Einsatz neuer DC-Techniken (VideoStore) zur Dokumentation von Phytopharmaka am Beispiel Baldrian

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1 Diplomarbeit in pharmazeutischer Biologie Einsatz neuer DC-Techniken (VideoStore) zur Dokumentation von Phytopharmaka am Beispiel Baldrian bei der Firma in Muttenz eingereicht von: Andreas Schmid

2 HPTLC Baldrian A. Schmid Betreuung der Arbeit durch: Prof. Dr. Beat Meier; Zeller, Romanshorn / Universität Basel Dr. Eike Reich; CAMAG, Muttenz Regina Bruggisser; Universität Basel Basel, den 19.Juli 2000 Andreas Schmid Titelbild: CAMAG Videosystem mit Reprostar, Videokamera und Computer mit Software 2

3 A. Schmid HPTLC Baldrian Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung Aufgabenstellung Einleitung Baldrian Bekannte (HP)TLC Verfahren für Baldrian Ph.Helv Ph.Eur NF 19 (valerian und powdered valerian) NF 19 (powdered valerian extract) Methode Chromatographie Dünnschichtchromatographie (DC) HPTLC Einflussfaktoren in der HPTLC Stationäre Phase Mobile Phase Gasphase Luftfeuchtigkeit Kammertyp Probenaufbereitung und Probenauftragung Material und Methoden verwendete Geräte Extraktion Auftragen Entwickeln Derivatisieren Auswertung HPTLC-Platten Reagenzien Lösungsmittel Reagenzien zur Detektion Referenzsubstanzen Untersuchungsmaterial Extraktion optimierte SOP zur Entwicklung der HPTLC-Platten für Fingerprint-Auswertung

4 HPTLC Baldrian A. Schmid 6. Resultate Laufmittel Vorversuche Optimierung Kammertyp Derivatisierung Für Aufnahmen im sichtbaren Licht Für Aufnahmen im UV-Bereich Aufnahme Plattenposition Bildfarbe Auswertung Videosystem: Test auf Reproduzierbarkeit Reproduzierbarkeit des DC-Systems Konsistenz des Fingerprintbereiches über die Zeit Diskussion Referenzen Dank Anhang...43 Anhang Anhang Anhang Anhang Anhang

5 A. Schmid HPTLC Baldrian 1. Zusammenfassung Das Ziel der vorliegenden Arbeit war herauszufinden, ob mittels HPTLC-Fingerprintanalyse die Stabilität von Baldrian-Trockenextrakten überprüft werden kann. Zu diesem Zweck musste ein stabiles und robustes DC-System basierend auf instrumenteller HPTLC entwickelt werden. Da sich die Methoden der Pharmakopöen als nicht robust erwiesen, wurde ein eigenes Laufmittelsystem bestehend aus Chloroform und Ethylacetat entwickelt. Um die Detektierbarkeit der polaren Hydroxyvalerensäure zu garantieren wurde dem Laufmittel Propanol beigefügt. Für optimale Trennung der Substanzen wurden die eingesetzten Extrakte bandenförmig auf die HPTLC-Platten (Silicagel 60 F254; Merck) gesprüht. Diese wurden in Doppeltrogkammern mit Kammersättigung entwickelt. Als Referenz- bzw. Markersubstanzen wurden drei Valerensäuren eingesetzt. Die Stabilitätsprüfungen wurde mit Chloroform-Ethylacetat-Propanol (6:4:0,4) als Laufmittel durchgeführt. Die Chromatogramme wurden durch Tauchen in Schwefelsäure (15% in Methanol) derivatisiert. Dieses System ist in Bezug auf Rf-Werte und Farbe der Fingerprints reproduzierbar. Die Chromatogramme wurden mit Videotechnologie (CAMAG VidoeStore) dokumentiert. Die entstandenen Bilder wurde mittels Video-Densitometrie gescannt (CAMAG VideoScan- Software) und die resultierenden Fingerprintkurven verglichen. Die chromatographischen Resultate für drei Baldrian-Trockenextrakte auf 16 HPTLC-Platten wurden verglichen. Die mit Video-Densitometrie ermittelten Rf-Werte wichen um weniger als 5% von einander ab. Die Fingerprints waren von Platte zu Platte reproduzierbar. Diese Resultate lassen den Schluss zu, dass sich das System zur qualitativen Stabilitätsprüfung von Baldrian-Trockenextrakte voraussichtlich eignet. 2. Aufgabenstellung Die Dünnschichtchromatographie hat ihren festen Platz in der Analytik pflanzlicher Arzneimittel, insbesondere in der qualitativen Prüfung. Bisher war jedoch die Dokumentation ein grosser Schwachpunkt des Verfahrens, da es mit photographischen Techniken sehr schwierig ist, über die Zeit konstante Bilder zu erhalten, auch wenn solche von Auge wahrgenommen werden. Mit der Video-Technologie besteht die Voraussetzung, dass dies geändert werden kann. Dazu fehlen allerdings die Belege. Am Beispiel von Baldrianextrakten soll geprüft werden, ob das vorliegende System (CAMAG VideoStore) benützt werden kann, um anhand von Fingerprintchromatogrammen die Qualität von Extrakten über die Zeit zu dokumentieren. Dazu sind stabile und reproduzierbare DC- Methoden unerlässlich. Die meisten Methoden insbesondere jene der Arzneibücher sind diesbezüglich nicht optimiert. Gelingt dies, könnte in Zukunft die DC vermehrt für Stabilitätsprüfungen eingesetzt werden. Regelmässige Messungen sind miteinander zu vergleichen und die Aussagen zu bewerten. 5

6 HPTLC Baldrian A. Schmid 3. Einleitung 3.1. Baldrian Die heute wohl bekannteste Wirkung von Baldrian (Valeriana officinalis L., s.l.; Abbildung 1) die Sedation ist noch gar nicht so lange etabliert (seit dem 18. Jahrhundert). Früher wurden der Baldrianwurzel (d.h. eigentlich allen unterirdischen Organen der Pflanze) vor allem spasmolytische, diuretische und analgetische Eigenschaften nachgesagt (Bodesheim 1996). Baldrian ist von der ehemaligen Kommission E mit den Anwendungsgebieten Unruhezustände, sowie nervös bedingte Einschlafstörungen positiv monographiert worden. Ebenso existiert eine Monographie der ESCOP (therapeutic indications: tenseness, restlessness and irritability and difficulty in falling asleep). Bis heute ist, trotz intensiver Forschung nicht klar, welches der aktive Inhaltsstoff ist bzw. welches die aktiven Inhaltsstoffe sind. Es liegt mit der Baldrianwurzel also ein eigentliches Phytopharmakon vor, bei welchem die ganze Mischung der Inhaltsstoffe für die Wirkung verantwortlich ist. (Upton 1999) Die Pflanze gehört zu der Familie der Valerianaceae, welche einige Unterfamilien und diverse Species beinhaltet. Abbildung 1: historische Abbildungen von Baldrian In der europäischen Pharmakopöe (Ph. Eur. 3) wird die Wurzel von V. officinalis monographiert. Die schweizerische Pharmakopöe (Ph. Helv. 8) kennt dazu noch die 6

