Die Bedeutung der DNA- Doppelstrangbruch-Reparatur (Non Homologes End Joining) bei der Aktivierung der Caspasen und der Induktion von Apoptose

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1 Universitätsklinikum Ulm Klinik für Kinder- und Jugendmedizin Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin Die Bedeutung der DNA- Doppelstrangbruch-Reparatur (Non Homologes End Joining) bei der Aktivierung der Caspasen und der Induktion von Apoptose Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Miriam Uhl Aalen 2007

2 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Fulda 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Wiesmüller Tag der Promotion:

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis 3 1. Einleitung Apoptose Bedeutung der Apoptose Apoptosesignalwege: Vom Todessignal zum Zelluntergang DNA-Damage und Reparatur Radikale Zytostatika und Strahlung Schäden der Doppelhelix DNA - Reparaturmechanismen DNA-Schaden und Apoptose Erkennung: Phosphatidyl-Inositol-3-Kinasen (PI3K) Verarbeitung Material und Methodik Material Chemikalien, Reagenzien, Medien und Kits Geräte und Materialien Lösungen, Medien und Puffer Antikörper Methoden Zellkultur Proteinchemische Methoden Nachweis von DNA-Schäden auf Einzelzellniveau Ergebnisse Doxorubicin-induzierte Apoptose in Nalm6 und Nalm6 DoxoR Doxorubicin-induzierte Apoptose in Nalm6 und Nalm6 DoxoR Doxorubicin-induzierte Aktivierung der Caspasen in Nalm6 und Nalm6 DoxoR 42 1

4 Unterschiede in der Expression der Apoptosemodulatoren der Bcl-2 Familie in Nalm6 und Nalm6 DoxoR Expression des CD95 Rezeptors nach Inkubation mit Doxorubicin Doxorubicin-induzierter DNA-Schaden in Nalm6 und Nalm6 DoxoR Doxorubicin-induzierte Apoptose in Nalm6 LigIV+/+, Nalm6 LigIV+/- und Nalm6 LigIV-/ Doxorubicin-induzierte Apoptose in Nalm6 LigIV+/+, Nalm6 LigIV+/- und Nalm6 LigIV-/ Doxorubicin-induzierte Aktivierung der Caspasen in Nalm6 LigIV+/+, Nalm6 LigIV+/- und Nalm6 LigIV-/ Unterschiede in der Expression der Apoptosemodulatoren der Bcl-2 Familie in Nalm6 LigIV+/+, Nalm6 LigIV+/- und Nalm6 LigIV-/- nach Inkubation mit Doxorubicin Doxorubicin-induzierter DNA-Schaden in Nalm6 LigIV+/+, Nalm6 LigIV+/- und Nalm6 LigIV-/ Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis 70 Danksagung 84 Lebenslauf 85 2

5 Abkürzungsverzeichnis Abb Abbildung Ad zu, hinzu ADP Adenosindiphosphat AIF Apoptosis-inducing factor ALL Akute lymphatische Leukämie Apaf-1 Apoptosis protease activating factor 1 APO-1 Synonym für CD95, Fas Aqua dest Destilliertes Wasser ATM Ataxia teleangiectasia Gen ATP Adenosintrisphosphat ATR ATM related Bad Bcl-2 agonist of cell death Bak Bcl-2 agonist/killer Bax Bcl-2 assoziiertes x-protein Bcl-2 B-cell-lymphoma-protein Bcl-x L B-cell-lymphoma extra long Bcl-x S B-cell-lymphoma extra short BH Bcl-homolog BER Base Excision Repair Bid BH3 interacting DD agonist Bim Bcl-2 interacting mediator of cell death BSA Bovine serum albumin, fraction V C Celsius ca. circa CAD Caspase activated DNase CD Cluster of Differentiation (Oberflächenmarker) CD4+ CD4 positiv CD8+ CD8 positiv CD95L CD95 Ligand CD95R CD95 Rezeptor 3

6 CED-3 cell-death-abnormal-3 C. elegans Caenorhabditis elegans CHK2 check-point-homologe Cl - Chlor-Anion CO 2 Kohlendioxid Cu + Einwertige Kupferionen Cu 2+ DD DDIA DDT DISC DIL DIL-R DMSO DNA-PK DNA-PK cs DSB Doxo DoxoR DTT zweiwertige Kupferionen Death Domain DNA Damage induced apoptosis / DNA Schaden induzierte Apoptose Dichlorphenyltrichlorethan Death inducing signaling complex Death inducing ligand Death inducing ligand receptor Dimethylsulfoxid DNA-Phosphokinase DNA-Phosphokinase Untereinheit Doppelstrangbruch Doxorubicin Doxorubicin resistent DL-Dithiothreitol E2F-1 E2F-Transkriptionsfaktor 1 ECL Enhanced Chemoluminiscene EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme linked immunosorbent assay EtOH Ethanol FACS Fluorescence activated cell sorting FADD Fas associated death domain Fas Synonym für CD95, APO-1 FCS fetal calf serum = fötales Kälberserum FLIP Flice inhibitory protein FLICE FADD like ICE FSC Forward scatter g Gravitationskraft 4

