Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen. durch Advanced Glycation Endproducts -

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1 Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch Advanced Glycation Endproducts - Implikationen für die Pathogenese der Alzheimer schen Demenz Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Claudia Loske aus Marl Würzburg 2000

2 Inhaltsverzeichnis Seite Zusammenfassung... 1 Summary Einleitung Material und Methoden 2.1. Material Methoden. 1. Herstellung von AGEs Dünnschichtchromatographie zum Nachweis von Sacchariden Endotoxin-Test Entfernen von Endotoxin mit Polymyxin B Proteinbestimmung Fluoreszenzmessungen Messung der Radikalproduktion von AGEs durch Reduktion von Cytchrom c Bestimmung des CML Gehalts von AGEs durch kompetitiven ELISA Inkubation von βa4 mit Zuckern und Übergangsmetall-ionen Einbau von [ 14 C]-Zuckern in βa Nachweis von βa4-age und Größenbestimmung von βa4-oligomeren durch FPLC Zellkultur Herstellung von Zellkulturmedium Zelllinien allgemeine Zellkulturtechniken Bestimmung der Zellzahl Einfrieren und Auftauen von Zellen Zytotoxizitätstests MTT-Assay LDH-Assay Neutralrot-Assay Glukose-Bestimmung mittels GOD-PAP-Methode Laktatbestimmung Glutathionbestimmung ATP-Messung I

3 18. Nachweis Thiobarbitursäure-reaktiver Substanzen Gelretardationsexperimente (EMSA) Herstellung von Kernextrakten Bindungsreaktion Kompetitionsexperimente Markierung der Sonde RNA-Isolation mit Trizol-Reagenz DNAse-Verdau RT-PCR SDS-PAGE Westernblot Digitoninlyse von Zellen zum Nachweis von Cyt c FACS-Färbungen sonstige Puffer und Lösungen Geräte Software Ergebnisse 1. Einfluss von AGEs auf die Vernetzung von βa Vernetzung und Glykierung von βa Abhängigkeit der βa4-vernetzung vom Inkubationspuffer Untersuchungen zu Reaktionsmechanismus und -Kinetik der βa4-vernetzung durch Einbau von [ 14 C]-Zuckern Beschleunigung der Amyloidvernetzung durch Übergangsmetalle Auftrennung der βa4-aggregate über FPLC Inhibition der Peptidvernetzung durch Metallchelatoren und Antioxidantien Zytotoxizität von "Advanced Glycation Endproducts" 2.1. Herstellung und Charakterisierung verschiedener Protein-AGEs Direkte Toxizität von AGEs Toxizität von BSA- und Ovalbumin-AGEs Dosis-Zeit-Abhängigkeit der Toxizität Zeitverlauf der AGE-Bildung Toxizität von βa4(1-40) und βa4-age Abschwächung der AGE-Toxizität Antioxidantien, Radikalfänger und Stoffwechselintermediate Abschwächung der Toxizität von βa4 und βa4-age durch α-liponsäure Zytoprotektion durch Blockieren von RAGE Nachweis von RAGE (receptor of AGEs) in SH-SY5Y Zellen II

4 Abschwächung der AGE-Toxizität durch Inkubation der Zellen mit RAGE-antisense-Oligos Abschwächung der AGE-Toxizität durch RAGE-Antikörper Kombination von Antioxidantien und RAGE-Antikörpern Toxizität von Methylglyoxal Protektion gegen Methylglyoxal-vermittelte Toxizität Aktivierung von NFκB durch AGEs Nachweis von TBARS in AGE-gestressten Zellen Verringerung der Bildung von TBARS durch Antioxidantien und andere Substanzen Glutathiongehalt von Zellen unter AGE-Stress Veränderungen im Glutathionspiegel BSA-AGE gestresster Zellen Veränderungen des Thiolstatus durch βa4 und βa4-age Wiederherstellung des Thiolstatus durch Antioxidantien Untersuchungen zur Art des AGE-vermittelten Zelltods Annexin-Fluorescein-Färbungen Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma Spaltung von PARP Untersuchungen zum Energiestatus AGE-behandelter Zellen 7.1. ATP-Gehalt AGE-gestresster Zellen ATP-Depletion durch BSA-AGE ATP-Depletion durch βa4 und βa4-age Änderungen im Glukoseverbrauch durch AGE-Stress Effekt von BSA-AGE Effekt von βa4 und βa4-age Laktatausschüttung unter AGE-Stress Effekt von BSA-AGE Effekt von βa4 und βa4-age Abschwächung der ATP-Depletion und Normalisierung der Glukoseaufnahme und Laktatausschüttung Effekt von (R+) α-liponsäure und 17β-Estradiol Andere Antioxidantien und Pyruvat Normalisierung der Glukoseaufnahme Normalisierung der Laktatausschüttung Überblick Diskussion Literatur Anhang Abkürzungen III

5 Formeln Publikationsliste IV

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