7 A. Schmid HPTLC Baldrian Baldriantinktur, welche durch Perkolation der pulverisierten Baldrianwurzel mit etwa 70% Ethanol (750 g EtOH 96% g H2O) erhalten wird. Im NF 19 (National Formulary, USA) wird Baldrian als Valerian (unterirdische Teile der Pflanze) und Powdered valerian monographiert. Überdies existiert eine Monographie für Powdered valerian extract. Inhaltsstoffe sind eine ganze Anzahl bekannt: Valerensäuren H H O O H HO H COOH Valerensäure COOH Acetoxyvalerensäure COOH Hydroxyvalerensäure Valepotriate (0,5 2 %) wie Valtrat, Didrovaltrat Ätherisches Öl (hauptsächlich Ester des Borneol) Alkaloide, Lignane Die Valerensäuren sind spezifisch für Valeriana officinalis (Hänsel und Schulz 1982) und in der Wurzel in adäquaten Mengen (0,05 0,9%; Bos 1997) vorhanden, so dass sie chromatographischen Verfahren zugänglich sind. Aus diesem Grund sind sie als Markersubstanzen beliebt; sie werden deshalb auch zur Standardisierung von Baldrianzubereitungen herangezogen Bekannte (HP)TLC Verfahren für Baldrian Ph.Helv. 8 Die Tinktur wird eingeengt und mit Kaliumhydroxid-Lösung versetzt. Diese Mischung wird mit Dichlormethan extrahiert. Die wässrige Phase wird erwärmt, wieder abgekühlt, anschliessend angesäuert und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in wenig Dichlormethan aufgenommen. Die Chromatographie erfolgt über eine Strecke von 10 cm mit einer Mischung aus 30 Teilen Ethylacetat und 70 Teilen Hexan. Nach dem Verdunsten der mobilen Phase wird mit Anisaldehyd Reagenz besprüht und im Tageslicht ausgewertet. Als Referenzsubstanzen werden Juglon R50 und Fluorescein R50 eingesetzt. Das Juglon ergibt nach der Derivatisierung eine dunkelviolette Bande, welche etwas oberhalb der violetten Bande der Valerensäure liegt; das Fluorescein wird bei der Derivatisierung gelb und ist etwa auf der selben Höhe wie die blaue Bande der Hydroxyvalerensäure. 7

8 HPTLC Baldrian A. Schmid Ph.Eur. 3 Die Droge wird pulverisiert und in Methanol aufgeschlämmt. Während 15 Minuten wird die Mischung geschüttelt und anschliessend filtriert. Das Filtrat wird eingeengt und mit Kaliumhydroxid-Lösung versetzt. Mit Dichlormethan wird extrahiert, die wässrige Phase kurz erwärmt und mit verdünnter Salzsäure angesäuert. Die wässrige Phase wird nochmals mit Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden anschliessend vereinigt, getrocknet, eingedampft und der Rückstand in wenig Dichlormethan aufgenommen. Die Chromatographie erfolgt über eine Strecke von 10 cm mit einer Mischung aus 0,5 Teilen Essigsäure, 35 Teilen Ethylacetat und 65 Teilen Hexan. Zur Detektion wird mit Anisaldehyd-Reagens besprüht. Die Flecken entwickeln sich während 5 bis 10 Minuten beim Heizen auf etwa 105 C. Als Referenzsubstanzen werden Sudanrot G R und Fluorescein R eingesetzt. Nach der Derivatisierung ergibt das Sudanrot auf der Höhe der Valerensäure (violett) eine rote Bande und das Fluorescein ergibt auf der Höhe der Hydroxyvalerensäure (violettblau) eine gelbe Zone NF 19 (valerian und powdered valerian) Die Droge wird pulverisiert die pulverisierte Droge kann direkt eingesetzt werden - und in Dichlormethan aufgeschlämmt. Während 5 Minuten wird immer wieder umgeschüttelt und anschliessend filtriert. Das Filter wird mit Dichlormethan gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt. Die Lösung wird eingedampft und der Rückstand erneut in wenig Dichlormethan aufgenommen. Die Chromatographie erfolgt zweimal über eine Laufstrecke von 10 cm mit einer Mischung aus 75 Teilen Toluol und 25 Teilen Ethylacetat. Die Platte wird an der Luft getrocknet und anschliessend mit einer Mischung aus 8 Teilen Salzsäure und 2 Teilen Essigsäure besprüht. Nach dem Heizen während 10 Minuten bei 110 C wird die Platte im sichtbaren Licht ausgewertet. Als Referenzsubstanz wird USP powdered valerian RS eingesetzt; diese wird gleich vorbereitet wie die Wurzel. Es entsteht eine blaue bis schwarzblaue Zone von Valtrat und Isovaltrat bei einem Rf-Wert von etwa 0,75, eine hell- bis dunkelbraune Zone von Didrovaltrat (Rf 0,65) und eine blaue bis schwarzblaue Zone von Acevaltrat (Rf 0,55) NF 19 (powdered valerian extract) Wenig Extrakt wird in Wasser gelöst, mit Kaliumhydroxid-Lösung versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die wässrige Phase wird erwärmt, abgekühlt, mit Salzsäure angesäuert und wieder mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Dichlormethan aufgelöst. 8

9 A. Schmid HPTLC Baldrian Die Chromatographie erfolgt mit einer Mischung aus 65 Teilen Hexan, 35 Teilen Ethylacetat und 0,5 Teilen Essigsäure. Das lufttrockene Chromatogramm wird mit Anisaldehyd-Lösung besprüht und im Ofen bei 105 C geheizt. Als Referenzsubstanzen werden USP Fluorescein RS und USP Valerenic Acid RS eingesetzt. Die Valerensäure ergibt einen violetten Fleck bei einem Rf-Wert von etwa 0,4; die Hydroxyvalerensäure ergibt einen blauvioletten Fleck bei Rf 0,12, welcher nahe dem gelben Fleck von Fluorescein bei Rf 0,10 sein muss. 4. Methode 4.1. Chromatographie Die Chromatographie wurde zu Beginn des 20. Jahrhunderts entwickelt. Wie es schon der Name (χρωµα = Farbe; γραφειν = (be)schreiben) sagt, hatte sie ihren Ursprung bei der Trennung von Farbstoffgemischen. Eine Trennung ist eigentlich eine Verteilung zwischen zwei Phasen. Als Beispiel könnte die Trennung eines Gemischs aus Eisenspänen, Holzspänen und Sand dienen. Die Eisenspäne lassen sich beispielsweise mit einem Magneten entfernen; bei Zugabe von Wasser können die Holzspäne, welche schwimmen, vom Sand getrennt werden. Grundsätzlich lassen sich alle Gemische unter Ausnutzung der unterschiedlichen Eigenschaften ihrer Komponenten trennen. In der Chromatographie wird zwischen einer mobilen und einer stationären Phase verteilt. Zu Beginn wurde vor allem über Säulen, welche mit der stationären Phase, z.b. Kieselgel, gefüllt waren, getrennt. Mit unterschiedlichen Laufmitteln wurden die Substanzgemische nach und nach in ihre Komponenten aufgetrennt. Dabei spielt das Gleichgewicht der Verteilung zwischen der festen, stationären und der mobilen, flüssigen Phase die wesentliche Rolle. Je nach Affinität einer Komponente zur einen oder anderen Phase (stationär / mobil) wird sie schneller, oder langsamer die Säule wieder verlassen. Die Technik der Trennung wurde sukzessive verbessert und führte zu effizienteren Systemen. Einerseits führte das zur heute vielfältig eingesetzten HPLC (High Performance Liquid Chromatography), und anderseits entwickelte sich daraus auch die Dünnschichtchromatographie; heute wird in diesem Zusammenhang auch von Planarchromatographie gesprochen Dünnschichtchromatographie (DC) Die einfachste Form der Planarchromatographie ist die Papierchromatographie, welche als Trägermaterial für die stationäre Phase (Wasser) ein Fliesspapier benötigt und als mobile Phase, in den meisten Fällen, wässrige Lösungen. Die Papierchromatographie hat aber keine praktische Bedeutung mehr. 9