7 g Gramm G 0 Zellzyklusphase 0 G 1 Zellzyklusphase, Wachstumsphase 1 G 2 Zellzyklusphase, Wachstumsphase 2 h Stunde H1.2 Histon 1.2 H 2 O Wasser HCl Salzsäure HCl konz HEPES HR IAP ICAD ICE IL-1ß kd Ku70 Ku80 LigIV LigIV +/+ LigIV +/- LigIV -/- LMP l m M M ma mg mg/ml MGMT mm MMR konzentrierte Salzsäure N-2-Hydroxyethylpiperazin-N2-ethansulfonsäure Homologe Rekombination Inhibitory apoptosis protein Inhibitor of Caspase activated DNAse Interleukin-converting enzyme Interleukin-1ß KiloDalton Untereinheit des NHEJ Reparaturkomplexes Untereinheit des NHEJ Reparaturkomplexes Ligase IV für Ligase IV doppelt positiv für Ligase IV einfach positiv für Ligase IV negativ Low melting point Liter Mouse Molar Mitose des Zellzyklus Milliampere Milligramm Milligramm pro Milliliter O 6 -Methylguanin-DNA-Methyltransferase Millimolar Mismatch Repair 5

8 min Minuten ml Milliliter MRN MRE-Rad50-Nbs-Komplex ms MilliSievert µg Mikrogramm µg/ml Mikrogramm pro Milliliter µl Mikroliter mm Millimolar MMR Mismatch Repair Mre11 Untereinheit des MRN-Komplexes N Normal Na + Natriumionen NaCl Natriumchlorid NaOH Natronlauge Nbs Nijmegen breakage syndrom protein NER Nucleotide Excision Repair NGF Nerve Growth Factor NHEJ Non Homolges End Joining nm Nanometer O 2 - OH p Superoxidanionen Hydroxylradikale Protein p21 Protein 21 p53 Protein 53 PARP Poly(ADP-Ribose)Polymerase PBS phosphate buffer saline PCR Polymerase-Kettenreaktion ph pondus Hydrogenii PI3K Phosphoinositol-3-Kinase PMSF Phenylmethylsulfonyl-Fluoride PUMA p53 upregulated modulator of apoptosis r Rabbit Rad50 Untereinheit des MRN-Komplexes 6

9 ROS Reactive oxygen species rpm rotations per minute = Umdrehungen pro Minute RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur S-Phase Synthese Phase des Zellzyklus SDS Sodiumdodecylsulfat SMAC Second Mitochondria-derived activator of Caspases SPI Small peptide inhibitors Spezif. spezifisch SSC Side scatter t(14;18) Translokation innerhalb eines Chromosoms tbid Truncated Bid TNF Tumor Necrosis Factor Trail TNF related Apoptosis-inducing complex U Unit UV Ultra Violet V Volt Vol Volumen V(D)J Gensegmente für Immunglobulinlocus x mal XIAP X-linked Inhibitory of apoptosis proteins XRCC4 X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 4 7

10 1. Einleitung 1.1. Apoptose natürlicher oder programmierter Zelltod Bedeutung der Apoptose Die Apoptose oder der programmierte Zelltod ist ein physiologischer Prozess, der in vielzelligen Organismen durch die planmäßige und kontrollierte Entfernung von Zellen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und der Regulation der Gewebshömöostase spielt. Dabei sind Fehlregulationen dieses Prozesses in die Entstehung einer Vielzahl von Krankheiten involviert, die von malignen Entartungen oder Autoimmunerkrankungen bis zu neurodegenerativen Erkankungen reichen (Thompson 1995). Erstmals unterschieden wurde die Apoptose als programmierter Zelltod von der Nekrose 1972 von Kerr, Wyllie und Currie (Kerr 1972). Dabei weisen diese beiden Formen des Zelltodes sowohl morphologische, als auch biochemische Unterschiede auf (Ito und Otsuki 1998). Im Gegensatz zur Nekrose, bei der es über Zellschwellung und Membranschädigungen zur Freisetzung von intrazellulären Komponenten und damit zur Entzündung auch des umliegenden Gewebes kommt, bleibt bei der Apoptose die Membranintegrität letztlich erhalten und eine Entzündungsreaktion bleibt aus. Es kommt dabei morphologisch zu einer Schrumpfung der Zelle mit Ausstülpung der Zellmembran und Bildung charakteristischer apoptotischer Bläschen (apoptotischer Körperchen), den so genannten apoptotic bodies. Intrazellulär kommt es zur Auflösung der Kernmembran mit Kondensation und anschließender Fragmentierung des Chromatins (Wyllie et al. 1984). Durch spezielle Endonukleasen wird die DNA in Fragmente von 180 Basenpaaren oder Vielfachen davon zerlegt (Sellins und Cohen 1987). Auf molekularer Ebene ist in die Induktion, Transduktion und Ausführung der Apoptose und ihrer Signalwege eine Vielzahl von Molekülen, Enzymen und Regulatorproteinen involviert. Dabei trugen genetische Studien an der Nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) wesentlich zur Aufklärung molekularer Signalwege der Apoptose, deren Regulation und der darin involvierten Proteine bei. Dabei konnten verschiedene Gene identifiziert werden, die für diese für die Apoptoseregulation 8

