Die Connexine Cx33 und Cx43 werden in der Retina der Ratte tageszeitlich reguliert

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1 Aus dem Institut für Funktionelle und Klinische Anatomie der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Die Connexine Cx33 und Cx43 werden in der Retina der Ratte tageszeitlich reguliert Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz vorgelegt von Alexander Nikolaus Wengert aus Heidelberg Mainz,

2 1 EINLEITUNG UND ZIEL DER DISSERTATION 1 2 LITERATURDISKUSSION Aufbau der Säugetierretina Mikroskopischer Aufbau der Retina Zelluläre Organisation der Retina Das vertikale System Das laterale System Retinales Pigmentepithel Gliazellen der Retina Der circadiane Schrittmacher der Retina Aufbau und Funktion der gap junctions Funktion und Lokalisation der untersuchten Connexine in der Retina Cx35/Cx36 im cone pathway Cx35 ist an Horizontalzell-Dendriten im Bereich von Ribbon- Synapsen lokalisiert Cx35/Cx36 und Cx45 im rod pathway Klassischer rod pathway (ON1/OFF1) Sekundärer rod pathway (ON2/OFF2) Tertiärer rod pathway (OFF3) Cx36 und Cx45 in retinalen Ganglienzellen Cx43 und Cx45 in den Gliazellen der Retina Cx43 in den retinalen Pigmentepithelzellen Cx33 und Cx46 wurden in der Retina noch nicht nachgewiesen Die licht- und uhrengesteuerte Dynamik der retinalen Zellkopplung Die Transkript- und Proteinexpression der Connexine unterliegt einer lichtabhängigen und circadianen Kontrolle Die posttranslationale Modifikation der Connexine wird circadian über Dopamin reguliert 25

3 2.5.3 Die posttranslationale Modifikation der Connexine wird durch die äußeren Lichtbedingungen reguliert Die Dynamik des Horizontalzell-Netzwerkes Die Dynamik des Netzwerkes von amakrinen Zellen und Ganglienzellen Das Umgebungslicht reguliert die Kopplung von Horizontalzellen und amakrinen Zellen durch Stickoxide 29 3 MATERIAL UND METHODEN Material Versuchstiere und Haltung Geräte Verbrauchsmaterialien Chemikalien Pufferlösungen Kits Software Primer Antikörper Methoden Überblick über den Versuchsaufbau Gewinnung der Retinapräparate Untersuchungen mittels Real-time PCR HOPE-Fixation und Einbettung der Retinae Herstellung der Retina-Dünnschnittpräparate Entparaffinierung Färbung Herstellung der Gesamtretinaproben Gewinnung der Photorezeptorzellproben mit Hilfe der LMPC-Technik Prinzip der LMPC-Technik Anwendung der LMPC-Technik 46

4 RNA-Extraktion Reverse Transkription cdna-quantifizierung mit Hilfe der Real-time PCR SYBR Green I und C-rWert Schmelzkurvenkontrolle Herstellung der Primerlösungen Herstellung der Standardverdünnungen Quantifizierung der cdna-proben mit der Real-time PCR Untersuchungen mittels Westernblot Homogenisierung der Retinae und Proteinisolation Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford Proteinseparation mittels Gelelektrophorese Blotting Blocken und Antikörperinkubation mit Anti-Cx Übertragung auf Röntgenfilm Strippen der PVDF-Membran Blocken und Antikörperinkubation mit anti-aktin Densitometrie Statistische Auswertung Statistische Auswertung der PCR-Ergebnisse Statistische Auswertung der Westernblot-Ergebnisse 65 4 ERGEBNISSE Übersicht über die Experimente Absolute Expression der Gene in Gesamtretinapräparaten und Photorezeptorzellen Tageszeitliche Profile der Transkriptmengen Transkriptexpression in Gesamtretinapräparaten unter Licht/Dunkel- Bedingungen Transkriptexpression in Gesamtretinapräparaten unter Dauerdunkel- Bedingungen 72

5 4.3.3 Transkriptexpression in isolierten Photorezeptorzellen unter Licht/Dunkel-Bedingungen Tageszeitliches Profil der Cx43-Immunreaktivität Proteinexpression in Gesamtretinapräparaten unter Licht/Dunkel- Bedingungen 75 5 DISKUSSION Die Transkriptexpression des Referenzgens Aa-nat steht unter circadianer Kontrolle Die Transkriptexpression von Cx43 wird in der Retina lichtabhängig reguliert Die Transkriptexpression von Cx33 wird circadian reguliert Die Cx36- und Cx45-Transkriptexpression unterliegt keiner tageszeitlichen Rhythmik Die Cx46-Transkriptexpression unterliegt keiner tageszeitlichen Rhythmik 90 6 ZUSAMMENFASSUNG 92 7 LITERATURVERZEICHNIS 94 8 ANHANG Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Rohdaten 112 LEBENSLAUF 124 IV