10 HPTLC Baldrian A. Schmid Eine wesentlich konstantere und bessere Trennung ergibt sich, wenn Kieselgel in einer dünnen Schicht auf eine Platte aus Aluminium oder Glas aufgebracht wird. Mit solchen Platten lassen sich Substanzen ebenso gut trennen wie mit einer Säule. Ein grosser Vorteil der DC ist die Möglichkeit Proben und Standards gleichzeitig und unter den selben Bedingungen trennen zu können; man erhält dabei mehrdimensionale Ergebnisse (z.b.: Platten lassen sich mehrfach detektieren; Konzentrationen können optisch über die Dicke der Banden abgeschätzt werden; nach der Detektion können Farben helfen die Substanzen zu identifizieren). DC-Systeme lassen sich sehr gezielt auf einzelne Komponenten optimieren. Ein Nachteil der DC ist ihre Empfindlichkeit auf Umwelteinflüsse, da es sich um ein offenes System handelt. Die Dünnschichtchromatographie wird eher in der qualitativen Analytik eingesetzt, während die Säulen eher bei präparativen Ansätzen verwendet werden. Bestrebungen die Dünnschichtchromatographie auch in der quantitativen Analytik einzusetzen, führten zu verbesserten Schichten, welche eine bessere Reproduzierbarkeit der Resultate erlauben HPTLC Die HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography; Hochleistungs- Dünnschichtchromatographie) ist eine Weiterentwicklung der herkömmlichen Dünnschichtchromatographie. Der Hauptunterschied ist eine verbesserte stationäre Phase. Während in der konventionellen Dünnschichtchromatographie Kieselgel mit Korngrössen im Bereich von µm verwendet wird, sind die Korngrössen in der HPTLC kleiner (5 7 µm) und die Korngrössenverteilung ist wesentlich enger (vergleiche Tabelle 1). Das hat zur Folge, dass die Trennleistung verbessert wird und die Trennstrecke verkürzt werden kann. Tabelle 1: Unterschiede zwischen DC und HPTLC (CAMAG-Methodenentwicklung) DC HPTLC Mittlere Korngrösse: µm 5-7 µm Korngrössenverteilung: weit eng Schichtdicke: 250 µm 100, 200 µm Probenzahl: max Laufstrecke: mm mm Entwicklungsdauer: min 3-20 min LM - Verbrauch: 50 ml 5-10 ml Detektionsgrenze, Abs.: ng ng Fluor.: ng 0,1-10 ng 10

11 A. Schmid HPTLC Baldrian 4.4. Einflussfaktoren in der HPTLC Stationäre Phase Laufmittel mobile Phase Gasphase Luftfeuchtigkeit Kammertyp Probenaufbereitung und Probenauftragung Stationäre Phase In 90 % der Fälle wird Kieselgel als Trennmaterial eingesetzt. Mit Kieselgel hat man am meisten Erfahrung und der grösste Teil der Anwendungen lässt sich damit zufriedenstellend bearbeiten. Auch andere Materialien, insbesondere chemisch gebundene Phasen (RP, Diol, CN, NH2) sowie seltener Cellulose und Aluminiumoxid werden zur Beschichtung der Platten verwendet Mobile Phase Die mobile Phase dient dazu die zu trennenden Substanzen über die stationäre Phase zu transportieren. Sie entsteht aus dem Laufmittel zu Beginn der Chromatographie. Die Bestandteile des Laufmittels haben je andere Dampfdrucke und können selbst chromatographischen Effekten unterliegen und sich auf der Schicht auftrennen (z.b. β- Fronten). Zudem kann die Kammersättigung das Laufmittel verändern. Laufmittel können, ja müssen für jedes Trennproblem neu entwickelt und optimiert werden. Es ist sehr darauf zu achten, dass die Zusammensetzung nicht zu komplex ist und die benötigten Volumina wenn nur kleine Mengen von mobiler Phase hergestellt werden - nicht zu klein sind ( Reproduzierbarkeit) Gasphase Die Gasphase, zusätzlich zu stationärer und mobiler Phase, ist eine Spezialität der Dünnschichtchromatographie. In der DC-Kammer befindet sich um das System aus stationärer und mobiler Phase ein Gasraum. Dieser Raum ist natürlicherweise mit Gas gefüllt. Ein Teil davon stammt aus der mobilen Phase. Die so entstehende Gasphase kann die Trennung stark beeinflussen. Mittels Kammersättigung oder anderer Kammergeometrie (ausgehend von der herkömmlichen Flachbodenkammer) kann die Gasphase einigermassen in den Griff bekommen werden. Steuerbar ist die Gasphase aber nie! 11

12 HPTLC Baldrian A. Schmid Luftfeuchtigkeit Diese wetterabhängige Komponente beeinflusst die Gasphase sehr und auch die Aktivität der stationären Phase wird durch sie verändert. Die Effekte sind zum Teil sehr ausgeprägt. (Abbildung 2) Die Abbildung bezieht sich auf eine Entwicklung in einer ungesättigten Sandwichkammer als Vergleich. Es ist als Referenz eine eher lipophile Substanz mit einem Rf-Wert von etwa 0.5, bei 50% Luftfeuchtigkeit und 20 C, angenommen. In der Normalkammer sinken bei Konditionierung der Platte die Rf-Werte sehr stark, sind aber höher wenn die Kammer völlig ungesättigt ist. Bei hoher Luftfeuchtigkeit ist der Wasseranteil in der Luft hoch und entsprechend ist auch der Anteil an Wasserdampf in der Gasphase hoch. Da das Wasser extrem polar ist, werden die Rf-Werte stark erhöht. Der Effekt ist bei sinkender Luftfeuchtigkeit weit weniger stark ausgeprägt (die Werte sinken). Temperaturunterschiede haben bei der Entwicklung keine grossen Auswirkungen auf das Chromatogramm. Auch der Wechsel zwischen verschiedenen Kieselgelqualitäten ist nicht von grosser Bedeutung. 1 gesättigte 80% r.f. 0.9 N-Kammer ungesättigte 0.8 Normalkammer normale 0.7 Entwicklung Durchlauf- 35 o C entwicklung 0.6 S-Kammer Vorbedampfung 50% r.f Vergleich Andere Kieselgel o C marken 20% r.f. 0.2 Abbildung 2: Einflussfaktoren auf die Rf-Werte in der HPTLC (CAMAG-Methodenentwicklung; nach Geiss) Kammertyp Die unterschiedlichen Entwicklungskammern (Flachboden, Doppeltrog, Horizontal, automatisch) ergeben - je nach Anwendung - unterschiedliche Resultate. Das Laufmittel muss gegebenenfalls an die andere Kammergeometrie angepasst werden, wenn gleiche Resultate erwartet werden Probenaufbereitung und Probenauftragung Die Probenaufbereitung ist in der HPTLC im Allgemeinen nicht sehr anspruchsvoll, da die Proben meist direkt oder aber verdünnt aufgetragen werden können. 12