11 essentiellen Proteine codieren (Yuan et al. 1993, Hengarnter und Horvitz 1994, Zou et al. 1997, Chang und Yang 2000). So wurden auch die entsprechenden homologen Gene in Säugetieren beschrieben. Diese können dabei in Regulatoren, welche pro- oder auch antiapoptotische Funktionen einnehmen, in Initiatoren, welche die Signalwege in Gang setzen, Adaptoren, die zwischen den beiden Erstgenannten vermitteln und Effektoren, welche für die Ausführung der Apoptose verantwortlich sind, eingeteilt werden (Fan et al. 2005). Die Stimuli, die zur Auslösung der Apoptose einer Zelle führen, sind zahlreich und vielfältig. So kommt es unter anderem durch Entzug von Wachstumsfaktoren (Williams et al. 1990), Stimulation bestimmter Oberflächenrezeptoren oder auch Verlust der zellulären Integrität zur Auslösung der Apoptose. Die Signalwege können aber auch durch Behandlung der Zellen mit Glucocorticoiden (Cohen und Duke 1984), Bestrahlung, vor allem gamma-strahlung (Sellins und Cohen 1987) und Zytostatika, wie Doxorubicin, Etoposid, Methotrexat oder auch Cisplatin (Friesen et al. 1996, Friesen et al. 1999, Fulda et al. 1997) aktiviert werden Apoptosesignalwege: Vom Todessignal zum Zelluntergang Unter all den verschiedenen Molekülen, die in die Apoptosesignalwege involviert sind, nehmen die Caspasen eine essentielle und zentrale Rolle ein (Launay et al. 2005). Caspasen sind den CED-3 Genen von C. elegans homolog, die dort als entscheidende Gene für den Zelltod durch Apoptose identifiziert wurden. Prinzipiell gibt es zwei Wege, die zur Aktivierung der Caspasen führen: auf der einen Seite ist dies der Ligand-Rezeptor-vermittelte extrinsische Signalweg, auf der anderen Seite der intrinsische Signalweg über die Mitochondrien Die Caspasen Bisher sind 14 Caspasen bekannt, die alle Aspartat-spezifische Cystein-Proteasen sind. Sie stellen Homologe der CED-3 Genprodukte von C. elegans dar, welche bei dieser Nematode essentiell für den Zelltod durch Apoptose sind. Zudem weisen sie große Ähnlichkeit mit den Interleukin-1ß converting Enzymen (ICE) auf, die den Entzündungsfaktor IL-1ß aktivieren, deshalb werden sie häufig auch als ICE-artige Proteasen bezeichnet (Fan et al. 2005). Ihre Vorläufer sind Procaspasen und werden als inaktive Vorstufen (30 50 kd) synthetisiert. Werden sie durch proteolytische Spaltung 9

