 23: (1990) 11. Dakshinamurti, K., L. Allan: Isotope Dilution Assay for Biotin: Use of 3H Biotin. Methods in Enzymology, 62: Escher, F.B. Guggenbühl Gasser: Stabilität von Vitaminen bei der Verarbeitung von Lebensmitteln. Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg. 83: (1992) 13. Floersheim, G. L.: Prüfung der Wirkung von Biotin auf Haarausfall und Haarqualität. Z. Hautkr. 67: (1992) 14. Fritsche, A.: Biotin verändert das Zytokeratinmuster von kultivierten Keratozyten. Inaugural Dissertation. Universität Zürich (1990) 15. Glättli, H.R., J. Pohlenz, K. Streiff, F. Ehrensperger: Klinische und morphologische Befunde beim experimentellen Biotinmangel. Zbl. Vet. Med. A. 22: (1975) 16. Guilarte, T. R.: Measurement of Biotin levels in human Plasma using a radiometricmicrobiological assay. Nutrition Reports International. Vol. 31 pp (1985) 17. Helbich, M.: Vergleichende Untersuchung zur Biotinkonzentration in verschiedenen Probenmaterialien (Plasma, Serum mit und ohne Gerinnungsförderer gewonnen) mittels ELISA. Universität Jena (1995) RIDASCREEN Biotin

14 18. Helbich-Endermann, M.: Untersuchungen zur Biotinversorgung beim Menschen und zum Biotingehalt in Lebensmitteln. Universität Jena (1999) 19. Horsburgh, T., D. Gompertz: A protein-binding Assay for Measurement of Biotin in physiological Fluids. Clinica Chimica Acta 82: (1978) 20. Kien, C.L., E. Kohler, S.I. Goodman, S. Berlow, R. Hong, S.P. Horowitz, H. Baker: Biotinresponsive in vivo carboxylase deficiency in two siblings with secretory diarrhea receiving total parenteral nutrition. J. of Pediatrics. Vol 99: (1981) 21. Komai, M., H. Fukasawa, Y. Furukawa, S. Kimura: Metabolic Characteristics of primary Biotin Deficiency established in germfree Mice. Microbiology and Therapy 20: (1990) 22. Mock, D.M., D.L. Baswell, H. Baker, R.T. Holman, L. Sweetman: Biotin deficiency complicating parenteral alimentation: Diagnosis, metabolic repercussions, and treatment. J. of Pediatrics 106: (1985) 23. Mock, D.M., D.B. Dubois: A Sequential, Solid-Phase Assay for Biotin in Physiologic Fluids that Correlates with Expected Biotin Status. Analy. Biochem. 153: (1986) 24. Mock, D.M.: Skin Manifestations of Biotin Deficiency. Seminars in Dermatology 10: (1991) 25. Phillips, N. F.B., M.A. Snoswell, A. Chapman-Smith, D.B. Keech, J.C. Wallace: Isolation of Carboxyphosphate Intermediate and the Locus of AcetlyCoA Action in the Pyruvate Carboxylase Reaction. Biochemistry 31: (1992) 26. Sanghvi, R.S., R.M. Lemons, H. Baker, J.G. Thoene: A simple method for determination of plasma and urinary biotin. Clinica Chimica Acta 124: (1982) 27. Schulze J., H. Scherf: Klinische Studie zur Therapie mit Biotin beim Pferd. Tierärztl. Umschau 44: (1989) 28. Sydenstricker, V.P., S.A. Singal, A.P. Briggs, N.M. DeVaughn, H. Isbell: Preliminary observations on egg white injury in man and its cure with a Biotin concentrate. JAMA 118: (1942) RIDASCREEN Biotin