13 A. Schmid HPTLC Baldrian Für die Auftragung wird zwischen punktförmiger Kontaktauftragung und strichförmigem Aufsprühen unterschieden. Die punktförmige Auftragung eignet sich nicht für grössere Substanzmengen. Die strichförmige Auftragung ergibt schmalere Banden, da das Lösungsmittel im Vergleich zur punktförmigen Auftragung schneller verdunstet. 5. Material und Methoden 5.1. verwendete Geräte Extraktion Retsch Zentrifugenmühle Schüttelmaschine (Vortex Genie) Polytron PT Kinematica, Littau mit PCU (power control unit) Gartenschere, Faltenfilter, Pasteurpipetten, Falcon Tubes, Trichter, Spatel Auftragen CAMAG Nanomat (manuelles Probenauftragen mit Festvolumenkapillare) CAMAG Linomat (strichförmiges Probenauftragen durch Aufsprüh-Technik) CAMAG ATS 4 (DC-Probenautomat; vollautomatisches Probenauftragen rechnergesteuert, wahlweise punktförmig oder strichförmig) (Abbildung 3) Abbildung 3: ATS Entwickeln CAMAG Entwicklungstanks (konventionelle Chromatogramm-Entwicklung in Flachboden- oder Doppeltrogkammer) (Abbildung 4) 13

14 HPTLC Baldrian A. Schmid Abbildung 4: Doppeltrog-Entwicklungstanks CAMAG Horizontal-Entwicklungskammer (horizontale Entwicklung von HPTLC-Platten) (Abbildung 5) Abbildung 5: Horizontal-Entwicklungskammer Automatische Entwicklungskammer (ADC) (vollautomatische Chromatogramm- Entwicklung; Mikroprozessor gesteuert) Derivatisieren CAMAG Chromatogramm-Tauchvorrichtung (Abbildung 6) Abbildung 6: Tauchvorrichtung für DC-Platten CAMAG Laborsprüher CAMAG Sprühkabinett 14

15 A. Schmid HPTLC Baldrian Auswertung CAMAG UV-Lampen (Inspektion der Chromatogramme unter kurzwelligem oder langwelligem UV-Licht) CAMAG Reprostar und CAMAG VideoStore (Bilderfassung, Dokumentation und Archivierung, gleichzeitig Vorstufe zu Video-Densitometrie) (s. Abbildung 7) Abbildung 7: Videosystem CAMAG VideoScan Software Reprostar Der Reprostar ist das Photoatelier. Dort sind die Beleuchtungseinheiten angeordnet und dorthinein kommt die entwickelte Platte bei der Aufnahme zu liegen. Auf Grund der zentralen Positionierung der Kamera über der Bildfläche ist es möglich, Platten bis zu einer Grösse von cm ins Bild zu bekommen. Da aber die Beleuchtungseinheiten paarig angelegt sind und nicht alle Röhren am selben Ort sein können ist die Ausleuchtung der Platten, je nach Lichttyp, nicht ganz gleichmässig. Dazu trägt auch die hell lackierte Rückfläche an der Innenseite des Reprostar bei: sie verursacht Reflexionen bei weissem Auflicht. Damit die Platten reproduzierbar am selben Ort liegen muss mit einer Anschlagsschiene gearbeitet werden; die mitgelieferten Plastikschablonen eignen sich nicht für reproduzierbare Positionierung der Platten im Reprostar, weil sie sich nicht exakt auf der Grundplatte positionieren lassen und weil sie beim Auswechseln der Platten zwischen den Aufnahmen leicht verrutschen Kamera Bei der Kamera handelt es sich um eine Hitachi HV C20A 3CCD Videokamera. Diese hat für die Aufnahme 3 Kanäle, je einen für Rot, Blau und Grün. Die Kamera ist an einem Stativ fest mit dem Reprostar verbunden. Einmal eingestellt, sollte die Schärfe (Distanz Kamera-Platte) nicht mehr verändert werden. Die Aufnahme lässt sich manuell über das Zoom (Bildausschnitt) und die Blende (Lichtmenge) beeinflussen. Sehr praktisch wäre, wenn diese beiden Parameter elektronisch mittels Motor eingestellt werden könnten, damit ihre Positionen wiederholt gleich eingestellt werden könnten. 15

16 HPTLC Baldrian A. Schmid Eine eigene Beschriftung der Einstellringe mit Strichen für die erforderlichen Aufnahmepositionen, lässt keine hohe Reproduzierbarkeit zu Digitalisierkarte & Kameraeinstellungen Mittels dieser Einstellungen lassen sich sämtliche elektronischen Kameraparameter beeinflussen. Zu den Kameraeinstellungen gehören insbesondere der Weissabgleich, der Schattenabgleich, die Belichtungszeit und die elektronische Schärfe. Auch die Einstellungen der Digitalisierkarte, welche die analogen Signale der einzelnen Farbkanäle der Kamera in ein digitales Bild umwandeln, gehören dazu. Jeder der Kanäle kann einzeln oder alle gemeinsam den Bedürfnissen angepasst werden. Um ein Bild aufnehmen zu können müssen der Computer und die Kamera zusammen kommunizieren können. Dazu muss erst eine Konfiguration erstellt werden. In der VideoStore-Software sind von Beginn an Konfigurationen für UV- und VIS-Licht vorhanden. Für die meisten Anwendungen sind diese gut. Die Bilder für diese Arbeit wurden alle mit Standardkonfigurationen aufgenommen. Andere Einstellungen sind auch ausprobiert worden; sie waren aber nicht wesentlich besser und wurden deshalb wieder verworfen VideoScan Die Video-Densitometrie basiert auf der Analyse der einzelnen Bild-Pixel auf Farbe und Intensität. Die Bereiche welche analysiert, bzw. gescannt werden, können im Programm vorgegeben werden. Das Programm erstellt auf Grund des Scanvorgangs Kurven der einzelnen Bahnen. Die vom Programm erkannten Peaks können mit Substanznamen versehen werden. Zusätzliche Informationen können ins Chromatogramm eingetragen werden (Raster). Das Raster kann als Bestandteil der Methode auf weitere Platten übertragen werden und für das Scannen weiterer gleicher Platten verwendet werden HPTLC-Platten Merck HPTLC-Platten cm; Kieselgel 60 F254 (Lagernummer ) Merck HPTLC Platten cm; Kieselgel 60 F254 (Lagernummer ) Sämtliche HPTLC-Platten wurden uns freundlicherweise von der Firma Merck Darmstadt zu Verfügung gestellt. Ab Platte 130 wurden alle verwendeten Platten vorgewaschen, d.h. sie wurden mit Methanol über eine Distanz von 9 cm entwickelt und anschliessend im Trockenschrank bei 120 C während 2 Stunden getrocknet. Dieser Schritt wurde durchgeführt, um Störungen durch Verunreinigungen auf der Platte auszuschliessen. 16