12 aktiviert, formen sie Heterodimere mit einer katalytischen Einheit, bestehend aus einer kleinen und großen Untereinheit, die sich dann zu Heterotetrameren mit enzymatischer Aktivität, bestehend aus nun zwei katalytischen Einheiten, zusammenlagern (Launey et al. 2005). Das aktive Zentrum bildet eine cysteinreiche Domäne, wobei die Caspasen ihre Substrate sehr spezifisch hinter einem Aspartatrest spalten. So erhielten sie auch ihren gemeinsamen Familiennamen Caspasen von cysteine aspartases. Aufgrund ihrer gemeinsamen Aminosäuresequenzen können die Caspasen in drei Unterfamilien, die Initiatorcaspasen, die Effektorcaspasen und Entzündungsmediatoren, eingeteilt werden (Fan et al. 2005): Caspase 2, 8, 9 und 10 führen zur Apoptoseinduktion (Initiatorcaspasen) Caspase 3, 6 und 7 führen die Apoptose aus (Effektorcaspasen) Caspase 8 Caspase 8 wird einerseits über Aktivierung des CD95 Rezeptors und folgende Bildung des Death Inducing Signaling Complex (DISC) aktiviert (Fan et al. 2005). Anderseits kann die Aktivierung der Caspase 8 auch über intrinsische Signalwege durch das Mitochondrium erfolgen (Scaffidi et al. 1998). Caspase 8 führt seinerseits zum einen zur proteolytischen Aktivierung der Effektorcaspasen 3, 6 und 7, und zum anderen überführt es Bid in seine aktive Form tbid, welches in die mitochondrialen Apoptosesignalwege involviert ist. Caspase 2 und Caspase 10 Die Aktivierung des Apoptosesignalweges durch Caspase 10 verläuft über die Aktivierung des CD95 Rezeptors und nicht über die Mitochondrien, dies gilt vor allem für lymphoide Zellen (Wang et al. 2001). Caspase 2 nimmt ebenfalls die Funktion einer Initiatorcaspase ein und scheint unabhängig von Cytochrom C und Apaf-1 in einem Proteinkomplex aktiviert zu werden, um dann unter anderem durch Aktivierung von Bid über die mitochondrialen Signalwege Apoptose zu induzieren (Read et al. 2002). Caspase 9 Die Aktivierung der Caspase 9 erfolgt über den intrinsischen, mitochondrialen Signalweg, wobei es durch Freisetzung von Cytochrom C aus dem Mitochondrium zur Bildung des Apoptosoms, bestehend aus Cytochrom C, Apoptosis protease activating 10

13 factor 1 (Apaf-1) und Procaspase 9, und somit zur Aktivierung der Caspase 9 kommt (Li et al. 1997, Acehan et al. 2002). Caspase 3, Caspase 6 und Caspase 7 Caspase 3, die eine zentrale Rolle bei der Ausführung des programmierten Zelltodes spielt, ist die aktive Form der Procaspase 3. Die Aktivierung kann dabei durch Caspasen, wie Caspase 8 und 9 oder durch Caspase 3 selbst, aber auch durch andere Moleküle, wie Granzyme B, erfolgen. Ebenso erfolgt die Aktivierung der anderen beiden Effektorcaspasen Caspase 6 und Caspase 7 aus den jeweiligen Procaspasen auf ähnlichem Wege (Fan et al. 2005). Am Ende der Caspasenkaskade steht die proteolytische Spaltung verschiedener Substrate durch die aktivierten Caspasen. Eines der Substrate der Effektorcaspasen ist die Poly(ADP-Ribose)Polymerase (PARP), durch deren Spaltung es schließlich zum Tod der Zellen durch Apoptose kommt (Nagata 2000, Fan et al. 2005). Ein weiteres Substrat ist die Caspase-activated Desoxyribonuclease (CAD), sie spielt als Endonuklease bei der Degradation der DNA eine entscheidende Rolle. CAD liegt im Nucleus an ihren spezifischen Inhibitor (ICAD) inaktiviert gebunden vor. Bei der Apoptose kommt es zur Translokation der Caspase 3 in den Nukleus und dort zu einer Spaltung von ICAD, wodurch die Endonuklease CAD frei und aktiviert wird (Fan et al. 2005) Rezeptor vermittelte Aktivierung der Caspasen: Extrinsischer Weg In vielen Zellen kann durch Bindung von Liganden an ihre extrazellulären Rezeptoren Apoptose induziert werden (Krammer 1999, Nagata 1997, Nagata und Golstein 1995). Diese Liganden und Rezeptoren gehören der Tumor-Nekrose-Faktor und Nervenwachstumsfaktor (TNF/NGF-Familie) an (Suda et al. 1993, Nagata und Golstein 1995). Dies sind unter anderem der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-1 und -2 (TNF- R1, TNF-R2), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Trail und der CD95-Rezeptor (CD95R/APO-1/Fas). Das CD95 (APO-1/Fas)-System spielt eine große Rolle bei der Induktion von Apoptose. Der CD95-Rezeptor ist ein 48kD großes Typ I Membranprotein mit drei cysteinreichen extrazellulären Domänen, bestehend aus je 155 Aminosäuren, einer Transmembranregion aus 19 Aminosäuren und einem zytoplasmatischen,

14 Aminosäuren umfassenden Anteil. Er findet sich auf zahlreichen Zelllinien und Geweben, so zum Beispiel auch auf Tumorzellen (Debatin et al. 1993). CD95-Ligand ist ein Typ-II Transmembranprotein und kann durch proteolytische Spaltung von der Zelloberfläche als lösliches Molekül freigesetzt werden. So folgt auf die Bindung des CD95 Liganden die Trimerisierung des CD95 Rezeptors (Fas/APO-1), diese ist notwendig, um Apoptose auszulösen. Dies führt ebenfalls zur Bildung eines Komplexes der intrazellulären Todesdomänen death domains (DD) des Rezeptors mit anschließender Bindung des Adaptermoleküls Fas associated death domain (FADD) mit seiner eigenen Todesdomäne an die trimerisierten Todesdomänen des CD95-Rezeptors. Es kommt zur Aggregation von FADD und damit zur Exposition einer weiteren Todesdomäne (Death effector Domain), die ihrerseits mit der N- terminalen Todesdomäne der Procaspase 8 interagiert, was zur Oligomerisierung von Procaspase 8 an der Innenseite der Zellmembran führt. In diesem so entstandenen Komplex Death inducing signal complex (DISC) wird die Procaspase 8 durch Autoaktivierung zur Caspase 8 aktiviert. Das C-terminale Ende von Caspase 8 hat Ähnlichkeit mit Proteinen der ICE-Proteasen Familie, insbesondere mit Mitgliedern der Caspase-3 (CPP32) Subfamilie. Caspase 8 kann nun direkt durch Proteolyse weitere Caspasen, z.b. Caspase 3, aktivieren oder durch Aktivierung von Bid den intrinsischen Signalweg über die Mitochondrien initieren (Wang et al. 2005, Arnoult et al. 2003, Lu et al 2003). Dabei haben sowohl die Art der Zelle als auch der apoptose-induzierende Stimulus Einfluss darauf, ob Caspase 8 direkt Caspase 3 aktivieren kann oder die Aktivierung der Caspasen über den intrinsischen Weg des Mitochondriums erfolgt (Fulda et al. 2001, Scaffidi et al. 1998) Mitochondrien vermittelte Aktivierung der Caspasen: Intrinsischer Weg Bei zellulärem Stress kommt es im Zytosol zur Freisetzung verschiedener proapoptotischer Proteine, welche die Mitochondrienmembran durchlässig für apoptoseinduzierende Moleküle machen (siehe ) (Mohamad et al. 2005). Bisher sind 5 dieser Moleküle bekannt, die aus dem intermembranösen Raum des Mitochondriums ins Zytosol gelangen. Dies sind Cytochrom C, AIF, SMAC, Omi/HtrA2 und Endonuclease G. 12

15 1. Cytochrom C Durch Cytochrom C wird die Bildung des so genannten Apoptosoms induziert, ein Komplex bestehend aus Cytochrom C, Apoptosis protease activating factor 1 (Apaf-1) und der Procaspase 9. Dieses Apoptosom setzt über Autoaktivierung der Caspase 9 die Caspasenkaskade mit Aktivierung der Caspasen 3 und 7 in Gang (Li et al. 1997, Acehan et al. 2002). 2. AIF (Apoptosis inducing factor) AIF transloziert zum Nukleus und induziert dort eine Chromatinkondensation der DNA und deren Fragmentation über Aktivierung ICE-artiger Proteasen, dies geschieht Caspasen-unabhängig (Susin et al. 1999, Susin et al. 2000, Cande et al. 2002). 3. SMAC (second mitochondrial activator of caspases) SMAC bindet Inhibitor of apoptosis proteins (IAPs), welche ihrerseits die Caspasen 3 und 9 hemmen. Damit antagonisiert SMAC die antiapoptotische Wirkung der IAPs (Wu et al. 2000) Regulatoren der Apoptose: Bcl-2-Familie und IAPs 1. IAPs (Inhibitors of Apoptotic Proteins ) Diese Moleküle inhibieren die Caspasen, in dem sie an diese binden und deren katalytische Einheit blockieren. Hierzu gehört zum Beispiel das X-linked inhibitor-ofapoptosis protein (XIAP), welches Caspase 9 und auch Caspase 3 inhibiert (Deveraux et al. 1999). Die IAPs werden, wie oben beschrieben, ihrerseits durch mitochondriale, proapoptitische Moleküle wie SMAC inhibiert (Wu et al. 2000) 2. FLIPs (FLICE Inhibiting Proteins) Diese Proteine inhibieren die Rezeptor-vermittelte Apoptose, indem sie direkt die Rekrutierung der Caspase 8 (FLICE) in den CD95-FADD-Komplex durch Bindung an diesen Komplex verhindern (Irmler et al. 1997). 3. Bcl-2 Familie Die Vertreter dieser Familie nehmen sowohl als proapoptotische Proteine, wie Bax, Bak und Bcl-x s, als auch als antiapoptotische Proteine, wie Bcl-2 und Bcl-x L Einfluss auf die Apoptosesignalwege (Mohamad et al. 2005). Sie zeichnen sich alle durch konservierte, dem Bcl-2 homologe Domänen (BH1, BH2, BH3 und BH4) aus und bilden mit Bcl-2 13