17 A. Schmid HPTLC Baldrian 5.3. Reagenzien Lösungsmittel Für die Arbeiten wurden folgende Lösungsmittel verwendet (Tabelle 2) Tabelle 2: verwendete Lösungsmittel Substanz Qualität Hersteller Bestellnummer verwendete Charge Chloroform p.a. Merck K Ethylacetat p.a. Merck K Propanol p.a. Merck I Schwefelsäure 95 97% p.a. Merck K Toluol p.a. Merck K Hexan p.a. Merck I Essigsäure 100% p.a. Merck K Dichlormethan p.a. Merck K Methanol p.a. Merck K Ameisensäure p.a. Merck K Anisaldehyd purum Fluka / Salzsäure 37% reinst Ph.Eur. Riedel-de Haën Propanol p.a. Merck K Reagenzien zur Detektion Anisaldehyd-Sprühlösung (nach Jork et al 1989) Eine Mischung aus 85 ml Methanol und 10 ml Essigsäure wird unter Eiskühlung vorsichtig mit 8 ml konzentrierter Schwefelsäure und 0.5 ml Anisaldehyd versetzt. Diese eigentlich zum Sprühen vorgesehene Mischung wurde zum Tauchen der Platten verwendet. Die Reagenzlösung ist nicht stabil; das Anisaldehyd zersetzt sich unter Lichteinfluss und die Lösung wird rot. Anisaldehyd-Sprühlösung (verändert; nach Jork) Das Methanol wurde durch Isopropanol ersetzt; 85 ml davon werden mit 10 ml Essigsäure gemischt, im Kühlschrank abgekühlt (1 Stunde) und mit 8,5 ml konzentrierter Schwefelsäure und 0,5 ml Anisaldehyd versetzt. Diese Mischung wurde zum Tauchen der Platten verwendet. Das Reagens ist auch im Kühlschrank nicht stabil. Salzsäure-Essigsäure-Sprühlösung (nach NF) Zu 8 Teilen rauchender (konzentrierter) Salzsäure werden 2 Teile Essigsäure zugegeben. Diese Lösung wurde zum Sprühen und Tauchen der Platten eingesetzt. Die Reagenzlösung wurde im Kühlschrank aufbewahrt. 17

18 HPTLC Baldrian A. Schmid Schwefelsäure 10% in Wasser zum Tauchen 90 ml Wasser wurden im Kühlschrank 1 Stunde gekühlt und anschliessend mit 10 ml konzentrierter Schwefelsäure versetzt. Die Lösung ist stabil. Schwefelsäure 10% bzw. 15% in Methanol zum Tauchen 90 ml Methanol werden im Kühlschrank gekühlt und mit 10 ml konzentrierter Schwefelsäure versetzt (bzw. 85:15 für 15%). Diese Lösung wurde zum Tauchen der Platten verwendet. Die Lösung ist stabil, sie wurde aber trotzdem im Kühlschrank aufbewahrt Referenzsubstanzen für Platten ICC Indofine Chemical Company Inc. Valerenic Acid w/hplc pure; Lot Wurde in einer Konzentration von 0,05 mg/ml in Dichlormethan gelöst. für Platten Valerensäure Phytochem; Ch ,044 mg / 20 ml Dichlormethan Acetoxyvalerensäure Phytochem; Ch ,122 mg / 20 ml Dichlormethan Hydroxyvalerensäure Analyticon; Ch ,120 mg / 20 ml Dichlormethan für Platten Valerensäure Phytochem; Ch ,001 mg / 20 ml Dichlormethan Acetoxyvalerensäure Phytochem; Ch ,018 mg / 20 ml Dichlormethan Hydroxyvalerensäure Analyticon; Ch ,040 mg / 20 ml Dichlormethan für Platten Valerensäure Phytochem; Ch ,676 mg / 20 ml Dichlormethan Acetoxyvalerensäure Phytochem; Ch ,620 mg / 20 ml Dichlormethan Hydroxyvalerensäure Analyticon; Ch ,054 mg / 20 ml Dichlormethan 18

19 A. Schmid HPTLC Baldrian Untersuchungsmaterial Drogen Valerianae radix aus Anbau; Firma Vitaplant, Witterswil Chargen: VO 1 VO 2 VO 3 VO 4 Valerianae radix aus Anbau; Firma Zeller Söhne AG, Romanshorn Trockenextrakte Baldrian-Trockenextrakt (Artikelnummer 21920); Firma Zeller Söhne AG, Romanshorn Extraktion mit 50% Methanol; DEV 4 6:1 Chargen: Extraktion Die Wurzeln wurden zuerst von noch anhaftender Erde gereinigt und mit einer Gartenschere in kleine Stücke geschnitten. Anschliessend wurden die Wurzelproben mit einer Retsch Zentrifugenmühle in zwei Stufen gemahlen. Zuerst wurde ein Siebeinsatz mit einer Lochgrösse von 2 mm verwendet; für den zweiten Zerkleinerungsschritt wurde ein solcher mit einer Lochgrösse von 0,75 mm eingesetzt. Die Wurzeln wurden mit Methanol in einem Verhältnis 0,1 g/ml mit einem Polytron PT während 2 Minuten extrahiert. Die Trockenextrakte wurden in Methanol aufgelöst. Auch hier war das Verhältnis von Extrakt zu Lösungsmittel 0,1 g/ml. Die aufgeschlämmten Trockenextrakte wurden 2 Minuten lang mit einem Vortex auf Stufe 10 geschüttelt. Alle Lösungen wurden anschliessend über Faltenfilter filtriert und in dieser Form direkt für die Analysen auf den HPTLC-Platten verwendet. Für die Vorversuche wurde zudem eine Reihe von Lösungen mit Dichlormethan hergestellt. Hier wurde ein Verhältnis von Wurzel bzw. Trockenextrakt zu Lösungsmittel von 0,04 g/ml gewählt. Für die Vorversuche standen vier verschiedene Wurzelproben und zwei verschiedene Trockenextrakte zu Verfügung. 19

20 HPTLC Baldrian A. Schmid Die Details zu den Extraktionen für die Vorversuche sind der folgenden Tabelle (Tab. 3) zu entnehmen. Tabelle 3: Extraktion für die Vorversuche; Chromatogramm Typ A (VO = Wurzel, Vitaplant; / = Trockenextrakte; Zeller) Bezeichnung Menge [g] pro Volumen [ml] Extraktionsmittel Eigener Extraktname VO 1 3, Methanol VO 1 M 1-3 VO 2 3, Methanol VO 2 M 1-3 VO 3 3, Methanol VO 3 M 1-3 VO 4 3, Methanol VO 4 M 1-3 VO 1 1, Dichlormethan VO 1 D 1-3 VO 2 1, Dichlormethan VO 2 D 1-3 VO 3 1, Dichlormethan VO 3 D 1-3 VO 4 1, Dichlormethan VO 4 D , Methanol VT 1 M , Methanol VT 2 M , Dichlormethan VT 1 D , Dichlormethan VT 2 D 1-3 Für die weiteren Versuche und die Stabilitätsuntersuchungen wurden 3 Baldrian- Trockenextrakte der Firma Zeller und eine Baldrian-Wurzel als Referenz verglichen. Die Extraktion erfolgte nach dem gleichen Prinzip wie für die Vorversuche, jedoch wurde die Wurzel - ausser für die zweite Probenreihe - nicht mit dem Polytron extrahiert, sondern mit dem Vortex während 5 Minuten geschüttelt. Die eingesetzten Mengen sind der nachfolgenden Tabelle (Tab. 4) zu entnehmen. Tabelle 4: Extraktionen für die Hauptversuche; Chromatogramm Typ B; ( / / = Trockenextrakte; * = Extraktion mit Polytron (5 min.)) Bezeichnung Menge [g] pro Volumen [ml] Extraktionsmittel Eigener Extraktname ,03 30 Methanol ,03 30 Methanol ,99 30 Methanol Wurzel 3,02 30 Methanol Wurzel ,53 25 Methanol ,50 25 Methanol ,54 25 Methanol Wurzel 2,50 25 Methanol Wurzel-2 * ,51 25 Methanol ,50 25 Methanol ,51 25 Methanol Wurzel 2,54 25 Methanol Wurzel ,51 25 Methanol ,52 25 Methanol ,50 25 Methanol Wurzel 2,53 25 Methanol Wurzel-4 20