16 Heterodimere. Je nach Anteilen von BH1, BH2, BH3 und BH4 können diese Proteine in 3 Gruppen eingeteilt werden: Antiapoptotische Mitglieder, die aus allen 4 Domänen bestehen: Bcl-2 und Bcl-x L, diese sind in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert (Reed 2006). Proapoptotische Mitglieder bestehend aus den Domänen BH1, BH2 und BH3: Bax und Bak finden sich ebenfalls in der äußeren Mitochondrienmembran, zudem sind sie im Zytosol lokalisiert. Proapoptotische Mitglieder, die nur die BH3 Domäne aufweisen: Bid, Bad und Bim. Sie liegen im Zytosol vor und können mit ihrer BH3 Domäne mit den anderen Mitgliedern der Bcl-2 Familie interagieren (Puthalakath und Strasser 2002). Der erste proapoptotische Vertreter dieser Familie, Bcl-2 Antagonist X (Bax) wurde 1993 von Oltvai et al. beschrieben (Oltvai et al. 1993). Dabei liegt Bax vor allem inaktiviert im Zytosol der Zelle vor. Durch bestimmte Todessignale kommt es zur Dimerisierung des Moleküls und Translokation in die äußere Mitochondrienmembran, woraufhin Cytochrom C aus dem intermembranösen Raum des Mitochondriums ins Zytosol gelangt. Hier bildet es mit Apaf-1 und der Procaspase 9 gemeinsam das Apoptosom, welches die Caspase 9 und folgend die Caspasenkaskade aktiviert (Li et al. 1997). Bax selbst unterliegt dabei ebenfalls regulatorischen Einflüssen, es kann sowohl durch Mitglieder der Bcl-2 Familie, wie Bid, aktiviert werden, andereseits durch Bcl-2 oder Bcl-x L gehemmt werden. Dabei scheint vor allem das Verhältnis von Bax zu Bcl-2 entscheidenden Einfluss auf die Regulation der Apoptose zu nehmen (Reed 2006). 14

17 CD95L FADD Procaspase 8 / 10 FLIP Bcl-2 Bcl-x L Bid Bak Bax t-bid Caspase 8 / 10 SMAC/Omi/HtrA2 IAPs Cyt C Caspase 3 / 6 / 7 Caspase 9 Apaf-1 AIF/Endonuclease G Caspase 8 PARP ICAD CAD Abb1 Apoptosesignalwege Dargestellt ist zum einen der ligandenvermittelte Signalweg über Bindung des DIL (Death-inducingLigand) mit folgender Aktivierung der Caspasen 8 und 10 und der Effektorcaspasen Caspase 3, 6 und 7 welche die verschiedenen Substrate spalten, wodurch es zur Apoptose kommt. Auf der anderen Seite steht der intrinsische Signalweg über die mitochondriale Ausschüttung der proapoptotischen Moleküle Cytochrom C, SMAC, Omi/HtrA2, AIF und Endonuclease G. Diese Ausschüttung wird durch die pro- und antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2 Familie reguliert. Hier kommt es zur Bildung des Apoptosoms bestehend aus Cytochrom C, Apaf-1 und Caspase-9 und zur Aktivierung der Caspase 8, das wiederum zu einer Aktivierung der Caspase-3 mit anschließender Substratspaltung führt. (FADD: Fas associated death domain; FLIP: FLICE inhibitory protein; SMAC: Second Mitochondriaderived activator of Caspases; Omi/HtrA2: Inhibitoren von IAPs; IAPs: Inhibitory apoptosis proteins; Cyt C: Cytochrom C, Apaf-1: Apoptosis protease activating factor 1; AIF: Apoptosis-inducing factor; PARP: Poly(ADP-Ribose)Polymerase; CAD: Caspase activated DNAse; ICAD: Inhibitor of CAD; Bcl-2, Bcl-xL, Bak, Bax, Bid, tbid: Mitglieder der Bcl-2 Familie) 15

18 1.2. DNA-Damage und DNA-Reparatur Das menschliche Genom besteht aus 3 Billionen Basenpaaren, die für Gene codieren. Es ist der fortwährenden Attacke schädigender Noxen ausgesetzt, die sowohl von intrazellulär, z.b. in Form von Radikalen als auch von extrazellulär, wie durch Strahlung und Zytostatika, die Integrität und Stabilität der DNA gefährden Radikale Intrazellulär spielen vor allem endogen gebildete Radikale bei der Induktion von DNA- Schäden eine wichtige Rolle. Die Schädigung durch Radikale ist ein Prozess, der beispielsweise durch entzündliche Vorgänge oder auch metabolischen Stress der Zelle hervorgerufen werden kann. Hierbei können vermehrt hochreaktive Radikale in der Zelle entstehen, die mit den verschiedensten Molekülen der DNA interagieren und deren Struktur verändern (Pouget und Mather 2001). Innerhalb der Gruppe der Radikale sind vor allem die reactive oxygen species (ROS) von Bedeutung. Dazu gehören unter anderem Superoxidanionen (O - 2 ) oder auch Hydroxylradikale ( OH). Diese Teilchen entstehen in der Atmungskette in den Mitochondrien. Metabolischer Stress oder auch die Einwirkung von Zytostatika auf die Zelle kann zu einer erhöhten Konzentration dieser Radikale führen (Pouget und Mather 2001). Die Radikale sind in der Lage sehr unterschiedliche Arten des DNA-Schadens hervorzurufen, dazu gehören Modifikationen von Basen und Zuckern, Basenverluste oder auch Strangbrüche. Die Zahl der so entstandenen Schäden wird auf pro Zelle pro Tag geschätzt (Beckman and Ames 1997). Um die Konzentration dieser Radikale auf einem möglichst niedrigen Niveau zu halten, stehen der Zelle verschiedene Enzymsysteme zur Verfügung, wie die Superoxiddismutase, die Katalase oder auch Glutathionoperoxidase (Pouget und Mather 2001) Zytostatika und Strahlung Gamma-Strahlung, UV-Strahlung oder auch Zytostatika wie Doxorubicin, Etoposid, Cisplatin oder Cyclophosphamid führen zum Teil auch indirekt über die Induktion von Radikalbildung zur Schädigung der DNA, hauptsächlich kommt es aber durch direkte 16

19 Interaktion der Noxen mit der DNA selbst zu DNA-Schäden (Kaina 2003, Roos und Kaina 2006). Doxorubicin gehört zu den Zytostatika vom Typ der Anthrazyklin-Antitumor- Antibiotika, welche aus verschiedenen Spezies von Streptomyces gewonnen werden. Die durch Doxorubicin entstehenden DNA-Schäden kommen auf verschiedenen Wegen zustande. Zum einen interkaliert Doxorubicin in die DNA zwischen benachbarte Basen und verändert dadurch die helikale Struktur, was eine Funktionsbeeinträchtigung DNAbindender Enzyme zur Folge hat (Di Marco et al. 1984). So kommt es zur Hemmung der Topoisomerase II und damit zur Entstehung von DNA-Doppelstrangbrüchen (Hortobagyi 1997). Zum anderen führt Doxorubicin auch zur Bildung freier Radikale, die ihrerseits wiederum DNA-Doppelstrangbrüche verursachen können. Dabei können diese Radikale sowohl durch die Reduktion des Doxorubicins durch die Cytochrom P450-Reduktase, als auch durch Oxidation von Doxorubicin entstehen (Mizutani et al. 2003) Schäden der Doppelhelix Abhängig von verschiedensten Faktoren, wie zum Beispiel der Art der schädigenden Noxe, kann die Doppelhelix an unterschiedlichen Stellen Schaden nehmen. Dies sind unter anderem (Christmann et al. 2003): - Einzel- und Doppelstrangbrüche - Schädigung oder Verlust von Basen - DNA-Protein-Verbindungen - Thymidin-Dimere DNA - Reparaturmechanismen Wie beschrieben ist die Schädigung der DNA ein ubiquitär vorkommendes Ereignis, dabei spielt aber gerade die Intaktheit unseres Erbgutes eine der wichtigsten Rollen. So ist eine effektive Reparaturmaschinerie für das Überleben und Funktionieren jeder Zelle und damit jedes Organismus von eminenter Bedeutung. Bisher wurden 130 Gene identifiziert, die mit der Kontrolle und Reparatur der DNA assoziiert sind (Kaina et al. 2003, Christmann et al. 2003). 17