21 A. Schmid HPTLC Baldrian 5.5. optimierte SOP zur Entwicklung der HPTLC-Platten für Fingerprint- Auswertung Platte vorwaschen: Die HPTLC-Platte wurde mit Methanol über eine Distanz von mindestens 9 cm in einer Doppeltrogkammer entwickelt. Anschliessend wurde sie im Trockenschrank bei 120 C während 2 h getrocknet, in Aluminiumfolie eingewickelt und in einem leeren Exsiccator (ohne Trocknungsmittel) abgekühlt. Proben auftragen: Die Proben wurden mit dem ATS 4 bandenförmig auf die vorgewaschene HPTLC-Platte gesprüht. Von den Trockenextrakten wurden je 1500 nl, vom Wurzelextrakt 1000 nl und von der Mischung der Referenzen 5000 nl aufgesprüht. (Typ B; Methode stabvoea; Anhang 1) Platte entwickeln: In den einen Trog der Doppeltrogkammer wurde ein zugeschnittenes Fliesspapier ( cm) gestellt und mit 10 ml Laufmittel (Chloroform:Ethylacetat:Propanol 6:4:0.4) befeuchtet. Durch Kippen der Kammer wurden die Laufmittelvolumina in den beiden Trögen ausgeglichen und die Kammer für 10 geschlossen stehen gelassen. Anschliessend wurde die beladene HPTLC-Platte mit der Schicht zum Fliesspapier im gegenüberliegenden Trog positioniert und nach 5,5 cm Laufsstrecke (gekennzeichnet) wieder herausgenommen. Die entwickelte Platte wurden mit dem Föhn getrocknet bis das Laufmittel verdampft war. UV-Bilder aufnehmen: Die entwickelte HPTLC-Platte wurde mit dem CAMAG VideoStore im UV bei 254 nm und bei 366 nm fotografiert (Einstellungen UV 254 nm: Anhang 2; Einstellungen UV 366 nm: Anhang 3). Platte derivatisieren: Die Derivatisierung wurde durch Tauchen der entwickelten HPTLC-Platte in 15% Schwefelsäure in Methanol erreicht. Mit dem CAMAG Chromatogram Immersion Device III wurde, bei einer Geschwindigkeit 1 und einer Verweilzeit von 0, die Platte getaucht. Die Platte wurde anschliessend unten mit Haushaltpapier abgewischt um das Aufsteigen der methanolischen Lösung zu vermeiden - und auch die Rückseite wurde gereinigt. Nach dem Verdampfen des Methanol an der Luft wurde die Platte in einem auf 120 C vorgeheizten Trockenschrank während 10 geheizt und vor den Aufnahmen etwa 10 abgekühlt. VIS-Bilder aufnehmen: Die Platte wurden auf einer Opalglasplatte mit Anschlagsschiene positioniert; das Zoom wurde so eingestellt, dass die ganze Platte (10 10 cm) das Bild ausfüllte. Die Blende wurde jeweils auf die, an der Kamera angezeichneten, Positionen für das entsprechende Bild gedreht. Mit der Bildakkumulationsfunktion (10 ) wurde das elektronische Rauschen eliminiert. 21

22 HPTLC Baldrian A. Schmid Die derivatisierte HPTLC-Platte wurde in sichtbarem Auf-, Durch- und kombiniertem Aufund Durchlicht mit dem CAMAG VideoStore aufgenommen. (Einstellungen Anhang 4) Auswertung: Mit der CAMAG VideoScan Software wurden anschliessend die Bilder der Platte ausgewertet und verglichen. (Einstellungen: Anhang 5) 22

23 A. Schmid HPTLC Baldrian 6. Resultate Die Auftragung für die im folgenden abgebildeten Chromatogramme erfolgte auf zwei Arten (von links nach rechts): Typ A: Wurzel VO 1 Wurzel VO 2 Wurzel VO 3 Wurzel VO 4 Referenzen Trockenextrakt Trockenextrakt Typ B: Trockenextrakt Trockenextrakt Referenzen Wurzel Zeller Trockenextrakt Laufmittel Vorversuche Die ersten Platten wurden zur Ermittlung der benötigten Auftragemenge (Wurzelextrakt und aufgelöster Trockenextrakt) mit den Pharmakopöe-Laufmitteln durchgeführt, wobei die Extraktion nicht nach den Methoden der einzelnen Pharmakopöen durchgeführt wurde, sondern wie im Kapitel Extraktion (5.4.) beschrieben. Von den methanolischen Extrakten wurden für die Vorversuche jeweils 2 µl aufgetragen, von den Dichlormethan-Extrakten 5 µl. Die in den Pharmakopöen vorgesehenen Referenzsubstanzen wurden nicht mitaufgetragen; an ihrer Stelle standen jedoch Referenzsubstanzen der einzelnen Valerensäuren zur Verfügung. Abbildung 8: Resultat nach NF (Typ B) Abbildung 9: Resultat nach Ph.Helv. 8 (Typ B) 23

24 HPTLC Baldrian A. Schmid Abbildung 10: Resultat nach Ph.Eur. 3 (Typ B) Da die ersten Resultate nicht befriedigten der Rf-Wert der Hydroxyvalerensäure ist zu klein bei den Methoden nach NF (Abb. 8) und Ph.Helv. (Abb. 9); das Laufmittel bildet eine β-front auf der Höhe der Acetoxyvalerensäure bei der Methode nach Ph.Eur. (Abb. 10) - wurde nach dem Schema zur Laufmittelentwicklung der Firma CAMAG (Abbildung 11) ein eigenes Laufmittelsystem entwickelt. Abbildung 11: Schema zur Laufmittelentwicklung (CAMAG-Methodenentwicklung) In der Abbildung 11 sind bei den reinen Fliesmitteln die Selektivitätsklassen mit angegeben. Diese sind auf Basis einiger physiko-chemischen Eigenschaften der Lösungsmittel ermittelt worden und lassen sich in einem Dreieck anschaulich darstellen (Abbildung 12) 24

25 A. Schmid HPTLC Baldrian Abbildung 12: Selektivitätsdreieck für Fliessmittel (nach Snyder 1978) Beispiele für Substanzen in den einzelnen Selektivitätsklassen finden sich in der folgenden Tabelle (Tab. 5): Tabelle 5: Beispiele für Substanzen in den einzelnen Selektivitätsklassen (nach Snyder 1978) I aliphastische Ether, Trialkylamine, Trialkylphosphate II aliphatische Alkohole III Tetrahydrofuran, Pyridin und Derivate, Amide ( Formamid) IV Benzylakohol, Formamid, Essigsäure V Dichlormethan, Ethylenchlorid VI aliphatische Ketone und Ester, Acetonitril VII aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte aromatische Kohlenwasserstoffe, Nitrobenzol, Toluol VIII Wasser, Chloroform, Fluoralkohole Von den reinen Laufmitteln zeigten Dichlormethan, Ethylacetat, Toluol und Chloroform spontan eine Trennung (Abbildung 13) Abbildung 13: reine Laufmittel (v.l.n.r.: Dichlormethan, Ethylacetat, Toluol, Chloroform) 25