20 Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen DNA-Doppelstrangbrüche können chromosomale Aberrationen hervorrufen oder den Zelltod verursachen (Dikomey et al. 1998, Lips and Kaina 2001, Pfeiffer et al. 2000). In einer eukaryonten Zelle kann bereits ein einziger nicht reparierter Doppelstrangbruch eines entscheidenden Gens den Tod der Zelle durch Apoptose induzieren (Rich et al. 2000). Wenn die Schädigung nicht vor Eintritt der Zelle in die S-Phase des Zellzyklus behoben wird, kann dies zur fehlerhaften Bildung der Tochterchromatide führen und somit schwerwiegenden Auswirkungen haben. Für die Reparatur von Doppelstrangbrüchen sind bisher zwei Mechanismen bekannt, zum einen die Homologe Rekombination (HR) und zum anderen das Non Homologous End Joining (NHEJ). Das Non Homologe End Joining stellt bei eukaryonten Zellen den entscheidenden Reparaturmechansimus in sich mitotisch teilenden Zellen dar, um mögliche Chromosomentranslokationen, -deletionen und Geneamplifikationen zu verhindern, wohingegen in Hefen die Homologe Rekombination dominiert (Christmann et al. 2003, Cromie et al. 2001, Haber 2000). Non Homologous End Joining (NHEJ) Das NHEJ findet hauptsächlich in der G 0 /G 1 Phase des Zellzyklus statt (Johnson and Jasin 2000, Takata et al. 1998). Durch diesen Vorgang können DNA-Enden wieder miteinander verbunden werden, ohne dabei eine homologe Sequenz zu benötigen (Critchlow und Jackson 1998). Das NHEJ spielt sowohl bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen als auch bei der V(D)J-Rekombination zur Generierung verschiedener Antikörper eine entscheidende Rolle (Smider und Chu 1997). Der erste Schritt besteht in der Bindung eines heterodimeren Komplexes an die geschädigte DNA. Dieser Komplex besteht aus den Proteinen Ku70 (Reeves and Sthoeger 1989) und Ku80 (Jeggo et al. 1992) und verhindert einen Abbau der DNA durch Exonukleasen. An diesen DNA-Protein-Komplex erfolgt nun die Anlagerung der katalytischen Einheit der DNA-PK, die DNA-PK cs (Sipley et al. 1995, Hartley et al. 1995). Die DNA-PK cs gehört zur Familie der Phosphatidyl-Inositol-3-Kinasen (PI3K), viele dieser Kinasen haben entscheidende Funktionen in der Erkennung und Beseitigung von DNA-Schäden, wie beispielsweise ATM oder ATR (Durocher und Jackson 2001). 18

21 Letztlich wird dieser neue Komplex, bestehend aus Ku70, Ku80 und DNA-PK cs als DNA-PK bezeichnet (Gottlieb und Jackson 1993, Smith und Jackson 1999). Dabei handelt es sich um eine Serin/Threonin-Kinase, die durch die Bindung an die DNA- Enden aktiviert wird. Hierfür ist die Lokalisation von DNA-PK cs direkt an die DNA essentiell, um dies zu ermöglichen disloziert Ku in die DNA und übt dort eine stabilisierende Funktion aus (Yoo und Dynan 1999). Die Aktivierung der DNA-PK cs führt zum einen zu einer Annäherung der beiden DNA- Enden und zum anderen zur Phosphorylierung mehrerer Proteine, die für weitere Schritte von Bedeutung sind. Eines dieser Proteine ist Artemis, welches in die Vorbereitung der DNA-Enden für die folgende Verknüpfung involviert zu sein scheint, indem es als Endonuclease überschüssige DNA-Einzelstränge oder Hairpins entfernt. (Ma et al. 2002). Ebenso wird der Rad50-Mre11-Nbs1-Komplex aktiviert, der multimerisiert und durch seine Aktivitäten als Exonuklease, Endonuklease und Helicase die DNA-Enden prozessiert und die End-zu-End-Verbindung zusammen mit Ku stabilisiert (De Jager et al. 2001, McElhinny et al. 2000, Walker et al. 2001). Dies ist Voraussetzung für die abschließende Verknüpfung der DNA-Enden durch den XRCC4 - Ligase IV Komplex, welcher ebenfalls durch Phosphorylation aktiviert wird (Leber et al. 1998). XRCC4 spielt dabei in Säugetierzellen eine große Rolle. Homologe Rekombination (HR) In Hefen dominiert die Homologe Rekombination und auch in höheren eukaryonten Zellen nimmt die Homologe Rekombination bei der Reparatur von DNA- Doppelstrangbrüchen während der Meiose eine entscheidende Rolle ein Für die Homologe Rekombination wird eine, der geschädigten DNA homologe Sequenz benötigt, die als Schablone für die Reparatur dient (Christmann et al. 2003). 19

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