26 HPTLC Baldrian A. Schmid Mit Methanol wurde die Lösungsmittelstärke der auf Chloroform, Dichlormethan und Toluol basierenden mobilen Phase erhöht; desgleichen wurde mit Hexan die Lösungsmittelstärke von der auf Ethylacetat basierenden mobilen Phase herabgesetzt. Da die Resultate mit Methanol nicht überzeugend waren, wurde versucht, den gleichen Effekt mit Ethylacetat welches selbst eine zu hohe Lösungsmittelstärke hat - zu erreichen. (Abbildung 14) Abbildung 14: modifizierte Laufmittel (v.l.n.r.: CH2Cl2:EtOAc 8:2; EtOAc:Hex 8:2; Toluol:EtOAc 8:2; CHCl3:EtOAc 9:1; mit dem grünen Pfeil ist jeweils die Valerensäure markiert) Optimierung Die oben gezeigten Mischungen wurden in ihren Verhältnissen weiter verändert. Dichlormethan erwies sich als ungeeignet, da es als Laufmittel aufgrund seiner Leichflüchtigkeit (Siedepunkt 35 C) selten waagerechte Fronten erzeugte. Die Verhältnisse von Toluol zu Ethylacetat, Chloroform zu Ethylacetat und Ethylacetat zu Hexan wurden weiter verändert und ausgetestet. Auch die Zugabe von Säure (zweimal Ameisensäure; dann nur noch Essigsäure) wurde in die Evaluierung einbezogen, was dem Schema entsprechend bereits die dritte Stufe darstellt. Immer wieder wurde, vor allem bei auf Toluol basierenden Laufmitteln, ein fronting (Dächerbildung) beobachtet. Dies konnte durch Reduktion der aufgesprühten Extraktmenge einerseits und anderseits durch Sprühen längerer Banden vermindert werden. Ziel war es zudem, ein möglichst einfaches Laufmittel, welches reproduzierbar hergestellt werden kann, zu finden. 26

27 A. Schmid HPTLC Baldrian Zum Schluss resultierte eine Mischung aus 6 Teilen Chloroform und 4 Teilen Ethylacetat als Laufmittel der Wahl. (Abbildung 15) Abbildung 15: Musterplatte (Typ A); entwickelt mit CHCl3:EtOAc 6:4 in einer gesättigten Doppeltrogkammer; Hydroxyvalerensäure Rf-Wert um 0,05; Acetoxyvalerensäure Rf-Wert um 0,30; Valerensäure Rf-Wert um 0,42 Die Extrakte und Referenzsubstanzen sind gegenüber dem Laufmittel unempfindlich (d.h. es findet keine Zersetzung statt), wie mit 2-D Entwicklung von Platten gezeigt werden konnte (Abbildung 16). Abbildung 16: 2-D Entwicklung von Platten zur Stabilitätsprüfung der zu trennenden Substanzen im Laufmittel am Beispiel des Trockenextrakts

28 HPTLC Baldrian A. Schmid Beim Auswerten der Bilder mit VideoScan wurde entdeckt, dass die Hydroxyvalerensäure nach der Derivatisierung häufig von den Startflecken überdeckt wurde. Mit einer Zugabe von 4% 1-Propanol zum Laufmittel konnte das Problem reproduzierbar behoben werden. (Abbildung 17) Abbildung 17: Endversion des Laufmittels(CHCl3:EtOAc:PrOH 6:4:0,4); Typ B Hydroxyvalerensäure Rf-Wert um 0,16; Acetoxyvalerensäure Rf-Wert um 0,41; Valerensäure Rf-Wert um 0,50; Mitte: Referenzsubstanzen; rechts davon: Wurzelextrakt; andere Banden: Trockenextrakte Auch gegenüber dem definitiven Laufmittel waren Proben und Standard inert. (Abb. 18) Abbildung18: 2-D Entwicklung von Platten zur Stabilitätsprüfung der zu trennenden Substanzen im definitiven Laufmittel; Trockenextrakt

29 A. Schmid HPTLC Baldrian 6.2. Kammertyp Die Kammern, mit oder ohne Sättigung, haben Ihren Einfluss auf die Entwicklung der Chromatogramme, wie an Hand eines Beispiels zu sehen ist. a) b) c) d) Abbildung 19: Einfluss der Kammer auf die Trennung; Typ A (Bahnen 3 5) Die verschiedenen Probelösungen in Abbildung 19 wurden alle mit dem ATS 4 aufgesprüht, das Laufmittel war immer Chloroform:Ethylacetat 6:4, die Laufstrecke betrug 5,5 cm. Die Entwicklung wurde wie folgt durchgeführt (v.l.n.r.): a) Horizontalkammer; 20 Konditionierung (auch die Kammersättigung stellt sich so ein) mit 10 ml Laufmittel; 2 ml Laufmittel für die Entwicklung b) Doppeltrogkammer; Kammersättigung mit Fliesspapier und 5 ml Laufmittel je Trog während 10 ; kein Konditionieren der Platte; c) Horizontalkammer in Sandwichkonfiguration (mit einer Gegenplatte); kein Konditionieren, keine Kammersättigung; 2 ml Laufmittel. d) Horizontalkammer, kein Konditionieren; ohne Kammersättigung; ohne Gegenplatte; mit 2 ml Laufmittel. Es ist ersichtlich, dass Kammersättigung oder Konditionieren die Platte beeinflusst indem die Rf-Werte kleiner ausfallen. Leider ist die eigentlich optimale Form (Abb. 19c; man beachte die Rf-Werte und die Trennung oberhalb der Valerensäure!) der Entwicklung die Sandwichkonfiguration für das verwendete Laufmittel nicht anwendbar (die Fronten werden schräg, die Bahnen sind zu oft verzogen), so dass auf eine andere Methode gewechselt werden musste. Die offene Konfiguration (keine Sandwichplatte, keine Kammersättigung, kein Konditionieren) war von den Rf-Werten her nicht reproduzierbar. Die gesättigte Horizontalkammer hatte vor allem das Problem, dass die Banden sehr kleine Rf-Werte hatten, und dass daher die Chromatogramme nicht ausgewertet werden konnten. Die unbekannte Substanz zwischen 29

30 HPTLC Baldrian A. Schmid der Acetoxyvalerensäure und der Valerensäure liess sich nicht sauber von der Acetoxyvalerensäure abtrennen. Die Doppeltrogkammer ergab reproduzierbare Rf-Werte, immer gerade Fronten, selten verzogene Banden und reproduzierbare Trennung der Substanzen. Sie wurde deshalb zur Kammer der Wahl. Um die Reproduzierbarkeit der Chromatogrammentwicklung zu optimieren können die HPTLC-Platten auch mit der CAMAG ADC (Automatic developing chamber) entwickelt werden. Ihr grösster Vorteil ist die absolut konstante Laufstrecke. Diese wird während der Entwicklung des Chromatogramms laufend über eine Photodiode gemessen. Bei Erreichen der gewünschten Entwicklungsdistanz wird das Laufmittel sofort entfernt. Das erarbeitete Laufmittel eignete sich in seiner Zusammensetzung nicht für den Einsatz in der ADC; eine Optimierung für diese Kammer wäre unerlässlich. Auf diese weitere Möglichkeit zur Entwicklung wurde deshalb aus Kapazitätsgründen verzichtet Derivatisierung Für Aufnahmen im sichtbaren Licht Die Derivatisierung der Valerensäuren nach Pharmakopöe (Ph.Helv. 8; Ph.Eur. 3) wird mit einer Anisaldehyd-Schwefelsäure-Lösung durchgeführt. Die Chromatogramme werden dabei gefärbt, so dass sie anschliessend im sichtbaren Licht ausgewertet werden können. Die Substanzen werden oft unterschiedlich angefärbt (z.b. Valerensäure rosa, Hydroxyvalerensäure blauviolett) was bei ihrer Identifikation helfen kann. (Abbildung 20) Abbildung 20: Derivatisierung nach Tauchen in der Anisaldehyd-Schwefelsäure-Sprühlösung (Typ A) Das Verfahren ist problematisch, weil sich der Anisaldehyd an Luft und Licht zersetzt und die Lösung somit nur für kurze Zeit im Kühlschrank haltbar ist. Ein weiterer Punkt, der gegen den Einsatz dieses Reagens spricht, ist auch die Instabilität der Farben auf der derivatisierten Platte. Wenn, wie das während der Arbeit im Labor oft der Fall war, die Platten nicht exakt 5 Minuten nach dem Herausnehmen aus dem Trockenschrank fotografiert werden konnten, waren die Bilder einerseits weniger scharf und anderseits unterschiedlich gefärbt. (Abbildung 21) 30

31 A. Schmid HPTLC Baldrian Abbildung 21: Veränderung der Farbe am Licht; diese Platte wurde nach 5 und 10 Minuten photographiert, dazwischen lag sie bei Auflicht im Reprostar. (Typ A) Die einheitliche Färbung der Platten ist sowohl für die Aufnahme und die Auswertung wichtig. Da auch mit allwöchentlichem Erneuern der Anisaldehydlösung keine reproduzierbare Einheitlichkeit der Färbung erzielt werden konnte, wurde nach einer Alternative gesucht. In der Sprühlösung wurde Methanol durch Isopropanol ersetzt. Die kalte, frische Lösung ergab erfolgsversprechende Resultate. Leider war aber der Anisaldehyd in der raumwarmen Lösung sehr aktiv, so dass die ganze Platte angefärbt wurde und von den Substanzen fast nichts mehr zu sehen war. 10% Schwefelsäure in Methanol wurde in Vereinfachung des Reagens ausprobiert (Anisaldehyd-Reagens ohne Anisaldehyd). Die Substanzen wurden sichtbar, das Reagens war jedoch dem Anisaldehyd-Reagens unterlegen. Mit 10%-iger wässriger Schwefelsäure wurden die Substanzen viel besser sichtbar im Vergleich mit der methanolischen Lösung jedoch wurden die Startflecken beim Tauchen in Richtung Laufmittelfront verschoben, ein Effekt, welcher mit der methanolischen Lösung wesentlich weniger beobachtet wurde. Mit der Erhöhung der Konzentration an Schwefelsäure in Methanol auf 15% wurde dann eine sehr befriedigende Lösung gefunden. Dieses Reagens ist stabil, kann mit dem Tauchverfahren reproduzierbar auf die Platte gebracht werden, ergibt nach 10 Minuten Heizen auf 120 C gut sichtbare Substanz-Flecken, welche sich zwischen 2 und 20 Minuten nach dem Heizen kaum verändern, und der Chromatogramm-Hintergrund wird immer gleich gefärbt. Zudem unterliegen die Startflecken keinem chromatographischen Effekt. (Abbildung 22) 31

32 HPTLC Baldrian A. Schmid Abbildung 22: Derivatisierung durch Tauchen in 15% Schwefelsäure in Methanol (Typ B) Für Aufnahmen im UV-Bereich Eine weitere Methode zum Sichtbarmachen der Chromatogramme stammt aus dem NF 19. Die entwickelten Platten werden mit einer Mischung aus Salzsäure und Essigsäure (8:2) besprüht, getrocknet, bei 120 C während 10 Minuten erhitzt und bei 366 nm betrachtet. (Abbildung 23) Abbildung 23: Platte nach Besprühen mit Salzsäure-Essigsäure-Reagens (Typ A) Die Valerensäuren waren im UV (366 nm) selten so gut zu sehen, wie in Abbildung

33 A. Schmid HPTLC Baldrian Das NF 19 schreibt im Weitern vor die Bilder auch im Weisslicht aufzunehmen; die entstandenen Bilder waren aber weit weniger gut interpretierbar, als nach der Derivatisierung mit Anisaldehyd-Reagens oder mit methanolischer Schwefelsäure. (Abbildung 24) Abbildung 24: Aufnahme im Weisslicht nach der Derivatisierung mit Salzsäure-Essigsäure; rechts daneben, als Vergleich, die Platte nach Anisaldehyd-Derivatisierung. Bahnen v.l.n.r.: 1 & 6 VO 1; 2 & 5 Referenzen; 3 & Da das Besprühen weniger gut reproduzierbar ist, als das Tauchverfahren, wurde versucht das Sprühen des Salzsäure-Essigsäure-Reagens durch Tauchen in demselben zu ersetzen. Dieser Versuch misslang, weil das Reagens eine hohe Viskosität hat, und man die Säuren durch Trocknen kaum mehr von der Platte wegbekommt; es gibt auch hier zusätzliche chromatographische Effekte, wie das unten abgebildete Beispiel (Abbildung 25) zeigt. Abbildung 25: chromatographischer Effekt beim Tauchen in Salzsäure-Essigsäure Reagens; die Startflecken in den Ecken werden verschoben. (Typ A) Ausserdem ist das Reagens extrem reizend für die Atemwege auch wenn im Abzug gearbeitet wird. Da die Derivatisierung mit Salzsäure-Essigsäure-Reagens nicht reproduzierbar gelang, und keine zusätzliche Information über die Valerensäuren gewonnen werden konnte, wurde das Verfahren nach NF nicht weiter verfolgt. 33

34 HPTLC Baldrian A. Schmid 6.4. Aufnahme Plattenposition Für die reproduzierbare Position der Platte bei den UV-Lichteinstellungen und bei weissem Auflicht existiert von der CAMAG bereits eine Metallplatte mit Anschlagswinkel. Das Problem für die vorliegende Arbeit bestand darin, dass auch mit Durchlicht gearbeitet werden musste und dass in Folge dessen eine Opalglasplatte mit einem Anschlagswinkel versehen werden musste. Dazu wurde eine Plastikschablone für das Format cm auf eine Opalglasplatte geklebt, und auf die Schablone ein Winkelstück. Diese Grundplatte konnte im Reprostar nicht festgeklebt werden, da andere Benutzer das Gerat auch für andere Formate verwendeten. Das sich dadurch ergebende Spiel von etwa 2 mm in allen Richtungen reichte aus, um die Bildposition konstant zu halten Bildfarbe Die Einheitlichkeit der Bilder war vor allem im sichtbaren Bereich ein Problem. Für das Auge wirkten alle Platten - nach Derivatisierung mit 15% Schwefelsäure in Methanol gleich. Die Kamera erkannte aber nicht immer die gleiche Farbe und Helligkeit, weil für die unterschiedlichen Lichtverhältnisse (nur Auflicht, nur Durchlicht, kombiniertes Auf- und Durchlicht) die Blendeneinstellungen angepasst werden mussten und diese nicht exakt wiederholbar waren. Die Bilder wurden eher rot beim Verkleinern der Blendenöffnung, eher blau, wenn diese vergrössert wurde. Dass auch der Bildschirm bei der Farbausgabe mit Fehlern behaftet ist, macht die Arbeit nicht einfacher. Es war möglich alle Bilder mit dem selben System aufzunehmen, so dass dieser letztgenannte Faktor keine zusätzliche Fehlerquelle darstellte. Der Einfluss unterschiedlicher Blendeneinstellung auf ein und dieselbe Platte soll an Hand der folgenden Abbildung 26 gezeigt werden. Abbildung 26: überbelichtetes, normales und stark unterbelichtetes Bild; Unterschiede resultierten durch Verstellen der Blende. (Typ A) 34